專利名稱：一種食管鱗癌原代瘤株ch-h-2的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于原代瘤異種移植腫瘤模型領(lǐng)域，特別涉及一種食管鱗癌原代瘤株CH-H-2的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
食管癌(主要為鱗狀細(xì)胞癌)是全球第九大惡性疾病，在全球許多地區(qū)流行，特別是在發(fā)展中國家。在中國，食管癌的發(fā)病率更高，在所有腫瘤發(fā)病率中居第4位，男性食管癌年發(fā)病率及死亡率分別是22. 47/10萬及16. 65/10萬，發(fā)病及死亡人數(shù)分別是147629與109435人，女性食管癌年發(fā)病率及死亡率分別是11. 10/10萬及8. 50/10萬，發(fā)病及死亡人數(shù)分別是68853與52711人。我國食管癌的年總發(fā)病與死亡人數(shù)達(dá)216482與162146人。中國人食管癌年發(fā)病及死亡人數(shù)分別占全世界食管癌總發(fā)病與死亡人數(shù)的52. 5%與41.8%，是ー種嚴(yán)重危害人民群眾身體健康的疾病。隨著人們對(duì)腫瘤性質(zhì)及腫瘤細(xì)胞株模型研究的不斷深入，細(xì)胞株自身所存在的不足也日漸為人們所認(rèn)識(shí)。期間人們注意到，往往有一些曾經(jīng)在臨床前研究中取得理想治療效果的抗腫瘤藥物在后期臨床驗(yàn)證中效果差強(qiáng)人意，甚至與前期結(jié)果大相徑庭。目前廣為采用的由腫瘤細(xì)胞株及其移植瘤構(gòu)建的藥篩平臺(tái)與臨床實(shí)際治療效果之間還存在著明顯的差異。由于腫瘤細(xì)胞株通常是由少數(shù)甚至是單個(gè)的腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增而得，因此細(xì)胞株模型往往反映的是部分腫瘤細(xì)胞的性質(zhì)。尤為重要的是，越來越多的研究表明，腫瘤細(xì)胞在建株過程中為了獲得體外貼壁生長及長期傳代能力，其細(xì)胞功能及遺傳性狀都會(huì)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，并由此而導(dǎo)致某些重要的生物學(xué)特性發(fā)生改變，其中包括基因表達(dá)的開啟或關(guān)閉(Pandita A, Aldape KD, Zadeh G et al. Contrasting in vivo and invitro fates of glioblastoma cell subpopulations with amplified EGFR. GenesChromosomes Cancer 2004;39 (I):29-36)、(De Witt Hamer PC,Van Tilborg AAj EijkPP et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early inprimary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene 2008;27 (14):2091-6);遷移及轉(zhuǎn)移能力變化(Vescovi AL, Galli R, Reynolds BA. Brain tumour stem cells. NatRev Cancer 2006; 6 (6) : 425-36);腫瘤干細(xì)胞群比例失衡以及信號(hào)傳導(dǎo)通路的改變等等(Clement V，Sanchez P，de Tribolet N et al. HEDGEH0G-GLI1 signaling regulateshuman glioma growth,cancer stem cell self-renewal, and tumorigenicity.CurrBiol 2007;17(2):165-72)、(Sasai K，Romer JTj Lee Y et al. Shh pathway activity isdown—regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinicalstudies. Cancer Res 2006; 66 (8) :4215-22)。進(jìn)ー步的研究表明，即使將腫瘤細(xì)胞株細(xì)胞植入免疫缺陷小鼠而恢復(fù)其三維生長形式，上述改變也不能因此而得到糾正[6]。可以想見，腫瘤細(xì)胞株模型與原代腫瘤性質(zhì)上的不同，勢(shì)必造成抗腫瘤藥物臨床前研究與實(shí)際臨床治療效果之間的嚴(yán)重脫節(jié)。
為了克服腫瘤細(xì)胞株模型所存在的不足，有學(xué)者曾一度嘗試建立鼠源腫瘤在體模型并試圖通過觀察抗腫瘤藥物對(duì)鼠源腫瘤細(xì)胞的殺傷作用來推測(cè)其對(duì)人源腫瘤的治療效果。但后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，相同的抗腫瘤藥物對(duì)人源與鼠源腫瘤的治療效果相差迥異，鼠源腫瘤模型對(duì)臨床治療效果的提示作用甚至差于傳統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞株模型(TeicherBA. Human tumor xenografts and mouse models of numan tumors:re-discovermgthe models. Expert Opin Drug Discov 2009;4(12) : 11)、(Richmond A, Su Y.Mousexenograft models vs GEM models for human cancer therapeutics. Dis Model Mech2008; I (2-3) : 78-82)。為此，ー些學(xué)者另辟蹊徑，采用將人體新鮮腫瘤組織直接植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)構(gòu)建原代瘤異種移植腫瘤模型(Morton CL, Houghton PJ. Establishment ofhuman tumor xenografts in immunodef icient mice. Nat Protoc 2007;2(2):247-50)、(Sausville EA, Burger AM. Contributions of human tumor xenografts to anticancerdrug development. Cancer Res 2006; 66 (7) : 3351-4，discussion 4)。初步的研究結(jié)果顯示，三維生長條件下構(gòu)建的原代瘤異種移植腫瘤模型能更好地模擬腫瘤細(xì)胞在人體內(nèi)的實(shí)際生長狀況。原代瘤異種移植腫瘤模型不僅能更好地反映腫瘤細(xì)胞在人體內(nèi)的生長特性，而且能在保持性狀穩(wěn)定的前提下傳代擴(kuò)增及長期保存。由此可見，建立原代瘤異種移植腫瘤模型不僅有助于加深對(duì)腫瘤生長規(guī)律的了解和認(rèn)識(shí)，而且可望籍此建立更為貼近臨床實(shí)際治療效果的抗腫瘤藥物篩選平臺(tái)，其在未來腫瘤研究中的重要性是不言而喻的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種食管鱗癌原代瘤株CH-H-2的應(yīng)用，該原代瘤株CH-H-2可通過N0D/SCID小鼠多次傳代,對(duì)于解決遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移這個(gè)目前食管鱗癌治療中無法回避的瓶頸問題，具有重要意義，是食管鱗癌基礎(chǔ)研究和臨床前期應(yīng)用的理想対象。本發(fā)明的一種食管鱗癌原代瘤株CH-H-2的應(yīng)用，用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生食管鱗癌細(xì)胞。所述原代瘤株CH-H-2還包括原代瘤株的子代腫瘤組織。所述哺乳動(dòng)物為小鼠。 所述小鼠為N0D/SCID小鼠。所述原代瘤株CH-H-2及其子代腫瘤組織的制備方法包括(1)N0D/SCID小鼠于接種前Id接受鈷60-Y射線輻照預(yù)處理，輻照劑量為2. 5Gy/只；(2)腹腔注射戊巴比妥鈉麻酔小鼠，將原代食管鱗癌組織剪成小組織塊，背部皮下接種小鼠，產(chǎn)生第一代移植瘤，成瘤率100% ；(3)第一代移植瘤直徑超過IOmm后，處死荷瘤小鼠；將瘤組織剪成小塊并再次皮下接種N0D/SCID小鼠，產(chǎn)生第二代移植瘤，其余移植瘤組織冷凍保存，重復(fù)該過程直至第40代移植瘤形成并進(jìn)行性質(zhì)鑒定，冷凍保存。有益效果(I)本發(fā)明的食管鱗癌原代瘤株性狀穩(wěn)定，可通過N0D/SCID小鼠多次傳代；(2)本發(fā)明的食管鱗癌原代瘤株具有臨床上食管鱗癌的生物學(xué)性狀，具備高轉(zhuǎn)移潛能的特性。對(duì)于解決遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移這個(gè)目前食管鱗癌治療中無法回避的瓶頸問題，具有重要意義，是食管鱗癌基礎(chǔ)研究和臨床前期應(yīng)用的理想對(duì)象。


圖I為原代食管鱗癌(左)與第40代瘤株移植瘤(右)組織大體形態(tài)HE染色(a)、p75 (NTR) (b)、p63 (C)、^ 1-integrin (d)和 ^ 4-integrin (e)的比較圖；圖2為原代食管鱗癌(左)和第40代移植瘤(右)的組織石蠟切片，Ki-67免疫組化染色； 圖3為原代食管鱗癌(左)和第40代移植瘤(右)的組織石蠟切片，PCNA免疫組化染色； 圖4為原代食管鱗癌(左)和第40代移植瘤(右)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)的増殖指數(shù)；圖5為原代食管鱗癌(左)和第40代移植瘤(右)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)的凋亡指數(shù)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例II.原代食管鱗癌異種移植腫瘤瘤株的建立(I)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物N0D/SCID小鼠，4-6周齡，雌雄不拘，購自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。(2)腫瘤組織取自于第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院胸心外科2006年10月進(jìn)行手術(shù)的I例48歲男性III a期食管鱗癌患者的新鮮食管腫瘤組織標(biāo)本。(3)原代瘤異種移植成瘤及傳代擴(kuò)增①N0D/SCID小鼠于接種前Id接受鈷60- y射線輻照預(yù)處理，輻照劑量為2. 5Gy/只。②腹腔注射戊巴比妥鈉(0.05mg/g體重)麻酔小鼠，原代食管鱗癌組織剪成約3X3X3mm的小組織塊，背部皮下接種小鼠，產(chǎn)生第一代(Fl)移植瘤，成瘤率100%。③Fl移植瘤直徑超過IOmm后，處死荷瘤小鼠。將瘤組織剪成約3X 3X 3mm的小塊并再次皮下接種N0D/SCID小鼠，產(chǎn)生第二代(F2)移植瘤，其余移植瘤組織冷凍保存。重復(fù)該過程直至第40代(F40)移植瘤形成并進(jìn)行性質(zhì)鑒定。(4)移植瘤深低溫保存及復(fù)蘇后成瘤①取各傳代移植瘤組織，將其剪成約IXlXlmm的小組織塊，DMEM培養(yǎng)基漂洗組織，500rpm離心5min，棄上清。組織塊按體積比I : I加入保護(hù)液(含20%胎牛血清及10%DMS0的DMEM培養(yǎng)基)，混勻后分裝于多個(gè)凍存管內(nèi)。凍存管于4°C預(yù)冷lOmin，隨后置于程控降溫儀內(nèi)并按以下程序降溫4°C起始，-0. 50C /min至_30°C，隨后_5°C /min至-100°C，取出凍存管置于液氮罐中保存。@移植瘤組織凍存1，6，12，24月后分別取出？1{10{20{30{40各ー支凍存管，37°C水浴中迅速解凍，DMEM培養(yǎng)基清洗組織后，500rpm離心5min去上清，按照前述方法取組織塊皮下接種NOD/SCID小鼠，比較不同凍存時(shí)間對(duì)移植瘤組織成瘤能力的影響。本研究發(fā)現(xiàn)直至第40代(F40)凍存24個(gè)月的瘤株成瘤率與原代瘤株及其他各代瘤株成瘤率無區(qū)別，均為100%o2.原代食管鱗癌異種移植腫瘤瘤株的性質(zhì)鑒定(I)瘤株表型分析取原代食管鱗癌和對(duì)應(yīng)的FI、F10、F20、F30、F40移植瘤的組織，固定后行常規(guī)石臘包埋切片，HE染色比較不同來源瘤組織大體形態(tài)；p75(NTR)、p63、involucrin、3 1-integrin和P 4-integrin免疫組化染色 比較蛋白表達(dá)水平及陽性細(xì)胞分布情況。結(jié)果證實(shí)各傳代瘤株在表型分析與原代腫瘤無明顯差別。(圖I)(2)瘤株增殖能力分析①取原代食管鱗癌和對(duì)應(yīng)的FI、F5、F10、F15、F20、F30、F40移植瘤的組織石蠟切片，Ki-67、PCNA染色比較不同來源瘤組織中增殖細(xì)胞比例；TUNEL染色比較腫瘤細(xì)胞凋亡率。結(jié)果證實(shí)各傳代瘤株在増殖細(xì)胞比例、腫瘤細(xì)胞凋亡率無顯著差異。(圖2、圖3)②取原代食管鱗癌和對(duì)應(yīng)Fl、FlO、F20、F30、F40移植瘤的新鮮組織，將其剪成約IXlXlmm的小組織塊，IV型膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化獲得單細(xì)胞懸液，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同來源腫瘤細(xì)胞的増殖指數(shù)(細(xì)胞周期分析法)和凋亡指數(shù)(AnnexinV/7-AAD雙標(biāo)法)。結(jié)果證實(shí)各傳代瘤株在増殖指數(shù)、凋亡指數(shù)無顯著差異。(圖4、圖5)以上結(jié)果表明食管鱗癌原代異種移植瘤株CH-H-2不僅能更好地反映腫瘤細(xì)胞在人體內(nèi)的生長特性，而且能在保持性狀穩(wěn)定的前提下傳代擴(kuò)增及長期保存。該瘤株的建立不僅有助于加深對(duì)腫瘤生長規(guī)律的了解和認(rèn)識(shí)，而且可望籍此建立更為貼近臨床實(shí)際治療效果的抗腫瘤藥物篩選平臺(tái)。
權(quán)利要求
1.一種食管鱗癌原代瘤株CH-H-2的應(yīng)用，其特征在于用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生食管鱗癌細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種食管鱗癌原代瘤株CH-H-2的應(yīng)用，其特征在于所述原代瘤株CH-H-2還包括原代瘤株的子代腫瘤組織。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種食管鱗癌原代瘤株CH-H-2的應(yīng)用，其特征在于所述原代瘤株CH-H-2及其子代腫瘤組織的制備方法包括 (DNOD/SCID小鼠于接種前Id接受鈷60-Y射線輻照預(yù)處理，輻照劑量為2. 5Gy/只； (2 )腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，將原代食管鱗癌組織剪成小組織塊，背部皮下接種小鼠,產(chǎn)生第一代移植瘤,成瘤率100% ； (3)第一代移植瘤直徑超過IOmm后，處死荷瘤小鼠；將瘤組織剪成小塊并再次皮下接種NOD/SCID小鼠，產(chǎn)生第二代移植瘤，其余移植瘤組織冷凍保存，重復(fù)該過程直至第40代移植瘤形成并進(jìn)行性質(zhì)鑒定，冷凍保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種食管鱗癌原代瘤株CH-H-2的應(yīng)用，其特征在于所述哺乳動(dòng)物為小鼠。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種食管鱗癌原代瘤株CH-H-2的應(yīng)用，其特征在于所述小鼠為NOD/SCID小鼠。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種食管鱗癌原代瘤株CH-H-2用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生食管鱗癌細(xì)胞。本發(fā)明原代瘤株CH-H-2可通過NOD/SCID小鼠多次傳代，對(duì)于解決遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移這個(gè)目前食管鱗癌治療中無法回避的瓶頸問題，具有重要意義，是食管鱗癌基礎(chǔ)研究和臨床前期應(yīng)用的理想對(duì)象。
文檔編號(hào)C12N5/09GK102766600SQ20121023275
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者倪逸倩, 李白翎, 袁揚(yáng), 陶婧, 黃盛東, 龔德軍 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)