本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及細錐香茶菜乙素的一種新用途，更具體涉及細錐香茶菜乙素在制備抑制食管鱗癌細胞增殖的產品中的應用。

背景技術：

食管鱗癌(esophagealsquamouscellcarcinoma，escc)是惡性程度非常高的癌癥，在亞洲有著很高的發病率，五年生存率只有15％-25％。雖然近年來癌癥診療技術有了長足進步，但escc預后仍然很差。化療是晚期escc患者的主要治療方法，但大多數患者對治療不敏感。因此，迫切需要開發高效低毒的新藥。

唇形科(labiatae)香茶菜屬(isodon)植物是我國民間廣泛使用的中草藥，該屬植物以全草或根入藥，具有清熱利濕、活血散瘀、解毒消腫等功效，富含結構多樣的活性二萜類化合物。溪黃草(isodonserra(maxim.)hara)屬唇形科(labiatae)香茶菜屬(isodon)，又名熊膽草、血風草，俗稱土黃連，主產于長江以南的廣東、江浙等省區，常成叢生于山坡、溪旁，海拔120-1250米。根或全草入藥，具有清熱利濕、退黃祛濕、涼血散瘀的功效，用于治療急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎、痢疾、腸炎、跌打瘀痛等病癥。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是如何抑制食管鱗癌細胞增殖。

為解決上述技術問題，本發明首先提供了細錐香茶菜乙素在制備產品中的應用；所述產品的功能可為如下a1)至a16)中的至少一種：

a1)抑制食管鱗癌細胞的增殖；a2)抑制食管鱗癌細胞的克隆形成；a3)影響食管鱗癌細胞周期進程；a4)誘導食管鱗癌細胞周期阻滯；a5)抑制食管鱗癌細胞的dna修復；a6)誘導食管鱗癌細胞凋亡；a7)上調促進細胞凋亡蛋白的表達量；a8)上調cleaved-caspase-9的表達量；a9)上調cleaved-caspase-3的表達量；a10)上調cleaved-parp的表達量；a11)抑制細胞存活通路；a12)抑制akt信號通路；a13)抑制nf-κb信號通路；a14)抑制食管鱗癌細胞引起的腫瘤的生長；a15)預防食管鱗癌；a16)治療食管鱗癌。

細錐香茶菜乙素的應用也屬于本發明的保護范圍。細錐香茶菜乙素的應用可為如下a1)至a16)中的至少一種：

a1)抑制食管鱗癌細胞的增殖；a2)抑制食管鱗癌細胞的克隆形成；a3)影響食管鱗癌細胞周期進程；a4)誘導食管鱗癌細胞周期阻滯；a5)抑制食管鱗癌細胞的dna修復；a6)誘導食管鱗癌細胞凋亡；a7)上調促進細胞凋亡蛋白的表達量；a8)上調cleaved-caspase-9的表達量；a9)上調cleaved-caspase-3的表達量；a10)上調cleaved-parp的表達量；a11)抑制細胞存活通路；a12)抑制akt信號通路；a13)抑制nf-κb信號通路；a14)抑制食管鱗癌細胞引起的腫瘤的生長；a15)預防食管鱗癌；a16)治療食管鱗癌。。

上述應用中，所述食管鱗癌細胞具體可為kyse30細胞。

上述應用中，所述食管鱗癌細胞具體可為kyse450細胞。

上述應用中，所述a3)或a4)中，所述細胞周期為g2/m期。

上述應用中，所述產品可為藥物。

為解決上述技術問題，本發明還提供了一種產品。

本發明所提供的產品，含有細錐香茶菜乙素；所述產品的功能可為如下a1)至a16)中的至少一種：

a1)抑制食管鱗癌細胞的增殖；a2)抑制食管鱗癌細胞的克隆形成；a3)影響食管鱗癌細胞周期進程；a4)誘導食管鱗癌細胞周期阻滯；a5)抑制食管鱗癌細胞的dna修復；a6)誘導食管鱗癌細胞凋亡；a7)上調促進細胞凋亡蛋白的表達量；a8)上調cleaved-caspase-9的表達量；a9)上調cleaved-caspase-3的表達量；a10)上調cleaved-parp的表達量；a11)抑制細胞存活通路；a12)抑制akt信號通路；a13)抑制nf-κb信號通路；a14)抑制食管鱗癌細胞引起的腫瘤的生長；a15)預防食管鱗癌；a16)治療食管鱗癌。

上述產品中，所述食管鱗癌細胞具體可為kyse30細胞。

上述產品中，所述食管鱗癌細胞具體可為kyse450細胞。

上述產品中，所述a3)或a4)中，所述細胞周期為g2/m期。

所述產品可為藥物。

上述任一所述cleaved-caspase-9的geneid為842。

上述任一所述cleaved-caspase-3的geneid為836。

上述任一所述cleaved-parp的geneid為142。

上述任一所述細錐香茶菜乙素可為式(ⅰ)的化合物。

上述任一所述細錐香茶菜乙素可為溪黃草提取物。

上述任一所述細錐香茶菜乙素可為溪黃草酮提物。所述酮具體可為丙酮。

所述溪黃草酮提物的制備方法可包括如下步驟：以溪黃草的地上部分為原料，依次進行丙酮浸泡、乙酸乙酯萃取、硅膠色譜柱分析、薄層色譜法檢測、mci脫色、甲醇洗脫和重結晶。

所述“丙酮浸泡”具體可為采用丙酮水溶液進行浸泡。所述丙酮水溶液具體可為70％(v/v)丙酮水溶液。所述“丙酮浸泡”中，丙酮水溶液與原料的配比可為6kg：20l。所述“丙酮浸泡”的時間具體可為3d。為了增加產率，可多次重復浸泡后再混合。

所述制備方法中，具體可將所述“丙酮浸泡”得到的浸泡液減壓蒸餾(目的為回收丙酮)，然后將得到的提取液用乙酸乙酯進行萃取。

所述“乙酸乙酯萃取”中，所述提取液和乙酸乙酯的體積配比可為1:3。

所述“硅膠色譜柱分析”中，具體可使用填充有80-100目孔徑硅膠的硅膠色譜柱分析。

所述“薄層色譜法檢測”具體可為用薄層色譜法檢測，合并相同部分，得到7個餾分，然后將餾分二依次進行mci脫色、甲醇洗脫和重結晶。

所述“甲醇洗脫”具體可為采用甲醇水溶液進行洗脫。所述甲醇水溶液具體可為90％(v/v)甲醇水溶液。

所述“重結晶”具體可為甲醇溶解重結晶。

獲得細錐香茶菜乙素的步驟具體可如下：

(1)將溪黃草的地上部分進行粉碎(篩網目數：8目)，得到粒度小于0.25cm的原料。

(2)完成步驟(1)后，取原料，加入70％(v/v)丙酮水溶液進行浸泡，浸泡分別進行三次，每次浸泡時間為3d，分別得到浸泡液1、浸泡液2和浸泡液3。

(3)完成步驟(2)后，分別將浸泡液1、浸泡液2和浸泡液3減壓蒸餾(目的為回收丙酮)，依次得到提取液1、提取液2和提取液3。

(4)完成步驟(3)后，分別向提取液1、提取液2和提取液3中按體積比為1：3加入乙酸乙酯，進行萃取，依次得到乙酸乙酯提取物1、乙酸乙酯提取物2和乙酸乙酯提取物3。

(5)完成步驟(4)后，使用填充有80-100目孔徑硅膠的硅膠色譜柱分析乙酸乙酯提取物1、乙酸乙酯提取物2或乙酸乙酯提取物3。

(6)完成步驟(5)后，先用薄層色譜法檢測，合并相同部分，得到7個餾分；然后將餾分二依次進行mci脫色、90％(v/v)甲醇水溶液洗脫和甲醇溶解重結晶，得到的固體物質即為細錐香茶菜乙素。

實驗證明，細錐香茶菜乙素可抑制食管鱗癌細胞的增殖、抑制食管鱗癌細胞的克隆形成、影響食管鱗癌細胞周期進程、誘導食管鱗癌細胞周期阻滯、抑制食管鱗癌細胞的dna修復、誘導食管鱗癌細胞凋亡、上調cleaved-caspase-9的表達量、上調cleaved-caspase-3的表達量、上調cleaved-parp的表達量、抑制akt信號通路、抑制nf-κb信號通路和抑制食管鱗癌細胞引起的腫瘤的生長，具有重要的應用價值。

附圖說明

圖1為細錐香茶菜乙素的¹h-nmr譜。

圖2為細錐香茶菜乙素的¹³c-nmr譜。

圖3為細錐香茶菜乙素的hr-esims譜。

圖4為實施例2的實驗結果。

圖5為實施例3的實驗結果。

圖6為實施例4步驟一的實驗結果。

圖7為實施例4步驟二的實驗結果。

圖8為實施例5的實驗結果。

圖9為實施例6步驟2的實驗結果。

圖10為實施例6步驟3的實驗結果。

圖11為實施例6步驟4的實驗結果。

圖12為實施例6步驟5和6的實驗結果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

kyse30細胞和kyse450細胞均由中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所提供。經過str鑒定，kyse30細胞和kyse450細胞均符合日本細胞庫(jcrb)提供的str位點譜。

結晶紫為碧云天公司的產品，產品目錄號為c0121。細胞周期檢測試劑盒為江蘇凱基生物技術股份有限公司的產品，產品目錄號為kga512。cck8為同仁化學研究所的產品，產品目錄號為ck04。細胞凋亡檢測試劑盒(商品名稱為：annexinv，fitcapoptosisdetectionkit)為同仁化學研究所的產品，產品目錄號為556547。無胸腺裸鼠為華阜康公司的產品，產品目錄號為no.11401300035372。dnadamageantibodysamplerkit、cdc25cantibodysamplerkit、cdc2antibody、phospho-cdc2antibody、cyclinb1antibody、gapdhantibody、apoptosisantibodysamplerkit、caspase8antibody、baxantibody、bcl-2antibody、phospho-aktpathwayantibodysamplerkit和nf-κbpathwayantibodysamplerkit均為cellsignalingtechnology公司的產品，產品目錄號分別為#9947、#9555、#9112、#4539、#4138、#5174、#9915、#9746、#2772、#2870、#9916和#9936。

使用dmso配制濃度分別為0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、4mm、6mm、8mm和10mm的細錐香茶菜乙素母液，用1640完全培養液將上述濃度的細錐香茶菜乙素母液分別稀釋1000倍，得到dmso含量均為0.1％(v/v)、細錐香茶菜乙素濃度為0.5μm的細錐香茶菜乙素溶液1、濃度為1μm的細錐香茶菜乙素溶液2、濃度為1.5μm的細錐香茶菜乙素溶液3、濃度為2μm的細錐香茶菜乙素溶液4、濃度為2.5μm的細錐香茶菜乙素溶液5、濃度為3μm的細錐香茶菜乙素溶液6、濃度為4μm的細錐香茶菜乙素溶液7、濃度為6μm的細錐香茶菜乙素溶液8、濃度為8μm的細錐香茶菜乙素溶液9和濃度為10μm的細錐香茶菜乙素溶液10。

實施例1、制備細錐香茶菜乙素(rabdocoestinb)

細錐香茶菜乙素的結構式如式(ⅰ)所示，制備細錐香茶菜乙素的步驟如下：

1、將6kg市售的溪黃草的地上部分進行粉碎(篩網目數：8目)，得到粒度小于0.25cm的原料。

2、完成步驟1后，取原料，加入20l70％(v/v)丙酮水溶液進行浸泡，浸泡分別進行三次，每次浸泡時間為3d，分別得到浸泡液1、浸泡液2和浸泡液3。

3、完成步驟2后，分別將浸泡液1、浸泡液2和浸泡液3減壓蒸餾(目的為回收丙酮)，依次得到提取液1、提取液2和提取液3。

4、完成步驟3后，分別向提取液1、提取液2和提取液3中按體積比為1：3加入乙酸乙酯，進行萃取，依次得到乙酸乙酯提取物1、乙酸乙酯提取物2和乙酸乙酯提取物3。

5、完成步驟4后，使用填充有80-100目孔徑硅膠的硅膠色譜柱分離乙酸乙酯提取物1、乙酸乙酯提取物2或乙酸乙酯提取物3。流動相由氯仿(a)和丙酮(b)組成，流速為1000ml/min，使用以下梯度洗脫條件：在0～1h內，流動相為純氯仿洗脫；在1h～3h內，用由氯仿和丙酮按照9:1的體積比混合得到的流動相進行洗脫；在3h～10h內，用由氯仿和丙酮按照8:2的體積比混合得到的流動相進行洗脫；在10h～15h內，用由氯仿和丙酮按照7:3的體積比混合得到的流動相進行洗脫；在15h～18h內，用由氯仿和丙酮按照6:4的體積比混合得到的流動相進行洗脫；在18h～19h內，用由氯仿和丙酮按照5:5的體積比混合得到的流動相進行洗脫；在19h～20h內，流動相為純丙酮洗脫。進行線性梯度洗脫檢測波長為254nm。

6、完成步驟5后，先用薄層色譜法檢測，合并相同部分，得到7個餾分；然后將餾分二依次進行mci脫色、90％(v/v)甲醇水溶液洗脫和甲醇溶解重結晶，得到固體物質。

將該固體物質分別進行¹h-nmr譜、¹³c-nmr譜和hr-esims譜檢測，實驗結果依次見圖1、圖2和圖3。

該固體物質的的核磁數據如下：

白色無定形粉末；

c22h30o6；

positivehresims[m+na]⁺m/z413.1934(calcdforc22h30o6na，413.1935)；

¹hnmr(c5d5n，600mhz)：δh6.29and5.43(each1h，brs，h2-17)，5.31(1h，brs，h-14α)，4.78(1h，dd，11.4，5.2，h-1β)，4.57and4.48(each1h，d，10.1，h2-20)，2.02(3h，s，oac)，1.08and0.70(each3h，s，me-18，19)；

¹³cnmr(c5d5n，600mhz)，δc73.7(d,c-1)，25.9(t，c-2)，38.4(t，c-3)，34.2(s，c-4)，49.1(d，c-5)，31.39(t，c-6)，98.6(s，c-7)，59.7(s，c-8)，53.0(d，c-9)，39.9(s，c-10)，18.9(t，c-11)，33.0(t，c-12)，43.6(d，c-13)，76.5(d，c-14)，204.4(s，c-15)，154.0(s，c-16)，117.4(t，c-17)，31.8(q，c-18)，21.8(q，c-19)，64.2(t，c-20)，170.5(s，aco-1)，21.8(q，aco-1)

上述結果表明，通過上述步驟制備的固體物質為細錐香茶菜乙素。獲得的細錐香茶菜乙素為8.0g，得率約為0.133％。

實施例2、細錐香茶菜乙素對食管鱗癌細胞的細胞毒性

一、細錐香茶菜乙素抑制食管鱗癌細胞的增殖

1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100u/ml)青霉素和1％(100μg/ml)鏈霉素的改良型rpmi-1640培養液培養細胞(kyse30細胞或kyse450細胞)至對數增殖期，然后消化重懸，得到濃度為2×10⁴個/ml的細胞懸浮液。

2、取96孔細胞培養板，每孔加入100μl步驟1獲得的細胞懸浮液(每孔約2000個細胞)，細胞貼壁后換液為100μl細錐香茶菜乙素溶液(細錐香茶菜乙素溶液1、細錐香茶菜乙素溶液2、細錐香茶菜乙素溶液3、細錐香茶菜乙素溶液4、細錐香茶菜乙素溶液5、細錐香茶菜乙素溶液6、細錐香茶菜乙素溶液7、細錐香茶菜乙素溶液8或細錐香茶菜乙素溶液9)，5％co2、37℃培養12h、24h、48h或72h；然后每孔加入100μl含10％(10μl/1ml)cck8的1640完全培養液，采用酶標儀檢測在450nm處的吸光值。

在96孔細胞培養板中設置陰性對照孔，每個陰性對照孔加入100μl步驟1所得細胞懸液，即每孔約2000細胞。陰性對照組待細胞貼壁后換液為100μl含0.1％dmso(v/v)的1640完全培養液(與細錐香茶菜乙素溶液同一時間點換液)，5％co2、37℃培養12h、24h、48h或72h；然后每孔加入100μl含10％(10μl/1ml)cck8的1640完全培養液，采用酶標儀檢測陰性對照孔在450nm處的吸光值。

以細錐香茶菜乙素在孔中的濃度為橫坐標，相對活性為縱坐標，比較細錐香茶菜乙素處理后待測細胞的增殖程度。相對活性根據下述公式計算：

相對活性(％)＝(細錐香茶菜乙素溶液處理組在450nm處的吸光值-無細胞空白對照組在450nm處的吸光值)/(陰性對照組在450nm處的吸光值-無細胞空白對照組在450nm處的吸光值)×100％。

實驗結果表明，細錐香茶菜乙素可顯著抑制kyse30細胞和kyse450細胞的增殖，ic50分別為1.56μm和1.94μm(圖4中a，左圖為kyse30細胞，右圖為kyse450細胞)；細錐香茶菜乙素對kyse30細胞和kyse450細胞的生長抑制呈劑量和時間依賴性(圖4中b為kyse30細胞，左圖為線性圖，右圖為柱狀圖；圖4中c為kyse450細胞，左圖為線性圖，右圖為柱狀圖)。

二、細錐香茶菜乙素抑制食管鱗癌細胞的克隆形成

1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100u/ml)青霉素和1％(100μg/ml)鏈霉素的改良型rpmi-1640培養液培養細胞(kyse30細胞或kyse450細胞)至對數增殖期，然后消化重懸，得到濃度為1×10⁴個/ml的細胞懸浮液。

2、取6孔板，每孔加入1950μl1640完全培養液和50μl步驟1獲得的細胞懸浮液(每孔約500個細胞)，5％co2、37℃培養12h。

3、完成步驟2后，取所述6孔板，棄液相，加入2ml細錐香茶菜乙素溶液(細錐香茶菜乙素溶液1或細錐香茶菜乙素溶液2)，5％co2、37℃培養24h。

4、完成步驟3后，取所述6孔板，棄液相，加入2ml1640完全培養液，5％co2、37℃培養7d。

5、完成步驟4后，將采用結晶紫染色，觀察集落數目及大小。

按照上述步驟，將步驟3中的“細錐香茶菜乙素溶液”替換為含0.1％(v/v)dmso的1640完全培養液，其它步驟均不變中，作為對照。

實驗結果見圖4中d(左圖為生長狀態，右圖為集落數目統計結果，control為對照)。結果表明，與對照相比，細錐香茶菜乙素溫育24h后，kyse30細胞和kyse450細胞形成的集落數目明顯減少，面積也較小；細錐香茶菜乙素的濃度越高，kyse30細胞和kyse450細胞形成的集落數目越少。

上述結果表明，細錐香茶菜乙素對食管鱗癌細胞(如kyse30細胞、kyse450細胞)具有顯著的細胞毒性。

實施例3、細錐香茶菜乙素抑制食管鱗癌細胞的dna修復

一、細錐香茶菜乙素影響食管鱗癌細胞周期進程

實驗重復三次取平均值，每次重復的步驟如下：

1、用含10％(v/v)胎牛血清、1％(100u/ml)青霉素和1％(100μg/ml)鏈霉素的改良型rpmi-1640培養液培養細胞(kyse30細胞或kyse450細胞)至對數增殖期，然后消化重懸，得到濃度為5×10⁴個/ml的細胞懸浮液。取培養皿(規格為6cm)，加入4ml細胞懸浮液(即每培養皿鋪有2×10⁵個細胞)，5％co2、37℃培養12h。

2、完成步驟1后，取所述培養皿，棄液相，加入4ml無血清培養液1640，5％co2、37℃培養12h(饑餓培養，目的為使細胞同步化)。

3、取完成步驟2的細胞，棄液相，加入4ml細錐香茶菜乙素溶液(細錐香茶菜乙素溶液6或細錐香茶菜乙素溶液8)，5％co2、37℃培養24h。

4、完成步驟3后，離心，收集沉淀。

5、取步驟4收集的沉淀，加入70％(v/v)乙醇水溶液，置于4℃固定12h；然后采用細胞周期檢測試劑盒染色，最后用流式細胞儀檢測g2/m期細胞、s期細胞、g0/g1期細胞的百分比。

按照上述步驟，將步驟3中的“細錐香茶菜乙素溶液”替換為含0.1％(v/v)dmso的1640完全培養液，其它步驟均不變中，作為對照。

實驗結果見圖5中a(control為對照)。結果表明，與對照相比，細錐香茶菜乙素處理的g2/m期食管鱗癌細胞(如kyse30細胞、kyse450細胞)的百分比顯著增加，且細錐香茶菜乙素濃度越高，則百分比越高。因此，細錐香茶菜乙素可影響食管鱗癌細胞周期進程，誘導食管鱗癌細胞細胞周期阻滯。

二、細錐香茶菜乙素抑制食管鱗癌細胞的dna修復

1、同步驟一中1。

2、取完成步驟1的細胞，棄液相，加入4ml細錐香茶菜乙素溶液(細錐香茶菜乙素溶液4、細錐香茶菜乙素溶液7、細錐香茶菜乙素溶液8、細錐香茶菜乙素溶液9或細錐香茶菜乙素溶液10)，5％co2、37℃培養24h。

3、完成步驟2后，提取細胞總蛋白并檢測蛋白濃度。

4、完成步驟3后，將細胞總蛋白進行westernblot(采用dnadamageantibodysamplerkit檢測γh2ax、p-chk2、p-chk1、p-atm、p-atr和p-brca1，采用cdc25cantibodysamplerkit檢測cdc25c和p-cdc25c，采用cdc2antibody檢測cdc2，采用phospho-cdc2antibody檢測p-cdc2，采用cyclinb1antibody檢測cyclinb1，采用gapdhantibody檢測gapdh)。

按照上述步驟，將步驟2中的“細錐香茶菜乙素溶液”替換為含0.1％(v/v)dmso的1640完全培養液，其它步驟均不變中，作為對照。

實驗結果見圖5中b(control為對照)：隨著細錐香茶菜乙素濃度的增加，磷酸化組蛋白γh2ax也顯著增加，γh2ax在dna雙鏈斷裂造成的損傷反應中起重要作用，是一種dna損傷標志物，γh2ax的升高表明細錐香茶菜乙素作用后造成了細胞dna的損傷；g2/m期檢驗點蛋白p-chk2的表達量隨細錐香茶菜乙素濃度增加而增加，p-chk1先升高而后降低；細胞周期蛋白cdc25c和p-cdc25c的表達隨著chk1/2激活的增加而減少；cdc2的總量、p-cdc2以及cyclinb1的表達量，均隨細錐香茶菜乙素的濃度增加而遞降。結果表明細錐香茶菜乙素造成的dna損傷激活了chk1/2，而活化的chk1/2抑制了cdc25c的功能；由于cdc2是cdc25c的作用靶點，cdc25c的失活抑制了cdc2功能，從而防止不成熟有絲分裂的發生。此外，cyclinb1的表達同樣受到細錐香茶菜乙素抑制，加強了g2/m期停滯作用。因此，細錐香茶菜乙素導致食管鱗癌細胞dna損傷，誘導了g2/m期阻滯，并且抑制食管鱗癌細胞dna修復。

實施例4、細錐香茶菜乙素誘導食管鱗癌細胞凋亡

一、細錐香茶菜乙素誘導食管鱗癌細胞凋亡

1、同實施例3步驟一中1。

2、取完成步驟1的細胞，棄液相，加入4ml細錐香茶菜乙素溶液(細錐香茶菜乙素溶液7或細錐香茶菜乙素溶液9)，5％co2、37℃培養24h或48h。

3、完成步驟2后，離心，收集沉淀。

4、完成步驟3后，取沉淀，先用ph7.4、10mm的pbs緩沖液清洗兩遍，然后用細胞凋亡檢測試劑盒染色，最后用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。

按照上述步驟，將步驟2中的“細錐香茶菜乙素溶液”替換為含0.1％(v/v)dmso的1640完全培養液，其它步驟均不變中，作為對照。

實驗結果見圖6(control和dmso均為對照)。結果表明，與對照相比，細錐香茶菜乙素處理的食管鱗癌細胞(如kyse30細胞、kyse450細胞)發生凋亡的比例顯著增加，且細錐香茶菜乙素濃度越高，則發生凋亡的比例越高。因此，細錐香茶菜乙素可誘導食管鱗癌細胞凋亡。

二、檢測凋亡相關蛋白的變化

已有研究表明，cleaved-caspase-9(geneid：842；以下簡稱c-cas9)、cleaved-caspase-3(geneid：836；以下簡稱c-cas3)、cleaved-caspase-8(geneid：841；以下簡稱c-cas8)、cleaved-parp(geneid：142；以下簡稱parp)和bax(geneid：581)均為促進細胞凋亡蛋白；bcl-2(geneid：596)為抑制細胞凋亡蛋白。

1、同實施例3步驟二中1。

2、同實施例3步驟二中2。

3、同實施例3步驟二中3。

4、完成步驟3后，將細胞總蛋白進行westernblot(采用apoptosisantibodysamplerkit檢測parp、c-cas9和c-cas3，采用caspase8antibody檢測c-cas8，采用baxantibody檢測bax，采用bcl-2antibody檢測bcl-2，采用gapdhantibody檢測gapdh)。

按照上述步驟，將步驟2中的“細錐香茶菜乙素溶液”替換為含0.1％(v/v)dmso的1640完全培養液，其它步驟均不變中，作為對照。

實驗結果見圖7(dmso為對照)。結果表明，隨著細錐香茶菜乙素濃度的不斷提高，cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和cleaved-parp的表達量均不斷上升，cleaved-caspase-8和bcl-2幾乎不表達，bax的表達量無明顯變化。因此，細錐香茶菜乙素通過caspase-9依賴性內源性凋亡通路導致食管鱗癌細胞凋亡，并且是bax和bcl-2非依賴性的。

實施例5、細錐香茶菜乙素抑制akt信號通路和nf-κb信號通路

akt信號通路和nf-κb信號通路是細胞存活的兩個關鍵通路。因此，需要檢測細錐香茶菜乙素對akt信號通路和nf-κb信號通路的影響。

1、同實施例3步驟二中1。

2、同實施例3步驟二中2。

3、同實施例3步驟二中3。

4、完成步驟3后，將細胞總蛋白進行westernblot(采用phospho-aktpathwayantibodysamplerkit檢測akt和p-akt，采用nf-κbpathwayantibodysamplerkit檢測ikkα、ikkβ、p-ikkα/β、iκbα、p-iκbα、nf-κb、p-nf-κb，采用gapdhantibody檢測gapdh)。

按照上述步驟，將步驟2中的“細錐香茶菜乙素溶液”替換為含0.1％(v/v)dmso的1640完全培養液，其它步驟均不變中，作為對照。

實驗結果見圖8(control為對照)。結果表明，細錐香茶菜乙素可以抑制akt信號通路和nf-κb信號通路：細錐香茶菜乙素抑制akt信號通路主要通過抑制位點ser473的磷酸化發揮作用的，其使akt磷酸化水平(ser473位點)明顯減少而總akt量出現輕度下降；細錐香茶菜乙素顯著抑制nf-κb通路主要是引起作為nf-κb信號激活子的ikkα和ikkβ表達量減少，而作為nf-κb信號抑制子的iκbα隨著細錐香茶菜乙素濃度的增加而增加(其它分子(如p-ikkα/β、p-iκbα、nf-κb、p-nf-κb)的表達水平保持不變)。因此，細錐香茶菜乙素抑制可抑制akt信號通路和nf-κb信號通路，驅動食管鱗癌細胞(如kyse30細胞、kyse450細胞)跨越凋亡閾值，導致食管鱗癌細胞凋亡。

實施例6、細錐香茶菜乙素抑制食管鱗癌小鼠異種移植物模型中的腫瘤生長

1、將30只3-4周齡體重為13～17g的健康無胸腺裸鼠隨機分成細錐香茶菜乙素組、順鉑(ddp)組和對照組(每組10只)，分別進行如下處理：

細錐香茶菜乙素組：首先每只無胸腺裸鼠皮下移植1.2×10⁶個kyse30細胞，移植后第9天開始腹腔注射細錐香茶菜乙素，以后隔天繼續腹腔注射細錐香茶菜乙素，直至上述三組中任一只無胸腺裸鼠的腫瘤生長至2000mm³停止注射。注射劑量均為12mg細錐香茶菜乙素/kg無胸腺裸鼠。

順鉑組：首先每只無胸腺裸鼠皮下移植1.2×10⁶個kyse30細胞，移植后第9天開始腹腔注射順鉑，以后隔天繼續腹腔注射順鉑，直至上述三組中任一只無胸腺裸鼠的腫瘤生長至2000mm³停止注射(討論：同上)。注射劑量均為2mg順鉑/kg無胸腺裸鼠。

對照組：首先每只無胸腺裸鼠皮下移植1.2×10⁶個kyse30細胞，移植后第9天開始，腹腔注射0.1％的pluronicf68溶劑(0.1％的pluronicf68溶劑為f-68原液使用無菌超純水稀釋100倍得到的；f-68，10％(100x)，貨號：24040032，thermo)，以后隔天繼續腹腔注射pluronicf68溶劑，直至上述三組中任一只無胸腺裸鼠的腫瘤生長至2000mm³停止注射。注射劑量均為200μl。

2、完成步驟1后，測量各小鼠的腫瘤體積并按組取平均值；稱量各小鼠的腫瘤重量并按組取平均值；以注射時間為橫坐標，平均腫瘤體積為縱坐標，繪制腫瘤生長曲線。

實驗結果見圖9(a為各組小鼠處死時的狀態，b為各組小鼠的腫瘤組織，c為各組小鼠的腫瘤生長曲線，d為各組小鼠的平均腫瘤重量的統計結果；control為對照組，ddp為順鉑組，rabd-b為細錐香茶菜乙素組)：對照組的平均腫瘤體積從28.02±9.63mm³增加到1368.61±323.07mm³，細錐香茶菜乙素組的平均腫瘤體積從31.92±17.96mm³增加到564.44±115.84mm³，順鉑組的平均腫瘤體積從34.65±23.60mm³增加到595.54±141.33mm³；對照組的平均腫瘤重量為1.011±0.369g，細錐香茶菜乙素組的平均腫瘤重量為0.423±0.174g，順鉑組的平均腫瘤重量為0.376±0.119g。因此，細錐香茶菜乙素和順鉑均可有效抑制腫瘤生長，具有明顯腫瘤抑制活性。

3、完成步驟1后，測量各小鼠的體重并按組取平均值。

實驗結果見圖10(control為對照組，ddp為順鉑組，rabd-b為細錐香茶菜乙素組)。結果表明，各組小鼠的體重沒有顯著的減少，各組無顯著差異。

4、完成步驟1后，對各小鼠的肝組織、腎組織和腫瘤組織進行he染色。

實驗結果見圖11(control為對照組，ddp為順鉑組，rabd-b為細錐香茶菜乙素組)。結果表明，各組小鼠的肝組織和腎組織均無明顯損傷；細錐香茶菜乙素組和順鉑組的腫瘤組織中出現明顯的損傷性病理改變，如大空泡化，細胞碎片和壞死巢；對照組的腫瘤組織中彌漫活腫瘤細胞巢，沒有看到明顯細胞死亡現象。

5、完成步驟1后，按照deadendtmfluorometrictunelsystem(promega公司的產品，產品目錄號為g3250)的說明書的步驟對各小鼠的腫瘤組織進行tunel信號檢測。tunel(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dutp末端標記)用于標記dna被切割的凋亡細胞，是固定組織中的細胞凋亡原位信號。

6、完成步驟1后，對各小鼠的腫瘤組織進行ki67ihc檢測(ki-67是在增殖細胞中普遍表達的核非組蛋白，與腫瘤細胞增殖和生長密切相關，是一種常用的增殖標志物)。具體步驟如下：取腫瘤組織石蠟切片，常規脫蠟至水，先經0.01mol/l枸櫞酸緩沖液微波抗原修復15min；再加入3％(v/v)h2o2水溶液室溫孵育10min(目的為消除內源性過氧化氫酶)，加入山羊血清室溫封閉30min，然后加入ki67特異性抗體(cellsignalingtechnology公司的產品，產品目錄號為#9027)孵育12h，最后采用通用型二步法檢測系統(中杉金橋，pv-9000)識別抗體并進行信號放大，dab顯色。

實驗結果見圖12(control為對照組，ddp為順鉑組，rabd-b為細錐香茶菜乙素組，fluo-12-dutp為凋亡信號標志，dapi為細胞核染色，merge為凋亡信號與細胞核染色疊加合成的信號)。結果表明，對照組中顯示出彌漫ki-67表達，并且無明顯tunel信號；細錐香茶菜乙素組和順鉑組中ki-67幾乎不表達，而呈現明顯的凋亡信號。