本發明涉及發酵飲料技術領域，具體的說是一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料及其制備方法。
背景技術：
益生菌是定植于動物的腸道系統內，能夠對寄主產生確切的作用，能夠促進益于寄主健康的菌群的生長繁殖、抑制致病菌、平衡腸道菌群、促進人類健康，在食品中益生菌主要用于發酵乳制品的生產，但它也正逐步被用于開發各種功能食品，如果汁、糖果、冰棋淋、冷凍酸奶等。到目前為止，科學家發現的益生菌大體上可以分為三大類：包括乳桿菌類、雙歧桿菌類及革蘭氏陽性球菌。
凝結芽孢桿菌，屬于芽孢桿菌屬，兩端鈍圓，革蘭氏陽性菌。該菌株能夠產生l-乳酸，屬于同型乳酸發酵；能產生大量的代謝產物，如l-乳酸、凝固素，從而有效地調整腸道菌群的結構，增加腸道細菌的數量。因此，近年來在益生菌研究領域屬于熱點研究內容。凝結芽孢桿菌除具有和乳酸菌及雙歧桿菌同樣的保健功效外，還具有耐酸、耐熱、耐鹽、容易培養和保存的特點。2013年，凝結芽孢桿菌正式錄入《中國飼料添加劑品種名錄》，2016年，國家衛生計生委將凝結芽孢桿菌正式列入《可用于食品的菌種名單》。
南瓜，營養豐富且全面，含有果膠、戊聚糖、甘露醇、腺嘌呤、膳食纖維、纖維素、蛋白質、多種氨基酸、脂肪等成分。在三大產熱營養素中，南瓜以碳水化合物為主，脂肪含量很低，為很好的低脂肪食品。同時，南瓜中還含有能夠促進胰臟分泌胰島素的環丙基氨基酸，能夠增加葡萄糖轉運體含量，防治糖尿病。南瓜中的微量礦物質對糖尿病和血脂代謝有一定的調節作用?，F階段，南瓜的深加工產品主要為南瓜粉、南瓜醬、南瓜果脯等，本發明為南瓜的深加工開辟了一條新途徑。
技術實現要素：
本發明提供了一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料及其制備方法，將新列入可食用菌種名單的凝結芽孢桿菌作為發酵菌株發酵南瓜汁，在適宜比例的基礎上，優化發酵工藝，所得到的常溫活菌飲料既保持了南瓜本身特有的香氣，還具有濃郁的發酵香氣，酸甜適中、風味獨特。
本發明為解決上述技術問題采用的技術方案為：一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料，該常溫活菌飲料由南瓜漿經果膠酶、纖維素酶和糖化酶酶解后與凝結芽孢桿菌混合發酵并加入調味劑調和而成；其中，每100重量份的南瓜塊原料中，加入的果膠酶、纖維素酶、糖化酶和調味劑的重量份數依次為：果膠酶0.18-0.5份，纖維素酶0.5-1.8份，糖化酶0.25-1.5份，調味劑4.75-7.25份。
作為一種優選方案，所述調味劑由以下重量份數的原料組成：蔗糖4-6份、檸檬酸0.4-0.6份、檸檬酸鈉0.3-0.5份和黃原膠0.05-0.15份。
作為一種優選方案，所述凝結芽孢桿菌為凝結芽孢桿菌bc361。
作為一種優選方案，所述的南瓜漿由南瓜塊原料煮熟后加水打漿而成，其中，打漿時，南瓜塊原料與水的重量比為1：1-5。
作為一種優選方案，所述果膠酶的酶活力單位為1萬-4萬u/g，纖維素酶的酶活力單位為2萬-6萬u/g，糖化酶的酶活力單位是5萬-10萬u/g。
制備如上所述的一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料的方法，包括以下步驟：
步驟一、南瓜漿的制備
選擇無病蟲危害腐蝕的成熟南瓜，用水清洗干凈后，切去表皮、去籽瓤，然后切成0.5-2cm厚的片狀作為南瓜塊原料；將南瓜塊原料放入沸水中煮2-10min，向煮熟的南瓜塊原料中加入水倒入打漿機中打漿，再通過膠體磨細磨2-3次，得到南瓜漿；
步驟二、稱取原料
按照如上所述的重量份數分別稱取果膠酶、纖維素酶、糖化酶、凝結芽孢桿菌、調味劑以及步驟一制備的南瓜漿，備用；
步驟三、酶解
將步驟二稱取好的果膠酶，纖維素酶和糖化酶加入到步驟一制得的南瓜漿中，在35-60℃條件下酶解1-4h，得酶解后的南瓜漿，備用；
步驟四、過濾、滅菌
將步驟三酶解后的南瓜漿置于濾網中過濾得到南瓜發酵液，在100-115℃下，高溫滅菌10-30min，得滅菌后的南瓜汁；
步驟五、菌種活化
從試管斜面中挑取1-2環菌落置于ypd培養基中，在30-38℃培養16-20h，活化兩次，得到富集的凝結芽孢桿菌；
步驟六、接種發酵
將步驟四制得的滅菌后的南瓜汁作為發酵液接種，接入步驟五制得的富集的凝結芽孢桿菌，在30-38℃條件下培養12-48h，得發酵后的南瓜汁；
步驟七、調配
往步驟六制得的發酵后的南瓜汁中分別加入步驟二稱取的調味劑，經過濾、均質、灌裝，得一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料。
作為一種優選方案，步驟一所述打漿時，南瓜塊原料與水的重量比為1：1-5。
作為一種優選方案，步驟六所述凝結芽孢桿菌的接種量為步驟四制得的滅菌后的南瓜汁總重量的1-3%。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
（1）本發明提供了一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料及其制備方法，使用凝結芽孢桿菌作為發酵菌株，凝結芽孢桿菌除具有和乳酸菌及雙歧桿菌同樣的保健功效外，還具有耐酸、耐熱、耐鹽、容易培養和保存的特點；南瓜營養全面且豐富，主要為淀粉、果膠和纖維素，通過加入糖化酶、果膠酶和纖維素酶，可將南瓜中的大分子物質酶解為小分子，提高還原糖含量，同時能迅速降解南瓜果肉細胞壁的胞間層和初生壁中的果膠和纖維素、半纖維素，使得細胞壁破碎，內容物溶出；通過在酶解后的南瓜汁中接種凝結芽孢桿菌進行發酵，優化發酵工藝，制成新型益生菌常溫活菌發酵南瓜汁，工藝獨特，操作簡單，該產品營養豐富，為凝結芽孢桿菌作為可食用菌株產品的開發提供一定的參考；
（2）本發明提供了一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料及其制備方法，既保持了南瓜本身特有的香氣，還具有濃郁的發酵香氣，酸甜適中、風味協調，并且含有易于常溫保存的益生凝結芽孢桿菌，易于常溫保存；且利用本發明制備方法制備的凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料菌落總數達到5×108-1.51×109cfu/g，遠遠高于國家對活菌飲料的菌落總數的要求106cfu/g；
（3）本發明提供了一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料及其制備方法，使用凝結芽孢桿菌作為發酵菌株，經過發酵后，南瓜中的β-胡蘿卜素和維生素c等一些營養成分流失較小，營養物質得到較大程度地保留。
生物材料的保藏
本發明所述凝結芽孢桿菌bc361作為發酵菌株時，感官評價較優，且菌落總數、可滴定酸度較高，因此，作為一種優選方案，選用凝結芽孢桿菌bc361作為發酵菌株；該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為：cgmccno.9951，保藏日期為2014年11月13日。
附圖說明
圖1為候選菌株16srdna基因序列的系統發育樹。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作詳細說明，本實施例以本發明技術方案為前提，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程。
一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料，該常溫活菌飲料由南瓜漿經果膠酶、纖維素酶和糖化酶酶解后與凝結芽孢桿菌混合發酵并加入調味劑調和而成；其中，每100重量份的南瓜塊原料中，加入的果膠酶、纖維素酶、糖化酶和調味劑的重量份數依次為：果膠酶0.18-0.5份，纖維素酶0.5-1.8份，糖化酶0.25-1.5份，調味劑4.75-7.25份。
作為一種優選方案，所述調味劑由以下重量份數的原料組成：蔗糖4-6份、檸檬酸0.4-0.6份、檸檬酸鈉0.3-0.5份和黃原膠0.05-0.15份。
作為一種優選方案，所述的南瓜漿由南瓜塊原料煮熟后加水打漿而成，其中，打漿時，南瓜塊原料與水的重量比為1：1-5。
作為一種優選方案，所述凝結芽孢桿菌為凝結芽孢桿菌bc361。
作為一種優選方案，所述果膠酶的酶活力單位為1萬-4萬u/g，纖維素酶的酶活力單位為2萬-6萬u/g，糖化酶的酶活力單位是5萬-10萬u/g。
制備如上所述的一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料的方法，包括以下步驟：
步驟一、南瓜漿的制備
選擇無病蟲危害腐蝕的成熟南瓜，用水清洗干凈后，切去表皮、去籽瓤，然后切成0.5-2cm厚的片狀作為南瓜塊原料；將南瓜塊原料放入沸水中煮2-10min，作為優選的，南瓜塊原料煮至熟透為止，以破壞酶的活性，防止酶促褐變，使組織充分軟化，更利于打漿，向煮熟的南瓜塊原料中加入水倒入打漿機中打漿，作為優選的，打漿時，南瓜塊原料與水的重量比為1：1-5，再通過膠體磨細磨2-3次，得到南瓜漿；
步驟二、稱取原料
按照如上所述的重量份數分別稱取果膠酶、纖維素酶、糖化酶、凝結芽孢桿菌、調味劑以及步驟一制備的南瓜漿，備用；
步驟三、酶解
將步驟二稱取好的果膠酶，纖維素酶和糖化酶加入到步驟一制得的南瓜漿中，在35-60℃條件下酶解1-4h，使南瓜漿中的果膠質、纖維素及淀粉充分酶解，提高還原糖含量，同時能迅速降解南瓜果肉細胞壁的胞間層和初生壁中的果膠和纖維素、半纖維素，使得細胞壁破碎，內容物溶出，得酶解后的南瓜漿，備用；
步驟四、過濾、滅菌
將步驟三酶解后的南瓜漿置于濾網中過濾得到南瓜發酵液，在100-115℃下，高溫滅菌10-30min，得滅菌后的南瓜汁；
步驟五、菌種活化
從置于冰箱中冷藏，冷藏溫度為4℃的試管斜面中挑取1-2環菌落置于ypd培養基中，在30-38℃培養16-20h，活化兩次，得到富集的凝結芽孢桿菌；
步驟六、接種發酵
將步驟四制得的滅菌后的南瓜汁作為發酵液接種，接入步驟五制得的富集的凝結芽孢桿菌，在30-38℃條件下培養12-48h，得發酵后的南瓜汁，作為優選的，凝結芽孢桿菌的接種量為步驟四制得的滅菌后的南瓜汁總重量的1-3%；
步驟七、調配
往步驟六制得的發酵后的南瓜汁中分別加入步驟二稱取的調味劑，經過濾、均質、灌裝，得一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料。
實施例一
一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料，該常溫活菌飲料由南瓜漿經果膠酶、纖維素酶和糖化酶酶解后與凝結芽孢桿菌bc361混合發酵并加入調味劑調和而成，所述的南瓜漿由南瓜塊原料煮熟后加水打漿而成，所述調味劑由蔗糖、檸檬酸、檸檬酸鈉和黃原膠組成；其中，每100重量份的南瓜塊原料中，加入的果膠酶、纖維素酶、糖化酶、蔗糖、檸檬酸、檸檬酸鈉和黃原膠的重量份數依次為：果膠酶0.18份，纖維素酶0.5份，糖化酶0.25份，蔗糖4份，檸檬酸0.4份，檸檬酸鈉0.3份，黃原膠0.05份；其中，打漿時，南瓜塊原料與水的重量比為1：1，作為一種優選方案，所述果膠酶的酶活力單位為1萬-4萬u/g，纖維素酶的酶活力單位為2萬-6萬u/g，糖化酶的酶活力單位是5萬-10萬u/g。
制備如上所述的一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料的方法，包括以下步驟：
步驟一、南瓜漿的制備
選擇無病蟲危害腐蝕的成熟南瓜，用水清洗干凈后，切去表皮、去籽瓤，然后切成0.5cm厚的片狀作為南瓜塊原料；將南瓜塊原料放入沸水中煮2min，向煮熟的南瓜塊原料中加入水倒入打漿機中打漿，再通過膠體磨細磨2次，得到南瓜漿；
步驟二、稱取原料
按照如上所述的重量份數分別稱取果膠酶、纖維素酶、糖化酶、凝結芽孢桿菌bc361、蔗糖、檸檬酸、檸檬酸鈉、黃原膠以及步驟一制備的南瓜漿，備用；
步驟三、酶解
將步驟二稱取好的果膠酶，纖維素酶和糖化酶加入到步驟一制得的南瓜漿中，在35℃條件下酶解1h，得酶解后的南瓜漿，備用；
步驟四、過濾、滅菌
將步驟三酶解后的南瓜漿置于濾網中過濾得到南瓜發酵液，在100℃下，高溫滅菌10min，得滅菌后的南瓜汁；
步驟五、菌種活化
從試管斜面中挑取1環菌落置于ypd培養基中，在30℃培養16h，活化兩次，得到富集的凝結芽孢桿菌bc361；
步驟六、接種發酵
將步驟四制得的滅菌后的南瓜汁作為發酵液接種，接入步驟五制得的富集的凝結芽孢桿菌bc361，在30℃條件下培養12h，得發酵后的南瓜汁，作為優選的，凝結芽孢桿菌的接種量為步驟四制得的滅菌后的南瓜汁總重量的1%，此時產品酸度為0.27％，ph為4.10，菌落總數為5.07×108cfu/g；
步驟七、調配
往步驟六制得的發酵后的南瓜汁中分別加入步驟二稱取的蔗糖、檸檬酸、檸檬酸鈉和黃原膠，經過濾、均質、灌裝，得一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料。
實施例二
一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料，該常溫活菌飲料由南瓜漿經果膠酶、纖維素酶和糖化酶酶解后與凝結芽孢桿菌混合發酵并加入調味劑調和而成，所述的南瓜漿由南瓜塊原料煮熟后加水打漿而成，所述調味劑由蔗糖、檸檬酸、檸檬酸鈉和黃原膠組成；其中，每100重量份的南瓜塊原料中，加入的果膠酶、纖維素酶、糖化酶、蔗糖、檸檬酸、檸檬酸鈉和黃原膠的重量份數依次為：果膠酶0.5份，纖維素酶1.8份，糖化酶1.5份，蔗糖6份，檸檬酸0.6份，檸檬酸鈉0.5份，黃原膠0.15份；其中，打漿時，南瓜塊原料與水的重量比為1：5，作為一種優選方案，所述果膠酶的酶活力單位為1萬-4萬u/g，纖維素酶的酶活力單位為2萬-6萬u/g，糖化酶的酶活力單位是5萬-10萬u/g。
制備如上所述的一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料的方法，包括以下步驟：
步驟一、南瓜漿的制備
選擇無病蟲危害腐蝕的成熟南瓜，用水清洗干凈后，切去表皮、去籽瓤，然后切成2cm厚的片狀作為南瓜塊原料；將南瓜塊原料放入沸水中煮10min，向煮熟的南瓜塊原料中加入水倒入打漿機中打漿，再通過膠體磨細磨3次，得到南瓜漿；
步驟二、稱取原料
按照如上所述的重量份數分別稱取果膠酶、纖維素酶、糖化酶、凝結芽孢桿菌、蔗糖、檸檬酸、檸檬酸鈉、黃原膠以及步驟一制備的南瓜漿，備用；
步驟三、酶解
將步驟二稱取好的果膠酶，纖維素酶和糖化酶加入到步驟一制得的南瓜漿中，在60℃條件下酶解4h，得酶解后的南瓜漿，備用；
步驟四、過濾、滅菌
將步驟三酶解后的南瓜漿置于濾網中過濾得到南瓜發酵液，在115℃下，高溫滅菌30min，得滅菌后的南瓜汁；
步驟五、菌種活化
從試管斜面中挑取2環菌落置于ypd培養基中，在38℃培養20h，活化兩次，得到富集的凝結芽孢桿菌；
步驟六、接種發酵
將步驟四制得的滅菌后的南瓜汁作為發酵液接種，接入步驟五制得的富集的凝結芽孢桿菌，在38℃條件下培養48h，得發酵后的南瓜汁，作為優選的，凝結芽孢桿菌的接種量為步驟四制得的滅菌后的南瓜汁總重量的3%，此時產品酸度為0.45％，ph為3.95，菌落總數為1.1×109cfu/g；
步驟七、調配
往步驟六制得的發酵后的南瓜汁中分別加入步驟二稱取的蔗糖、檸檬酸、檸檬酸鈉和黃原膠，經過濾、均質、灌裝，得一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料。
實施例三
一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料，該常溫活菌飲料由南瓜漿經果膠酶、纖維素酶和糖化酶酶解后與凝結芽孢桿菌混合發酵并加入調味劑調和而成，所述的南瓜漿由南瓜塊原料煮熟后加水打漿而成，所述調味劑由蔗糖、檸檬酸、檸檬酸鈉和黃原膠組成；其中，每100重量份的南瓜塊原料中，加入的果膠酶、纖維素酶、糖化酶、蔗糖、檸檬酸、檸檬酸鈉和黃原膠的重量份數依次為：果膠酶0.3份，纖維素酶1.2份，糖化酶0.9份，蔗糖5份，檸檬酸0.5份，檸檬酸鈉0.4份，黃原膠0.1份；其中，打漿時，南瓜塊原料與水的重量比為1：3，作為一種優選方案，所述果膠酶的酶活力單位為1萬-4萬u/g，纖維素酶的酶活力單位為2萬-6萬u/g，糖化酶的酶活力單位是5萬-10萬u/g。
制備如上所述的一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料的方法，包括以下步驟：
步驟一、南瓜漿的制備
選擇無病蟲危害腐蝕的成熟南瓜，用水清洗干凈后，切去表皮、去籽瓤，然后切成1.2cm厚的片狀作為南瓜塊原料；將南瓜塊原料放入沸水中煮6min，向煮熟的南瓜塊原料中加入水倒入打漿機中打漿，再通過膠體磨細磨2次，得到南瓜漿；
步驟二、稱取原料
按照如上所述的重量份數分別稱取果膠酶、纖維素酶、糖化酶、凝結芽孢桿菌、蔗糖、檸檬酸、檸檬酸鈉、黃原膠以及步驟一制備的南瓜漿，備用；
步驟三、酶解
將步驟二稱取好的果膠酶，纖維素酶和糖化酶加入到步驟一制得的南瓜漿中，在48℃條件下酶解3h，得酶解后的南瓜漿，備用；
步驟四、過濾、滅菌
將步驟三酶解后的南瓜漿置于濾網中過濾得到南瓜發酵液，在108℃下，高溫滅菌20min，得滅菌后的南瓜汁；
步驟五、菌種活化
從試管斜面中挑取2環菌落置于ypd培養基中，在34℃培養18h，活化兩次，得到富集的凝結芽孢桿菌；
步驟六、接種發酵
將步驟四制得的滅菌后的南瓜汁作為發酵液接種，接入步驟五制得的富集的凝結芽孢桿菌，在34℃條件下培養30h，得發酵后的南瓜汁，作為優選的，凝結芽孢桿菌的接種量為步驟四制得的滅菌后的南瓜汁總重量的2%，此時產品酸度為0.405％，ph為3.96，菌落總數為1.51×109cfu/g；
步驟七、調配
往步驟六制得的發酵后的南瓜汁中分別加入步驟二稱取的蔗糖、檸檬酸、檸檬酸鈉和黃原膠，經過濾、均質、灌裝，得一種凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料。
試驗研究數據
一、bc361分離篩選與鑒定
分離篩選：從生態養殖場健康仔豬盲腸及糞便樣品中分離篩選凝結芽孢桿菌，稱取1g樣品添加到9ml無菌生理鹽水中，渦旋儀混勻；80℃水浴，10min除去非芽孢細菌體；按照1％的接種量接種于改良lb培養基中，37℃培養20h后于改良碳酸鈣鑒定平板上進行稀釋涂布；挑選有溶鈣圈且生長良好的單菌落進行革蘭氏染色、芽孢染色、和接觸酶試驗，選取革蘭氏陽性、產芽孢且接觸酶為陽性的桿狀細菌作為候選凝結芽孢桿菌，繼續純化培養，保藏備用。
鑒定：
1.生理生化鑒定（參照《伯杰細菌鑒定手冊》、《常見細菌系統鑒定手冊》和《微生物學實驗教程》進行生理生化鑒定相關試驗）
由表1可看出候選菌株與標準凝結芽孢桿菌的生理生化特征基本一致，初步鑒定為凝結芽孢桿菌。
2.16srdna分子生物學鑒定
如圖1所示，通過細菌基因組dna提取試劑盒提取bc361基因組dna，以p0和pc3為上下游引物進行pcr擴增，擴增出約750bp的特異條帶并進行測序。測序結果提交到eztaxon數據庫進行比對。采用mega5.0軟件構建系統發育樹，從進化距離分析發現bc361與b.coagulansiam12463標準模式菌株接近。這與生理生化鑒定結果一致，因此，將它們鑒定為凝結芽孢桿菌。
二、成品凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料品質分析
目前，市場上的益生菌產品通常以發酵乳和酸奶的形式。然而，隨著素食主義消費者以及乳糖不耐癥患者的增加，對非乳益生菌產品的需求也不斷突顯出來。水果和蔬菜分布廣泛、且其營養價值豐富，可作為非乳益生菌產品的理想發酵底物，為目前的益生菌乳制產品提供健康的替代品。產品以當地盛產的南瓜為原料，以新型益生菌凝結芽孢桿菌為發酵菌株，提高南瓜附加利用值的同時開發出新型益生菌活菌飲料。
相關指標結果
菌落總數：5×108-1.51×109cfu/g，菌落總數遠遠高于國家對活菌飲料的菌落總數的要求106cfu/g；
ph：3.95-4.1；
酸度：0.27%-0.45%；
其中，對南瓜漿中β-胡蘿卜素和維生素c含量進行檢測，檢測結果見表2：
由表2可以看出，經過發酵后，不同菌種發酵南瓜后β-胡蘿卜素和維生素c含量都有一定程度的損失，但利用本發明制備方法接種凝結芽孢桿菌損失程度遠低于由保加利亞乳桿菌：嗜熱鏈球菌=1:1，因此，利用本發明制備方法制備的凝結芽孢桿菌益生菌常溫活菌飲料，營養成分得到較大程度地保留。
上述僅為本發明的具體實施例，但本發明的工藝并不局限于此，凡利用此工藝方法對本發明進行非實質性的改動,均應屬于侵犯本發明保護范圍的行為。