本發明涉及一種用于蛋白傳遞的脂質納米粒子，尤其涉及一種用于將如治療用蛋白(therapeutic?protein)或酶替代療法(enzyme?replacement?therapy，ert)酶等多種醫用蛋白傳遞到細胞內或體內的脂質納米粒子。

背景技術：

1、近年來，脂質納米粒子(lipid?nanoparticle，lnp)作為一種用于在體內有效地傳遞如信使核糖核酸(mrna)等生物分子的系統而備受人們的關注，而如上所述的脂質納米粒子為了可以穩定地將物質傳遞到體內而包含如磷脂、膽固醇、各種離子性脂質以及含聚乙二醇(peg)的磷脂等。

2、此外，溶酶體貯積癥(lysosomal?storage?disorders，lsds)是一種因為溶酶體功能缺陷而導致的相對罕見的遺傳性代謝疾病。溶酶體貯積癥(lsds)通常是因為溶酶體中參與代謝產物的分解的單一酶的缺乏而引起。因為酶活性不足而導致的產物貯積會對多種器官系統造成影響，而且還可能會導致嚴重的癥狀以及過早死亡。溶酶體貯積癥(lsds)中的大部分還伴有從進行性神經退行性變、重度認知損傷乃至于癲癇、行為障礙以及精神障礙等重要的神經系統相關病癥。

3、作為如上所述的溶酶體貯積癥的代表性疾病，包括如法布里病、戈謝病以及黏多糖貯積癥等，而酶替代療法(ert)已經成為了標準的治療方法，如上所述的酶替代療法可以通過定期靜脈注射體內所缺乏的酶蛋白而起到降低細胞內貯積的處于有害水準的物質濃度的作用(concolino?et?al.,italian?journal?of?pediatrics,2018)。

4、但是，為了提升如上所述的酶替代療法的治療效率，必須開發出一種可以減少如非期望的免疫反應等副作用，還可以有效且穩定地將酶蛋白傳遞到細胞內的傳遞系統。這是因為可以借此降低酶的給藥濃度或最大限度地減少抗-藥物抗體(anti-drug?antibody)反應。

技術實現思路

1、本發明的一示例性目的在于提供一種用于將蛋白傳遞到細胞內或體內的脂質納米粒子。

2、本發明的另一示例性目的在于提供一種包封有蛋白的脂質納米粒子。

3、本發明的又一示例性目的在于提供一種包含包封有蛋白的脂質納米粒子的蛋白的細胞內或體內傳遞用組合物。

4、本發明的又一示例性目的在于提供一種包含包封有蛋白的脂質納米粒子的溶酶體貯積癥預防或治療用藥學組合物。

5、本發明的又一示例性目的在于提供一種包封有蛋白的脂質納米粒子的制造方法。

6、本發明的又一示例性目的在于提供一種利用脂質納米粒子將酶替代療法(ert)酶或治療用蛋白傳遞到細胞內的方法。

7、本發明的又一示例性目的在于提供一種利用包封有酶替代療法(ert)酶或治療用蛋白的脂質納米粒子的疾病治療方法。

8、本說明書中所公開的擬根據本發明的技術思想達成的技術課題并不限定于用于解決在上述內容中提及的問題的課題，一般的技術人員將可以通過下述記載進一步明確理解未被提及的其他課題。

9、接下來，將對其進行詳細的說明。此外，在本技術中公開的各個說明以及實施形態也可以適用于各個其他說明以及實施形態。即，在本技術中公開的多種要素的所有組合都包含于本技術的范疇之內。此外，并不應該認定為本技術的范疇限定于在下述內容中記載的具體的敘述。

10、作為用于達成本發明之目的的一形態，本發明提供一種用于將蛋白傳遞到體內的脂質納米粒子。具體來講，本發明提供一種包含由氫化大豆磷脂酰膽堿(hspc)；膽固醇；二油酰基-3-三甲銨丙烷(dotap)；以及1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-甲氧基(聚乙二醇)(dspe-mpeg)組成的脂質混合物的用于將蛋白傳遞到細胞內或體內的脂質納米粒子。

11、本發明中的術語“脂質納米粒子(lipid?nanoparticle，lnp)”是指具有相鄰的脂質雙層的囊泡結構體，如球形囊泡，可用于向靶標位置進行傳遞。作為如上所述的脂質納米粒子，可以包含如脂質體、固態脂質納米粒子(sln)、納米結構化的脂質載體(nlc)以及單層膜結構體(膠束)等。

12、本發明的脂質納米粒子可以包含一種以上的脂質。作為一實例，可以包含如粒子性脂質、聚乙二醇(peg)-脂質、磷脂或膽固醇等。其中，粒子性脂質可以是陽離子性脂質。作為陽離子性脂質的一實例，包括如n-(2,3-二油酰氧基)丙基-n,n,n-三甲基銨氯化物(dotap)；n-(2,3-二油烯氧基)丙基-n,n,n-三甲基銨氯化物(dotma)；n,n-二硬脂酰-n,n-二甲基銨溴化物(ddab)；n,n-二油酰基-n,n-二甲基銨氯化物(dodac)；n-(1,2-二肉豆蔻酰氧基丙-3-基)-n,n-二甲基-n-羥乙基銨溴化物(dmrie)；n1,n3,n5-三(3-(雙十二烷基氨基)丙基)苯-1,3,5-三羧酰胺(tt3)、脂質體轉染試劑；1,2-二亞油酰氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、1,2-二亞油烯氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlendma)、二十八烷基二甲基銨(dodma)、二硬脂基二甲基銨(dsdma)、3-(n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)膽固醇(dc-chol)以及1,2-二油酰基-3-二甲基銨丙烷(dodap)等。

13、此外，還可以同時包含其他脂質成分。作為一實例，可以包含屬于磷脂酰膽堿(pc)類(例如，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿(dspc)以及1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺(dope))、甾醇(例如，膽固醇)以及聚乙二醇(peg)-脂質偶聯物(例如，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺-n-[葉酸(聚乙二醇)-2000(dspe-peg2000)]、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺-n-甲氧基(聚乙二醇)(dspe-mpeg)、l-α-氫化磷脂酰膽堿(hspc)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dppc)以及1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000(c14-peg2000)])的其他脂質分子。

14、具體來講，本發明的脂質納米粒子可以包含由氫化大豆磷脂酰膽堿(hspc)；膽固醇；二油酰基-3-三甲銨丙烷(dotap)；以及1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-甲氧基(聚乙二醇)(dspe-mpeg)組成的脂質混合物。

15、脂質納米粒子內的如上所述的各個脂質的比例并不受到特殊的限定，例如氫化大豆磷脂酰膽堿(hspc)可以占據脂質納米粒子內脂質混合物的8至15摩爾％，膽固醇可以占據脂質納米粒子內脂質混合物的30至50摩爾％，二油酰基-3-三甲銨丙烷(dotap)可以占據脂質納米粒子內脂質混合物的40至60摩爾％，而1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-甲氧基(聚乙二醇)(dspe-mpeg)可以占據脂質納米粒子內脂質混合物的0.5至5摩爾％。更較佳地，氫化大豆磷脂酰膽堿(hspc)可以占據脂質納米粒子內脂質混合物的9摩爾％，膽固醇可以占據脂質納米粒子內脂質混合物的40摩爾％，二油酰基-3-三甲銨丙烷(dotap)可以占據脂質納米粒子內脂質混合物的50摩爾％，而1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-甲氧基(聚乙二醇)(dspe-mpeg)可以占據脂質納米粒子內脂質混合物的1摩爾％。

16、此外，所述脂質混合物中的氫化大豆磷脂酰膽堿(hspc):膽固醇:二油酰基-3-三甲銨丙烷(dotap):1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-甲氧基(聚乙二醇)(dspe-mpeg)的摩爾比可以是8-15:30-50:40-60:0.5-5，較佳地，脂質混合物中的氫化大豆磷脂酰膽堿(hspc):膽固醇:二油酰基-3-三甲銨丙烷(dotap):1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-甲氧基(聚乙二醇)(dspe-mpeg)的摩爾比可以是8-10:35-45:45-55:0.5-1.5，更較佳地，脂質混合物中的氫化大豆磷脂酰膽堿(hspc):膽固醇:二油酰基-3-三甲銨丙烷(dotap):1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-甲氧基(聚乙二醇)(dspe-mpeg)的摩爾比可以是9:40:50:1，但是并不限定于此。

17、可以在所述范圍內根據包封到脂質納米粒子中的蛋白的類型適當選擇最佳的摩爾比或摩爾％，作為一實例，在將人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(human?iduronate-2-sulfatase，ids)包封到脂質納米粒子的情況下，較佳地，脂質混合物中的氫化大豆磷脂酰膽堿(hspc):膽固醇:二油酰基-3-三甲銨丙烷(dotap):1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-甲氧基(聚乙二醇)(dspe-mpeg)的摩爾比可以是9:40:50:1。

18、在本發明中，脂質納米粒子的離子大小可能會對藥物釋放速度、生物分布、黏膜黏附力、細胞的水分吸收以及向納米粒子內部的緩沖劑交換以及蛋白擴散造成影響。作為一實例，脂質納米粒子(lnp)的直徑可以在10至500nm的范圍之內，較佳地，可以在70至120nm的范圍之內，更較佳地，可以在75至95nm的范圍之內。

19、在本發明中，脂質納米粒子的多分散指數(poly?dispersity?index，pdi)是對脂質混合物的分子或粒子大小的不均勻性進行測量的結果，作為一實例，脂質納米粒子的多分散指數(pdi)可以在0.1至0.4的范圍之內，較佳地，可以在0.1至0.2的范圍之內，更較佳地，可以在0.15至0.18的范圍之內。

20、在本發明中，所述蛋白的適用并不受到特殊的限定，作為一實例，可以包含酶或治療用蛋白(therapeutic?protein)。所述治療用蛋白是指用于對疾病或障礙進行治療或預防的蛋白，可以是如重組蛋白、抗體、生物類似藥以及生物改良藥等。在本發明中，所述酶的適用并不受到特殊的限定，可以是體內缺乏或缺如的酶，尤其是，所述酶可以是酶替代療法(enzyme?replacement?therapy，ert)酶。

21、在本發明中，所述酶的適用并不受到特殊的限定，可以是體內缺乏或缺如的酶，尤其是，所述酶可以是酶替代療法(enzyme?replacement?therapy，ert)酶。

22、作為用于達成本發明之目的的另一形態，本發明提供一種包封(encapsulated)有包含由氫化大豆磷脂酰膽堿(hspc)；膽固醇；二油酰基-3-三甲銨丙烷(dotap)；以及1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-甲氧基(聚乙二醇)(dspe-mpeg)組成的脂質混合物的蛋白的脂質納米粒子。

23、所述“脂質納米粒子”以及“蛋白”如上所述。

24、本發明中的術語“酶替代療法(enzyme?replacement?thearpy)”是一種將體內缺乏的酶直接注射到患者靜脈的治療方法。這是對被稱之為溶酶體貯積癥(lsd)的如法布里病、戈謝病、龐貝病以及亨特綜合征等疾病的代表性的治療方法，而且還用于對如因為腺苷脫氨酶缺乏癥(adenosine?deaminase?deficiency)而導致的重癥聯合免疫缺陷(ada-scid)等罕見的先天性綜合征進行治療。此外，酶替代療法還可以在如底物減少療法、基因治療以及骨髓來源干細胞移植等中發生酶或蛋白缺乏時加以利用。

25、在本發明中，作為一實例，所述酶是可以是用于對溶酶體貯積癥進行治療的溶酶體酶，例如，可以是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(idursulfase)、拉羅尼酶(laronidase)、依洛硫酸酯酶α(elosulfase?alpha)、加硫酶(galsulfase)、維斯特羅尼酶α(vestronidasealpha)、阿加糖酶β(agalsidase?beta)、阿加糖酶α(agalsidase?alpha)、培尼加酶α(pegunigalsidase?alpha)、伊米苷酶(imiglucerase)、他利苷酶α(taliglucerasealpha)、阿糖苷酶(alglucerase)、維拉苷酶(velaglucerase)、葡萄糖苷酶α(alglucosidase?alpha)、阿伐葡萄糖苷酶α(avalglucosidase?alpha)、塞維利帕酶α(sebelipase?alpha)、賽立福酶α(cerliponase?alpha)或腺苷脫氨酶(adenosinedeaminase)，但是并不限定于此。

26、具體來講，所述酶可以通過在將酶基因克隆到載體上而制作出表達質粒之后將表達質粒轉染到宿主細胞并進行培養，接下來篩選出生產性較高的酶表達單克隆細胞株并進行培養，然后對蛋白進行分離以及提純的方式獲得。

27、在本發明中，所述酶可以用于對溶酶體貯積癥進行治療或預防。溶酶體是一種可以起到對在體內生成的物質中需要的成分進行分配并對不需要的成分進行排出的作用的細胞內的細胞器。

28、但是，當體內的酶不足時，溶酶體將無法正常起到所述作用，而在如上所述的情況下，雜質將在體內貯積并引起身體組織和器官的損傷。

29、目前已經得知的溶酶體貯積癥多達50多種。這是因為遺傳缺陷而導致溶酶體內特定酶的生成受到抑制，從而導致體內產物的堆積并最終對如骨骼、大腦、皮膚、心臟以及中樞神經系統等造成嚴重影響的疾病。

30、具體來講，所述溶酶體貯積病可以是黏多糖貯積癥i型(mps?i)、黏多糖貯積癥ii型(mps?ii)、黏多糖貯積癥iva型(mps?iva)、黏多糖貯積癥vi型(mps?vi)、黏多糖貯積癥vii型、法布里病、戈謝病、戈謝病i型、龐貝病、溶酶體酸性脂質分解酶缺乏癥(wolmandisease，cesd)、神經蠟樣脂褐質沉積癥(cln2病)或重癥聯合免疫缺陷，但是并不限定于此。

31、作為一實例，法布里病(fabry?disease)是一種因為溶酶體酶即α-半乳糖苷酶a(α-gal?a)的α-半乳糖苷酶a(α-gal?a)基因(gla)內突變而導致其缺乏并因此引起的糖鞘脂代謝進行性x-連鎖先天性缺陷。盡管x-連鎖疾病，但是女性也可能會出現不同程度的臨床癥狀。法布里病是一種據估計在男性中的發病率只有1/40,000，而在所有人口中的發病率只有1/117,000的罕見疾病。對于法布里病患者來講，在不接受治療的情況下，預期壽命會縮短，而且因為對腎臟、心臟和/或中樞神經系統造成影響的血管疾病，大概會在40多歲或50多歲死亡。酶缺乏會導致全身的血管內皮以及內臟組織的底物即球狀三己糖神經酰胺(gl-3)在細胞內貯積。

32、因為法布里病而引起的心臟疾病會出現在大多數男性以及很多女性患者。初期的心臟疾病癥狀包括左心室擴大、瓣膜受累以及傳導異常。主動脈瓣關閉不全是典型地出現在兒童期或青少年期的最常見的瓣膜病變。腦血管癥狀主要是由多灶性小血管受累所引起，可能包括如血栓、短暫性腦缺血發作、腦底動脈缺血以及動脈瘤、癲癇、偏癱、單側感覺喪失、失語癥、迷路障礙或腦出血。腦血管癥狀的平均發病年齡為33.8歲。伴隨著年齡的增長，可能會出現性格變化以及精神疾病行為。

33、對于法布里病來講，目前已經獲得美國食品藥品監督管理局(fda)批準的治療方法為酶替代療法(ert)，包括如阿加糖酶α(夏爾人類基因療法公司(shirehuman?genetic?therapies))、阿加糖酶β(健贊公司(genzymecorporation))以及培古尼加酶α(普羅塔利克斯生物治療公司(protalixbiotherapeutics,inc))等。這種類型的酶替代療法(ert)是通過靜脈注射酶的重組形態而對患者的不足的α-半乳糖苷酶a(α-gal?a)活性進行補充。雖然酶替代療法(ert)在很多情況下有效，但是在治療方面仍然存在局限性。目前還沒有證據證明酶替代療法(ert)可以降低中風的風險，而且心臟肌肉的反應遲緩，進而在腎臟的一部分細胞類型中去除球狀三己糖神經酰胺(gl-3)存在局限性。一部分患者還會對酶替代療法(ert)表現出免疫反應。

34、作為另一實例，戈謝病(gaucher?disease)也是一種代表性的溶酶體貯積癥，是因為溶酶體的水解酶即β-葡糖腦苷脂酶(β-glucocerebrosidase；β-gc)缺乏而導致鞘脂(sphingolipid)的一種即糖脂葡糖腦苷脂(glucocerebroside)主要貯積在如肝臟、脾臟、中樞神經系統、骨骼以及肺部等網狀內皮系統(reticuloendothelial?system)并因此引起的疾病，也是最常見的脂質貯積病。

35、戈謝病是因為葡糖腦苷脂酶基因(gba)的基因變異而引起的疾病，呈常染色體隱性遺傳，而且會根據葡糖腦苷脂酶基因(gba)酶活性的缺乏程度呈現出不同嚴重程度的臨床癥狀。戈謝病曾經按照克努森(knudsen)以及卡普蘭(kaplan)的分類方法，根據中樞神經系統受累與否、疾病的進展速度以及發病年齡劃分為三種臨床類型，而最近則將其分類為無神經系統侵犯型(non-neuronopathic)以及急性(acute)或慢性(chronic)神經系統侵犯型(neuronopathic)等三種類型。此時，無神經系統侵犯型被稱之為1型，急性神經系統侵犯型被稱之為2型，而慢性神經系統侵犯型則被稱之為3型。

36、酶替代療法(enzyme?replacement?therapy)是一種對戈謝病的治療效果已經得到證實的典型的治療方法，尤其是已經得知其在無神經系統侵犯型以及慢性神經系統侵犯型的戈謝病中對于肝臟脾臟腫大以及血液學表現來講有很大的幫助。戈謝病是可以體現出重組酶治療效果的疾病，自從酸性β-葡糖苷酶(acidβ-glucosidase?enzyme)即伊米苷酶(imiglucerase,genzyme?co.)通過脫氧核糖核酸(dna)重組技術從1994年開始實現商業化以來，迄今為止一直作為無神經系統侵犯的i型(type?i)戈謝病的標準治療方法(standard?treatment)使用。

37、在韓國，也開發出了伊米苷酶(imiglucerase)的生物類似藥(biosimilar)即(isu?abxis，城南，韓國)并實現了商業化以及投入使用，此外還使用(takeda?pharmaceutical?company，東京，日本)作為重組酶制劑使用。如上所述的重組酶可以改善網狀內皮系統的癥狀，從而進一步改善肝臟/脾臟腫大。但是，因為如上所述的酶制劑無法穿過腦血管屏障，因此并不能組織神經系統侵犯型戈謝病患者的神經系統癥狀的進展。此外，已經得知對于腹部或縱隔等部位的淋巴結腫大較為嚴重的患者，其治療效果也存在局限性。

38、作為另一實例，還有如黏多糖貯積癥(mps)i型、ii型、iva型、vi型以及vii型等。

39、黏多糖貯積癥i型(mps?i)是一種估計發病率只有1/100,000的罕見的隱性遺傳疾病(moore?d?et?al.，2008,orphanet?journal?of?rare?diseases?3)。黏多糖貯積癥i型(mps?i)是因為非常常見的復合多糖即硫酸乙酰肝素以及硫酸皮膚素的溶酶體代謝作用所需要的酶即α-1-艾杜糖苷酶(idua)的缺乏所引起的。被稱之為糖胺聚糖(glycosaminoglycan，gag)的如上所述的多糖會在黏多糖貯積癥i型(mps?i)患者的組織中貯積，從而引起特殊的貯積性病變以及多種疾病后遺癥。患者可能會表現出身材矮小、骨骼和以及節畸形、面部粗糙、肝脾腫大、腭裂疾病、阻塞性睡眠呼吸暫停、反復上呼吸道感染、聽力障礙、腕管綜合征以及因為角膜混濁導致的視力障礙(beck?m,et?al.,2014,thenatural?history?of?mps?i:global?perspectives?from?the?mps?i?registry.geneticsin?medicine:official?journal?of?the?american?college?of?medical?genetics?16(10):759-765)。此外，很多患者會出現與中樞神經系統中的糖胺聚糖(gag)貯積相關的癥狀，這可能包括腦積水、脊髓壓迫以及一部分患者中的認知障礙。

40、黏多糖貯積癥ii型(亨特綜合征/mps?ii)是一種男性新生兒中的發病率只有0.5至1.3/100,000的罕見的x-連鎖隱性遺傳病。如上所述的進行性以及毀滅性(devastating)疾病是因為人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(ids)基因的基因突變而引起，會進一步導致硫酸乙酰肝素(heparan?sulfate)以及硫酸皮膚素(dermatan?sulfate)的溶酶體代謝作用所需要的酶即溶酶體貯積酶即人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase)的缺乏。

41、稱之為糖胺聚糖(gag)的這種非常普遍(ubiquitous)的多糖會貯積到黏多糖貯積癥ii型(mps?ii)患者的組織以及器官中，從而引起特殊的貯積性病變以及多種疾病后遺癥。這個患者集團中的患病率以及死亡率都很高。有報告指出，(以神經認知惡化作為特征的)死亡在重癥表現型患者中發生的平均年齡為11.7歲，而在輕癥或者弱化表現型患者發生的平均年齡為21.7歲。

42、黏多糖貯積癥iva型(mps?iva；莫奎歐a綜合征)是一種因為n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(galns)的缺乏而引起的常染色體隱性溶酶體貯積癥(khan,等，mol?genet?metab.,2017；120(1-2):78-95)。所述酶的缺乏會導致糖胺聚糖(gag)、硫酸軟骨素6-硫酸鹽(c6s)以及硫酸角質素(ks)逐漸積累并引起因為不完全骨化以及連續的生長失衡而導致的全身獨特的骨骼畸形癥，最終造成短頸短軀干、頸椎脊髓壓迫、氣管堵塞、雞胸、關節松弛、脊柱后側凸、髖外翻以及膝外翻。所述疾病的其他臨床表現還可能包括聽力喪失、心臟瓣膜病變以及角膜混濁。在患者中已經觀察到了200種以上的不同的突變，而在美國的發病率大約為1/250,000。

43、通過將根據本發明的脂質納米離子適用于酶替代療法，可以對所述溶酶體貯積癥進行治療。因此，從如上所述的觀點上來講，本發明提供一種利用酶替代療法(ert)酶的疾病疾病方法。此外，除了所述溶酶體貯積癥之外，還可以有效地向體內傳遞所缺乏或水平較低的蛋白，從而對各種疾病進行治療以及預防。因此，利用搭載有治療用蛋白的本發明的脂質納米粒子，可以提供多種疾病的治療方法。如上所述的治療方法，可以通過將搭載到脂質納米粒子內的酶替代療法(ert)酶或治療用蛋白傳遞到細胞內的方式達成。

44、作為用于達成本發明之目的的另一形態，本發明提供一種包含所述包封有蛋白或酶的脂質納米粒子的蛋白的細胞內或體內傳遞用組合物。

45、所述“蛋白”以及“脂質納米粒子”如上所述。

46、本發明中，所述組合物還可以追加包含用于提升包封有蛋白或酶的脂質納米粒子的細胞內或體內傳遞效率的物質，或者通過追加改良而對組合物的形態進行變形。

47、作為用于達成本發明之目的的另一形態，本發明提供一種包含所述包封有蛋白的脂質納米粒子的溶酶體貯積癥預防或治療用組合物。

48、所述“蛋白”、“脂質納米粒子”以及“溶酶體貯積癥”如上所述。

49、本發明中的術語“預防”是指通過本發明的藥學組合物的給藥而抑制或延緩溶酶體貯積癥的發病的所有行為，而本發明中的術語“治療”是指通過本發明的藥學組合物的給藥而使得疾病發生好轉、緩解或有益變化的所有行為。

50、本發明中的術語“藥學組合物”是指以疾病的預防或治療為目的制造出來的物質，可以分別按照通常的方法制劑化成多種形態使用。例如，可以根據給藥途徑制劑化成如散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、混懸液、乳液以及糖漿等口服劑型，也可以制劑化成外用制劑以及無菌注射溶液的形態使用。具體來講，所述給藥途徑可以包括局部途徑、口服途徑、靜脈內途徑、肌肉內途徑以及通過黏膜組織的直接吸收在內的任意適當的途徑，而且還可以將兩種以上的途徑組合使用。兩種以上的途徑組合的實例是指根據給藥途徑對兩種以上劑型的藥物進行組合的情況，例如可以是首先將某一種藥物通過靜脈內途徑進行給藥，接下來將另一種藥物通過局部途徑進行給藥的情況。

51、本發明的藥學組合物，可以被制造成追加包含在藥學組合物的制造中通常使用的適當的載體、賦形劑或稀釋劑的癌癥治療或預防用藥學組合物的形態，而所述載體可以包含非天然存在的載體(non-naturally?occuring?carrier)。具體來講，所述藥學組合物可以分別按照通常的方法制劑化成如散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、懸浮劑、乳劑、糖漿以及氣霧劑等口服劑型和外用劑、栓劑以及無菌注射溶液的形態使用。藥學組合物的具體的制劑化方法屬于本行業所公知的內容，例如可以參考[remington's?pharmaceutical?sciences(19th?ed.,1995)]等。所述文獻被視為本說明書的一部分。

52、本發明的藥學組合物可以通過多種途徑向如大鼠、狗、貓、牛、馬、豬以及人等動物進行給藥，較佳地可以是人。給藥的所有方式都是可以預想到的，例如可以通過口服、靜脈、動脈、肌肉或皮下注射進行給藥，但是并不限定于此。

53、在本發明中，所述治療方法還包括與目前已知的治療療法的組合或與目前已知的其他治療劑的聯合給藥。

54、作為用于達成本發明之目的的另一形態，本發明提供一種包封有蛋白的脂質納米粒子的制造方法以及通過如上所述的方法獲取到的納米粒子。具體來講，所述包封有蛋白的脂質納米粒子的制造方法，包括：(a)制造出包含氫化大豆磷脂酰膽堿(hspc)；膽固醇；二油酰基-3-三甲銨丙烷(dotap)；以及1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-甲氧基(聚乙二醇)(dspe-mpeg)的脂質混合物的步驟；(b)將所述脂質混合物被溶解到醇類溶劑而形成的第一溶液注入到(microfluidics)系統的注入口的步驟；(c)將包含蛋白的第二溶液注入到微流體系統的另一個注入口的步驟；以及，(d)對包封有蛋白的脂質納米粒子進行純化的步驟。

55、所述“蛋白”以及“脂質納米粒子”如上所述。

56、在本發明中，所述醇類溶劑可以包括甲醇、乙醇、丙醇或變性醇，但是并不限定于此，較佳地，可以是乙醇。

57、在本發明中，所述微流體系統的乙醇相(第一溶液)以及水相(第二溶液)的流速比例可以是以1:3至1:5的比例進行，但是并不限定于此，較佳地，可以是以1:3的比例進行。

58、在本發明中，所述微流體系統的流速可以是以9至18ml/分鐘的速度進行，但是并不限定于此，較佳地，可以是以15ml/分鐘的速度進行。

59、在本發明中，所述步驟(d)的對脂質納米粒子進行提純的步驟，可以包括：去除所述步驟(d)中的醇類溶劑以及未被包封的蛋白的步驟。所述脂質納米粒子的提純，可以是使用安裝有色譜柱的切向流過濾系統進行提純，具體來講，可以將脂質納米粒子通過色譜柱進行循環，并在按照與從色譜柱流出的透過液相同的速度添加新鮮的緩沖液(20mm的磷酸鈉、137mm的氯化鈉，ph值為6±0.2)的同時進行提純。

60、作為用于達成本發明之目的的另一形態，本發明提供一種利用脂質納米粒子將酶替代療法(ert)酶或治療用蛋白傳遞到細胞內的方法。

61、所述“酶替代療法(ert)”、“酶”、“治療用蛋白”以及“脂質納米粒子”如上所述。

62、作為用于達成本發明之目的的另一形態，本發明提供一種利用包封有酶替代療法(ert)酶或治療用蛋白的脂質納米粒子的疾病治療方法。

63、所述“酶替代療法(ert)”、“酶”、“治療用蛋白”以及“脂質納米粒子”如上所述。

64、在本發明中，所述“疾病”可以是溶酶體貯積癥。此外，除了所述溶酶體貯積癥之外，還可以有效地向體內傳遞所缺乏或水平較低的蛋白，從而對各種疾病進行治療以及預防。因此，利用包封有治療用蛋白或酶替代療法(ert)酶的本發明的脂質納米粒子，可以提供多種疾病的治療方法。

65、如上所述的治療方法，可以通過將包封到脂質納米粒子的酶替代療法(ert)酶或治療用蛋白傳遞到細胞內的方式達成。

66、本發明可以通過脂質納米粒子將治療用蛋白或酶替代療法(ert)酶等多種蛋白穩定且有效地傳遞到細胞內，從而有效地適用于如溶酶體貯積癥等多種疾病的治療以及預防。