本發明屬于生物制藥領域，涉及溫敏型水凝膠及其制備方法和應用。

背景技術：

1、子宮是由子宮內膜、肌肉組織和結締組織混合形成的。良好的子宮內膜是生殖和母嬰健康的前提和保障。宮腔操作或感染等因素引起的子宮內膜基底層損傷導致月經、不孕、反復妊娠丟失、不孕及其他婦科疾病，這嚴重影響了女性的心理和生理健康。宮腔粘連（intrauterine?adhesion，iuas），又稱為asherman癥，是由于子宮內膜對下基底層的損傷導致上功能層瘢痕組織形成而導致子宮腔部分或完全粘連，是子宮內膜基底層嚴重損傷的結果，并伴隨腹痛、月經過少、周期性盆腔痛和閉經，已成為造成女性不孕的第二大常見原因。宮腔粘連可分為妊娠相關操作或宮腔鏡手術后的原發性粘連，以及粘連松解術再次發生的繼發性粘連。導致iua的誘因有很多，宮腔粘連被認為是一種由于子宮創傷而引發的醫源性疾病，隨著宮內手術如擴張、妊娠刮宮、宮腔鏡檢查和子宮內膜息肉切除術等的增多，其發病率也呈上升趨勢，對婦女的生育能力和心理健康產生嚴重影響。此外宮腔粘連的易感性可能與年齡、種族、營養狀況和感染過程等非特定因素有關，探討宮腔粘連的有效治療方法已成為當務之急。

2、目前，臨床實踐中宮腔粘連的治療方法包括：（1）宮腔鏡是目前診斷和治療宮腔粘連的金標準，因為其提供了一個良好的腔體視角，相對精準地描述了粘連的位置和程度，這給治療提供了極大的便利；（2）用于修復損傷子宮的方法還有在子宮腔內引入物理屏障如支架、球囊、導管等；（3）藥物治療子宮內膜損傷方面也有廣泛應用。有研究表明，無論是單獨使用雌激素或者作為輔助治療宮腔粘連，均會出現月經量增加。目前的這些手段均不能完全恢復子宮內膜的結構和功能。因此，迫切需要新的有效解決方法來改善受損子宮的結構和功能。

3、研究證實了骨髓源性干細胞、造血干細胞、子宮內膜間充質干細胞、胚胎干細胞、羊膜間充質干細胞、造血干細胞移植可有效促進iua動物模型或患者的子宮內膜再生和月經恢復，它們具有替代子宮內膜損傷細胞的潛力且對子宮內膜具有特異性。血管內皮生長因子（vegf）可以促進血管內皮細胞生長，加速內皮細胞向受傷部位的遷移，促進新生血管迅速重新填充被侵蝕的區域，完成組織重建。在iua患者或動物模型的子宮內膜組織中高表達的纖維化標志物，如tgf-β1/smad通路在iua發病機制的研究中起主導作用，因此可通過敲低tgf-β1的表達來抑制iua的發生。藥物療法和干細胞療法的共同缺點是應用于全身治療，在子宮內局部滯留率低，導致治療效果有限，而常規療法與生物材料的結合可以完美解決這一局限，一些常見的生物材料，如水凝膠和納米顆粒，可以提高藥物遞送效率并改善治療效果。在這些生物材料中，水凝膠已被探索用于子宮內膜傷口修復，并有良好的治療效果，顯示出強大的應用前景。專利202410017456.2公開了一種預防宮腔粘連水凝膠的制備方法，通過在甲基丙烯酸化透明質酸中引入多巴胺基團合成多巴胺修飾甲基丙烯酸化透明質酸；多巴胺基團的引入增加了水凝膠與子宮內膜的持續黏附能力，延長干細胞的滯留時間；并且多巴胺基團的接枝為水凝膠提供了與細胞作用的整合素位點，有利于增強水凝膠內干細胞的活力和分泌活性，從而進一步促進子宮內膜再生和改善生育力。

4、因此，開發一種新型的、高效的微環境響應性藥物遞送系統，對于提高宮腔粘連的治療效果具有重要意義。

技術實現思路

1、為解決上述問題，本發明提出一種基于透明質酸的溫敏型水凝膠sv@hp及其制備方法和應用。

2、本發明的技術方案是這樣實現的：

3、一方面，本發明提出一種基于透明質酸的溫敏型水凝膠sv@hp的制備方法，步驟如下：

4、（1）將ha用活化劑活化后與adh反應，反應結束后調ph為中性，透析，離心，凍干上清液即為ha-adh。

5、（2）將p407溶于有機溶劑ⅰ，加入三乙胺溶液，混勻后再加入甲基丙烯酰氯溶液，攪拌反應后將反應溶液ⅰ進行透析，透析液經冷凍干燥即得p407-mc；將p407-mc溶液與ha-adh溶液混合反應后得到的反應溶液ⅱ與p407溶液混合、浸泡得溫敏型水凝膠hp；

6、（3）向3，3’-二硫代二丙酸的dmf水溶液中加入綠原酸在edc和nhs存在條件下進行反應，得到ca-ss-cooh溶液；將氨基修飾的50?od?tgfβ1?sirna的dope水溶液滴加到cga-ss-cooh的水溶液中反應，透析，冷凍干燥，得到cs-sirna納米顆粒；

7、（4）將plga用有機溶劑ⅱ溶解后與vegf蛋白的去離子水溶液超聲混合形成水包油的白色乳液，將白色乳液分批加入pva溶液中并進行攪拌，得到vegf@plga微球；

8、（5）向溫敏型水凝膠hp溶液中同時加入cs-sirna納米顆粒和vegf@plga微球，攪拌均勻后形成溫敏型水凝膠sv@hp。

9、優選的，上述步驟（1）中ha與adh的摩爾比為1:500-5000；活化劑為edc和nhs，edc和nhs的摩爾比為1:1；反應溫度為10-40℃，反應時間為20-55?min。

10、優選的，上述步驟（2）中有機溶劑ⅰ為二氧六環溶液；p407、三乙胺、甲基丙烯酰氯的摩爾比為1:0.5-8:0.5-8；p407-mc與ha-adh的摩爾比為1:0.1-3；反應溶液ⅱ與p407溶液的體積比為1:2-30，p407溶液的質量百分比為15%?wt，反應溶液ⅱ中ha修飾的p407的質量百分比為15%?wt；混合反應條件為25-55℃水浴1-5?min。

11、優選的，上述步驟（3）中3，3’-二硫代二丙酸、edc、nhs和綠原酸的摩爾比為1:0.1-6:0.1-6:0.1-6；氨基修飾的50?od?tgfβ1?sirna與cga-ss-cooh的摩爾比為1:0.1-5；反應的條件為20-55℃下反應6-48?h。

12、優選的，步驟（4）中有機溶劑ⅱ為二氯甲烷；vegf與plga的質量比為1:5000-50000；pva溶液質量濃度為1-10%，攪拌的條件為500-5000?rpm下攪拌1-24?h。

13、優選的，上述步驟（5）中溫敏型水凝膠hp、cs-sirna納米顆粒和vegf@plga微球的摩爾比為500-50000:1:1-300；攪拌的溫度為15-60℃。

14、優選的，上述透析的透析袋型號為1000-12000?da、透析液為去離子水、透析時間為12-50?h。

15、第二方面，上述的溫敏型水凝膠sv@hp的制備方法制備的溫敏型水凝膠sv@hp。

16、第三方面，上述的溫敏型水凝膠sv@hp在抗炎、抗纖維化和促血管新生中的應用。

17、第四方面，上述的溫敏型水凝膠sv@hp在治療宮腔粘連、改善宮腔環境中的應用。

18、第五方面，上述的溫敏型水凝膠sv@hp在制備治療宮腔粘連藥物中的應用。

19、本發明具有以下有益效果：

20、1、本技術制備了一種基于透明質酸的溫敏型水凝膠sv@hp，用于實現微環境響應性藥物遞送治療宮腔粘連。sv@hp水凝膠的體外生物安全性和生物相容性良好，具有促進細胞增殖的作用；細胞劃痕實驗表明v@hp水凝膠和sv@hp水凝膠組的細胞遷移距離增加顯著，sv@hp水凝膠組幾乎完全閉合，證實sv@hp水凝膠具有良好的細胞遷移能力，有助于血管生成；

21、2、本技術通過倒置熒光顯微鏡觀察到cs@hp水凝膠的結數、網孔數和總長度低于v@hp水凝膠組，sv@hp水凝膠組表現出最佳的成管能力，證實vegf@plga微球能提高成管能力，促進血管生成和傷口愈合；將sv@hp水凝膠宮內注射進行治療，可形成物理屏障，藥物釋放后防止液體滲漏和粘連，同時提供基質環境前期抑制傷口的炎癥和纖維化，后期促進血管新生。h&e染色結果顯示，單純水凝膠組和載藥水凝膠組的iua大鼠子宮內膜厚度、血管和腺體數目均顯著增加。

22、3、本技術通過在體實驗發現載藥水凝膠sv@hp治療后的ki67和cd31的表達和共定位增加，表明有更強的血管新生，使得宮腔粘連部位的血管結構發育加快，血管生成反應迅速，刺激內皮細胞增殖和組織形成，促進血管生成因子上調，加速傷口愈合，更快上皮化，改善肉芽組織成熟和增強血管形成。