專利名稱：對映體羥基化黃嘌呤化合物的制作方法
技術領域：
本發明是有關羥基取代的黃嘌呤化合物異構體的發現，該化合物是調節細胞對通過立體專一的細胞第二信使途徑傳導的刺激的應答的有效劑。更具體講，本發明化合物是在3，7-二取代的黃嘌呤的1位上具有直鏈烷基(C5-8)取代的ω-1醇的R或S(優選R)對映體。本發明化合物是控制特異性sn-2不飽和磷脂酸以及應答細胞增生刺激和通過磷脂酸(PA)傳導而產生的相應的磷脂酸衍生的二酰基丙三醇的細胞體內含量的有用拮抗劑。
己酮可可堿(1-(5-氧代乙基)-3，7-二甲基黃嘌呤)(簡稱PTX)是醫學上廣泛用于增加血流量的黃嘌呤衍生物。美國專利3，422，307和3，737，443公開了PTX。PTX的代謝產物的總結見Davis等的Applied Environment Microbiol.48∶327，1984。PTX的一種代謝產物為1-(5-羥己基)-3，7-二甲基黃嘌呤(稱作M1)，以外消旋混合物形式存在。M1(外消旋混合物)已在美國專利4，515，795和4，576，947中被公開用作增加大腦血流量(與僅增加血流量不同)。此外，美國專利4，833，146和5，039，666公開了黃嘌呤的短鏈叔醇類似物用于增加大腦血流量。在以后的代謝研究中發現能夠發生代謝變化的PTX是S對映體。
此外，美國專利4，636，507描述了PTX和M1(外消旋混合物)對多形核白細胞應答趨化性刺激素的刺激趨化性能力。PTX和有關的叔醇取代的黃嘌呤抑制某些影響趨化性的細胞因子活性(美國專利4，965，271和5，096，906)。進行同種異體骨髓移植時給用PTX和GM-CSF可以降低病人的腫瘤壞死因子(TNF)濃度(Bianco et al.Blood 76Supplement 1(522A)，1990)。降低TNF的可測濃度能夠降低與骨髓移植相關的并發癥。但是對于正常自愿者，TNF濃度高于這些PTX受者。因而TNF濃度的升高不是產生這種并發癥的主要原因。
通常的作法是將具有手性中心的藥物以外消旋體形式銷售。M1代謝產物除其手性之外僅被公開。事實上，M1顯示出僅僅或主要以S異構體形式被制備(在人體內代謝)。以外消旋混合物形式制備和配料藥物的方法意味著每種藥物的各種劑量被等量通常沒有治療價值但可能會引起意料不到的副作用的異構體污染。例如，鎮靜藥酰胺哌啶酮以外消旋體形式銷售。所需的鎮靜活性屬于R-異構體，但污染物S-異構體是致畸胎物，使用這種藥物在嬰兒生產時會對母親產生分娩缺損。結核菌抑制藥乙胺丁醇的R，R-對映體能夠致盲。與非甾族抗炎藥苯噁丙酸(Oraflex
)有關的致死副作用已被通過出售純對映體形式的藥物而被避免。
對映體純的問題并不僅局限于藥學領域。例如，ASANA(1Pr二異丙基)是一合成擬除蟲菊酯殺蟲劑，包含有兩個不對稱中心。有效的殺蟲活性主要歸屬四種可能的立體異構體中一種。并且三種無殺蟲活性的立體異構體對某些植物種類顯示出毒性。因此，ASANA僅能以單一立體異構體形式出售，這是由于混合的立體異構體是不合適的。
因此，需要尋求一種對人或動物給藥既安全又有效的有效治療化合物，并能維持各種炎性刺激的表面內細胞體內平衡，并且活性歸屬于單一異構體的對映體純。本發明提供了尋找這種化合物的方法。
我們已發現本文所述化合物可用于維持與各種炎癥和增生刺激應答的各種靶細胞的體內平衡。此外，本發明化合物和藥物組合物適于常規途徑治療給藥(如口服，局部和非腸道給藥)并提供有效劑量。
本發明化合物和藥物組合物為拆分的在3，7-二取代黃嘌呤的1-位上具有直鏈烷基(C5-8)取代的ω-1醇的R或S(優選R)對映體。本發明化合物能有效地調節細胞對外部或原位的初次刺激的應答，以及對給用有效量這種化合物的具體給藥方式的應答。
本發明化合物包括具有下式黃嘌呤母核化合物的化合物和藥物組合物
其中R1獨立表示實質上不含其它異構體的拆分的對映體ω-1仲醇取代的烷基(C5-8)，并且R2和R3各自獨立表示可任意含有一個或兩個非相鄰的代替碳原子的氧原子的烷基(C1-12)。優選的R1是具有羥基的C6烷基的R對映體。
本發明還進一步提供了包含有一種本發明化合物和藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物，其中藥物組合物可被制成適于病人口服，非腸道或局部給藥的劑型。
本發明進一步提供了治療患有各種疾病病人的方法，其中所述疾病可通過抑制對外部或原位初次刺激的免疫應答或細胞應答來表征或治療，其中所述的細胞應答通過特異性磷脂堿化的第二信使作用相鄰的細胞的細胞膜的內部小葉來傳遞。第二信使途徑通過應答各種疾病狀態的不同有毒或增生刺激特性被活化，這種第二信使途徑的生化性質在此處被描述。更具體地說，本發明提供了通過利用此處所述的第二信使途徑抑制細胞信號反射來治療或預防各種疾病狀態的臨床癥狀的方法或降低其它療法的毒性。疾病狀態或由治療誘導的毒性癥狀選自應答活化致腫瘤基因的腫瘤細胞增生;由細胞減少療法引起的或由微生物因子感染引起的血細胞減少;由T細胞應答或B細胞應答以及抗體產物引起的自身免疫疾病;敗血性休克;間質細胞對腫瘤壞死因子(TNF)的抵抗;細胞活化非調節或非調節細胞生長，如平滑肌細胞，內皮細胞，纖維細胞及其它細胞種類應答生長因子如PDGF-AA，BB，FGF，EGF等而增生(即動脈粥樣硬化，再狹窄，中風，以及冠狀動脈疾病);人免疫缺陷病毒感染(艾滋病及艾滋病有關征候群);應答IL-1，mip-1α，PDGF或FGF的腎小球膜細胞增生導致的各種腎病，炎癥;應答環孢菌素A或兩性霉素B治療的腎小球或腎小管毒性;應答細胞減少治療(如細胞毒性藥物或輻射)的器官毒性(如胃腸或肺上皮毒性);應答由細胞表面金屬蛋白酶的產生表征的或由應答IgE的肥大細胞和嗜堿細胞的失粒表征的炎性刺激的變應性，由過多的破骨細胞活化因子(OAF)引起的骨病，由降低神經腎上腺素和乙酰膽堿的信號傳導而引起的CNS病，以及它們的結合病癥。
當細胞被刺激去表示特定的細胞因子或應答增生性或有害刺激的增生時，該過程通過特異性磷脂堿化的第二信使信號途徑傳遞。這種第二信使途徑引起含有sn-2非花生四烯酸酯不飽和現象的磷脂酸(PA)的亞群濃度升高，所述磷脂酸迅速轉換成其相應的二酰基丙三醇(DAG)。本發明化合物和藥物組合物特別抑制在上述第二信使途徑中所涉及的立體專一酶而不影響在細胞正常輔助功能中所涉及的其它第二信使途徑，如磷脂酰肌醇(PI)途徑。抑制一種或幾種在此處所述的第二信使途徑中所涉及的酶的結果就是靶細胞對刺激，尤其是有害刺激的應答的“調節”。生物化學活動(即抑制應答初次刺激的第二信使途徑酶如細胞因子的活性)產生細胞信號并引起一種對多種可變化疾病的作用，這種作用是反常的，炎性或有害細胞信號機理的結果。
附

圖1說明了CT1501R(R-(-)(5-羥基己基)-可可堿)和PTX的混合淋巴反應。混合淋巴反應說明在用兩種方式混合的淋巴反應下所測定的PBMC(末梢血液單核細胞)對同種刺激作用的增生性應答。CT1501R和PTX在該免疫調節活性試驗過程中都顯示出劑量應答。
附圖2顯示了CT1501R對由抗鼠(anti-mu)抗體交聯和/或白細胞介素-4(IL-4)刺激的鼠B-細胞增生的抑制作用。附圖2說明CT1501R可以抑制由表現的增生性信號引起的B-細胞增生。
附圖3顯示了CT1501R抑制由伴刀豆球蛋白A(ConA)和白細胞介素-1α(IL-1α)或白細胞介素2(IL-2)引起的增生效果。在用ConA和IL-1α或IL-2活化之前丙小時向細胞中加入預定劑量的CT1501R。如附圖3所示CT1501R抑制胸腺細胞以劑量應答方式增生。本底計數少于200cpm。
附圖4顯示了CT1501R和PTX對由PDGF(血小板來源的生長因子)和IL-1刺激產生的平滑肌增生的抑制作用。在用PDGF和IL-1活化之前兩小時將CT1501R和PTX分別加入到細胞中。如附圖4所示，在較高劑量試驗時，兩種藥抑制平滑肌細胞增生。CT1501R比PTX具有較高活性。
附圖5顯示了CT1501R對由內毒性誘發的老鼠致死率的抑制，以多達6組獨立試驗中老鼠的累積的百分存活率表示(N＝試驗編號)。動物用10μg/gm LPS處理(靜脈注射)，立即將經過LPS(t＝0)，LPS后2小時(t＝2)或LPS后4小時(t＝4)的老鼠進行它們的第一次用CT1501R(100mg/Kg，腹膜內)處理的處理。然后老鼠用CT1501R每天處理三次，觀察動物的存活率。
附圖6顯示了經內毒素處理后鼠血清TNF-α含量。各點代表根據二乘平均ELISA測量法計算的兩次試驗的平均值，且各個試驗點表示取自三只老鼠的混合血漿。
附圖7圖示了由老鼠血漿IL-1α ELISA測量法所得數據，數據采用單一試驗利用二乘平均ELISA測量法計算得到，且各點代表取自三只老鼠的混合血清。
附圖8圖示了由鼠血漿IL-6 ELISA測量法所得數值。數值采用單一試驗利用二乘平均ELISA測量法計算得到，各點表示取自三只老鼠的混合血漿。
附圖9圖示了CT1501R大規模合成步驟Ⅰ藝流程圖。
附圖10圖示了在第0天用5-氟尿嘧啶處理，從第1天開始用CT1501R或載體對照物每天處理二次的老鼠的平均WBC值。該試驗(見附圖10-13中所述)為體內血細胞生成模型。在每一時點對含四只老鼠的小組進行靜脈切開放血術。圖中數值代表平均值±1SD。
附圖11圖示了在第0天用5-氟尿嘧啶處理，從第0天開始每天用CT1501R或載體對照物處理兩次的老鼠的血小板平均數量。在每一時點對四只老鼠的小組進行靜脈切開放血術。圖中數據代表平均值±1SD。
附圖12圖示了從第0天起每天兩次用CT1501R或載體對照物處理的老鼠的平均絕對中性白細胞數。在每一時點對四只老鼠的小組進行靜脈切開放血術。圖中數據代表平均值±SD。
附圖13圖示了在第0天用5-氟尿嘧啶處理，從第0天開始每天用CT1501R或載體對照物處理兩次的老鼠的平均CFU-GM/股骨。在各時點將四只老鼠組殺死并收集其中一只股骨。圖中數據代表在三種相同培養基中的一種內試驗的每次每個單體的集群的平均數的平均值±1SD。
圖14顯示圖10-13所示的服用了5-氟尿嘧啶的實驗中處理和未處理小鼠的存活率。
附圖15和16圖示了CT1501R與Genentech制備的另一種敗血癥休克藥物雙功能TNT受體的公開結果(Ashkenazi et al.，proc.Natl.Acad.Sci.USA8810535，1991)的比較。兩種藥物在給用致死的LPS(內毒素)后幾乎同時服用(附圖15)或兩小時給用(附圖16)。在該系列體內比較試驗中，與藥物服用時間無關，CT1501R始終比Genentech′s TNF受體具有較高的改進存活率。
附圖17圖示了CT1501R，其S異構體CT1501S，以及PTX對溶血磷脂酸酰基轉移酶(LPAAT)(一種在第二信使信號中所涉及的酶)的體外抑制比較。如圖所示，僅有CT1501R在臨床應用中可使用的IC50濃度時能明顯抑制酶活性。LPAAT的活性在使用IL-1β刺激3T3 Ras-變化的成纖維細胞的情況下測量。
附圖18圖示了CT1501R對從LPS活化的老鼠腹膜巨噬細胞中釋放的TNF-α抑制的劑量應答。分離細胞并在LPS活化(10mg/ml)前一小時使用或不用不同濃度的CT1501R處理。24小時后收集上層前液利用ELISA測定TNF-α(+/-SD)。
附圖19圖示了CT1501R對TNF-α從LPS活化的PEC中釋放抑制。將細胞分離并在用10μg/ml LPS活化前一小時使用或不用250μM CT1501R處理。不同時間后，采集上層清液并利用ELISA測定IL-α(+/-SD)。
附圖20圖示了TNF-α從IL-1-α活化的鼠腹膜巨噬細胞中釋放的抑制。將細胞分離并在IL-1-α活化前1小時使用或不用CT1501R(250μM)處理。在活化后24，48或72hrs收集上層清液，利用ELISA測定TNF-α(+/-SD)。
附圖21圖示了U937細胞對活化的HUVEC粘連的抑制。HUVEC用或者IL-1-α(100ng/ml);TNF-α(10ng/ml)或者LPS(10mg/ml)刺激，在加入所述刺激物之前1小時加入或不加入250μM CT1501R。12小時后，測定細胞對載有BCECF的U937細胞的粘連。附圖21為各處理組的相對BCECF熒光(+/-SD)。
附圖22圖示了抑制活化U937細胞對HUVEC的粘連。U937細胞用不同濃度的IL-1-α刺激，在加入IL-1-α之前一小時先加入或不加入250μM CT1501R。十二小時后，U937細胞用BCECF染色，并允許與HUVEC粘連。附圖22表示各個處理組的相對BCECF熒光(+/-SD)。
本發明目的在于限定能夠通過二次信使途徑系統的特定期來控制細胞行為的本發明化合物的種類(Bursten et al.。J.Biol.Chem.26620732，1991)。第二信使為脂類或磷脂并使用下列縮寫詞PE＝磷脂酰乙醇胺LPE＝溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphoethanolamine)PA＝磷脂酸LPA＝溶血磷脂酸DAG＝二酰基丙三醇LPLD＝溶血磷脂酶DLPAAT＝溶血磷脂酸酰基轉移酶PAPH＝磷脂酸磷酸水解酶PLA2＝磷脂酶A-2PLD＝磷脂酶DPAA＝磷酸花生四烯酸
PLA-2＝磷脂酶A2PC＝磷脂酰膽堿“重組”(“remodeled”)PA，環路二PAA，LPA，PA和DAG中間體，它們在指示sn-1和sn-2位置被L-飽和的，2-亞油酰基或1，2-dileolyl/1，2-sn-二亞油酰基取代。
“經典PI途徑”＝被1-硬脂酰基，2-花生四烯酰基脂肪酰基側鏈取代的PI，DAG，PA中間體。
“PLD導致的PA”＝被，例如，1，2-sn-dileolyl-，1-烷基，2-亞油酰基-，以及1-烷基，2-二十二碳六烯酰基側鏈取代的PE，PC，LPA，PA和DAG中間體。
溶血磷脂酸轉移酶(LPAAT)影響通過結合酰基CoA中的酰基基團由溶血磷脂酸(LPA)到磷脂酸的合成。通過PA磷酸水解酶(PAPH)水解磷酸酯部分導致DAG形成。該途徑的這些方面可通過初次刺激物(例如細胞因子如IL-1，IL-2或TNF)對細胞表面上的受體作用的刺激立即活化(一分鐘內)。中間體可檢測的現象是PA和DAG的濃度增大。給用本發明化合物可逆轉這種升高。
本發明化合物和藥物組合物包括LPAAT亞種對具有1，2-二不飽和的以及1-烷基，2-不飽和的亞種的中間體具有酶作用物特異性的PHPH酶中的抑制劑。這種抑制劑(但不屬于本發明化合物種類)的一個代表性例子為PTX。PTX以特異活化途徑阻滯PAPH，所述途徑不涉及PI而由主要由1，2-二不飽和的和1-烷基，2-不飽和的亞種組成的PA衍生得到。這種結果例如可通過在沒有PTX存在和PTX存在下用TNF刺激人腎小球膜細胞從PI和再生PI生成的DAG證明顯示。在后一種體系中，沒有證據證明PA或DAG是從PI除外的來源衍生得到。應當強調的是本發明化合物影響與sn-2位上具有不飽和脂肪酸而不是花生四烯酸酯的酶作用物有關的PAPH和LPAAT亞群，而不影響那些適合PI途徑的酶的輔助形式。
由于血漿膜的環狀重組以及各個亞類的循環使得各個磷脂亞種膜(如PA，PI，PE，PC和PS)獲達穩定含量的特異脂肪酰基側鏈。PA通常是穩定的，但存在量相對較小。休止細胞中的PA主要由飽和酰基鏈組成，所述酰基鏈通常包括十四(烷)酸鹽，硬脂酸鹽和十六(烷)酸。在休止細胞內，PC酰基側鏈主要包括在sn-1位上的酰基十六烷酸和sn-2位上的油酸鹽。PE和PI主要由sn-1硬脂酸鹽和sn-2花生烯酸鹽組成。
因為這種在sn-1和sn-2位置上酰基基團的特定成份，任何PA種的起源可從它的sn-1和sn-2位置上酰基基團的化學性質推斷得到。例如，如果PA是通過酶PLD的作用從PC衍生得到，則PA將含有PC酶作用物的特性酰基側鏈，所述酶作用物通過第二信使途徑傳遞。并且，任何1，2-sn-酶作用物種類的起源可被識別出其來源。然而，重要的是要知道是還是不是每種磷脂種類在水解成DAG之前通過PA型傳遞。能被轉換成PA并因此轉換成DAG的溶血磷脂酸可用于證明。這種第二信使途徑的復雜性可通過在第二信使途徑的刺激作用后的不同時刻，經對細胞內中間體的脂肪酰基側鏈化學性質的適當分析(即采用薄層色譜或高壓液相色譜法分析)來分類。
要某些系膜細胞，如中性白細胞和鼠或人系膜細胞中，幾種信號途徑可一前一后地，同時或二者都存在情況下被活化。例如，在中性白細胞內，通過PLD的作用，F-Met-Leu-Phe刺激PA的形成，一段時間后繼之通過PAPH的作用形成DAG。幾分鐘后，通過經典磷酸肌醇途徑由PI產生DAG。在許多細胞內，DAG是從兩種通過環路，利用它，PAA被PLA-2在sn-2水解，繼之被LPAAA在sn-2進行轉酰作用，以及由通過PLD從PE或PC或兩種酶作用物產生的PA制備的PLD途徑被重組的PA衍生得到。
根據酰基鏈的組成此處所述的方法能夠區分PA和DAG的不同亞種。該方法可以區分那些能將該第二信使途徑從其它途徑，如經典PI途徑中活化(以及抑制活化)的化合物。該第二信使途徑包含在sn-2位上具有不飽和脂肪酸而非花生四烯酸鹽的酶作用物以及那些在正常細胞輔助功能中不涉及的PAPH和LPAAT亞種，正常細胞輔助功能是經典PI途徑的一部分。包含在該第二信使途徑中的PAPH和LPAAT酶對不同的酰基側鏈和酶作用物的異構體形式具有強烈的立體專一性。因此本發明化合物為基本上對映體純，且在與羥基鍵合的手性碳子上優選R對映體。例如，CT1501的R和S異構體具有不同的LPAAT抑制活性(如附圖12所示)。并且，CT1501的R對映體(例如CT1501R)的活性比外消旋混合物(此處稱作M1)高二至三倍，比相應的S對映體高若干倍。此外，當在人體內代謝時PTX幾乎僅轉換成M1的S對映體或CT1501S。
利用PA/DAG途徑，在高PTX濃度下(大于病人體內能得到的并沒有劑量限制副作用的PTX濃度)通過阻滯在LPAAT中PA亞種的形成，PTX(體內)阻滯重組PA形成。即使在PTX存在下，通過PLD的作用，細胞繼續形成PA，通過磷脂酶C對PC和PI的作用，DAG也被形成。本發明化合物或PTX不抑制后一種途徑。在PTX處理過的細胞內，DAG通過重組得到且由PLA產生的PA減少(如1，2-sn-dioleoyl DAG，1-烷基，2-亞油酰基DAG以及1-烷基，2-docosahexaneolyl DAG)。因此，通過選擇抑制特異性第二信使途徑，本發明化合物和PTX抑制僅僅一定的PA和DAG種類的形成，所述第二信使途徑僅在細胞中通過有毒刺激被活化，但不用于傳遞正常細胞輔助功能信號。
對由各種有毒性刺激初次活化的特異性第二信使途徑的活化的專一性抑制使得本發明化合物具有用于治療多種臨床指癥的能力。此外，此處所提供的體內和體外資料對具有共同的特異性第二信使途徑的活化特征的多種臨床指癥提供了預見性資料，由通過，例如，炎性細胞因子傳遞的有毒刺激而活化的特異性第二信使途徑被本發明化合物專一抑制。事實上，本發明化合物的這種作用機理能夠解釋為什么本發明化合物能夠對多種不同臨床指癥有治療能力。該第二信使途徑的活化是應答有毒刺激的主要傳遞器并產生導致，例如，炎癥，免疫應答，抑制血細胞再生和癌細胞生長的細胞信號。但是，不是所有抑制劑能抑制所有這種第二信使途徑酶。本發明化合物是最有效的炎癥和抑制血細胞再生的傳遞器。這種第二信使途徑傳遞的信號包括，例如，那些對LPS的直接細胞應答，由抗原產生的T細胞活化，由抗原產生的B細胞活化，對通過IL-1 1型受體(非IL-1 2型受體)傳遞的IL-1的細胞應答，TNF1型受體，活化致癌基因(如ras，abl，her2-neu等等)，低類緣GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落生長刺激因子)受體，以及由PDGF，b-FGF和IL-1刺激引起的平滑肌細胞增生。還有一些其它不是通過這種第二信使途徑傳遞的信號，這些信號包括由G-CSF(粒細胞集落生長刺激因子)，白細胞間素3(IL-3)，SCF(干細胞因子)和GM-CSF誘導的血細胞生成的細胞增生;由白細胞間素8(IL-8)或白細胞三烯B4誘導的中性白細胞增生;應答IL-2的T細胞增生;以及應答酸性FGF(成纖維細胞生長因子)的內皮細胞增生。
在體外，本發明化合物(1)阻滯通過如所示的1型受體的IL-1信號轉動變異，例如，通過防止IL-1和IL-1外加PDGF(血小板源生長因子)誘導的平滑肌細胞和腎小球膜細胞的增生來阻滯IL-1信號轉動變異;(2)抑制如所示的粘連分子的調節，例如，通過在中性細胞中阻滯CD18內皮細胞內的VCAM來抑制;(3)抑制TNF和IL-1誘導的金屬蛋白酶(一種炎癥模型);(4)阻滯LPS誘導的細胞活化(用于預防和治療敗血性休克);(5)抑制由抗原或交聯CD3復癥引起的T細胞和B細胞活化;(6)抑制由IgE引起的肥大細胞;以及(7)抑制轉移細胞(transformed cells)和腫瘤細胞系中的惡性顯型。
上述的體外作用產生下述體內生物作用，包括，但不僅限于此，保護和治療內毒性素休克，抑制腫瘤細胞生長，通過細胞減少療法刺激血細胞生長，對防治GVHD(移植物抗宿主病)的協同免疫抑制，通過apoptotic過程逆轉刺激頭發生長。這里所提供的體內試驗資料表明對裸鼠模型具有保護和治療內毒性休克，經細胞減少療法刺激血細胞生長以及刺激頭發生長。本發明化合物，尤其是CT1501R在局部用于刺激血細胞生長，防治和治療敗血性休克以及刺激頭發生長時最有效。對于免疫抑制，急性炎癥，慢性炎癥以及GVHD，盡管所述的第二信使途徑的抑制劑具有這種活性，但本發明化合物活性較低并需要較高摩爾濃度。
本發明化合物也可用作佐劑以抑制藥物的毒性副作用，藥物的副作用是通過所述的第二信使途徑傳遞。這些副作用包括，例如，白細胞介毒-2(IL-2)副作用，環孢菌素A和FK506的腎副作用，以及兩性霉素B的副作用。應該注意本發明化合物象環孢菌素或FK506一樣抑制抗原誘導的T細胞活化，但與環孢菌素或FK506不一樣的是不防止NK和LAK細胞的產生，不抑制T細胞中IL-2釋放以及不抑制IL-8釋放。
金屬蛋白酶間接組織損傷如腎小球疾病，關節的關節炎損傷，以及肺的肺氣腫損傷對腫瘤轉移起一定作用。三種金屬蛋白酶例子包括由TNF，IL-1及PDGF加上bFGF誘導的92KD V型明膠酶，通常由TNF或IL-1組成并誘導的72KD IV型明膠酶，以及由TNF和IL-1誘導的stromelysin/PUMP-1。此外，CT1501R將由100U/ml IL-1誘導的PUMP-1活性降低至其對照濃度的15%。相反在同一試驗中，PTX僅將PUMP-1的活性抑制至其對比濃度的95%，這是不明顯的。因此，本發明化合物能防止某些由IL-1或TNF誘導的金屬蛋白酶的誘導，且基本上不涉及包含在正常組織重組中產生的蛋白酶(如，72KD IV型明膠酶)。
本發明化合物可以抑制由I型IL-1受體傳遞的信號轉動變異，并因而被認作IL-1拮抗劑。最近標題為“The Role of Interleukin-1 in Disease”(Dinarello and Wolff N.Engl.J.Med.328，106，Jan.14，1993)的綜述論文描述了IL-1作為“一種重要的快速直接疾病決定簇”的作用，“例如，對于敗血性休克，IL-1直接對血管作用，通過迅速產生血小板因子和氧化氮誘導血管舒張，而對于自身免疫疾病，IL-1通過刺激其它細胞來作用，產生細胞因子或酶。產生的細胞因子或酶然后對靶組織作用”。該論文描述了一組由IL-1傳導的疾病，包括濃毒病綜合癥，類風濕性關節炎、炎癥性腸病，急性和髓細胞性白細胞，胰島素依賴性糖尿病晚期合并癥，動脈粥樣硬化以及其它包括移植排斥，移植物抗宿主病(GVHD)，牛皮癬，哮喘，骨質疏松，牙周炎，自身免疫性甲狀腺炎，酒清中毒性肝炎，早產后子宮感染(Premature labor Secondary to uterine infection)以及連續睡眠癥(even sleep disorders)等疾病。由于本發明化合物能抑制通過IL-1 1型受體的細胞信號并為IL-1拮抗劑，因此本發明化合物可用于治療所有上述疾病。
例如，對于濃毒性綜合癥，“IL-1誘導休克的機理被認為是IL-1增大介體小分子的血漿濃度的能力，這些小分子如血小板活化因子，前列腺素和氧化氮。這些物質對實驗動物是有效的血管舒張藥并能誘導休克癥。阻滯IL-1作用可以防止合成以及釋放這些介體。對于動物，單獨靜脈注射IL-1能降低平均動脈壓，降低系流血管阻力以及誘導白細胞減少和血小板減少。對于人，靜脈給用IL-1也能迅速降血壓，但每千克體重300ng或更大劑量可能引起嚴重高血壓”，“阻滯IL-1作用的治療優點歸屬于可防止其有害的生物作用，而不影響在體內平衡起作用的分子產生”。本發明化合物通過抑制僅通過IL-1 Ⅰ型受體而不通過IL-1 Ⅱ型受體的細胞信號編址由Dinarello發現的需要。
對于類風濕性關節炎，Dinarello指出“在患有類風濕性關節炎病人的滑液襯里(Syn ovial lining)和滑液中存在有白細胞介素-1，從這類病人體內移出滑液組織在體內產生IL-1。白細胞介素1的關節內排斥對動物誘導白細胞浸潤，軟骨斷裂，以及關節周骨改型。在體外分離的軟骨和骨細胞內，白細胞介素1觸發基因對明膠酶以及磷脂酶和環氧合酶的表現，并阻滯其作用，降低老鼠細菌性細胞壁誘導的關節炎”。因此，本發明化合物作為IL-1拮抗劑可用于治療和預防類風濕性關節炎。
關于炎癥性腸病，潰瘍性結腸炎和Crohn病特征在于含有活化的中性白細胞和巨噬細胞的腸的浸潤性損傷。IL-1能夠刺激炎性廿烷類產生，所述廿烷類如前列腺素E2(PGE2)和白細胞三烯B4(LTB4)以及IL-8(一種具有中性白細胞化學吸引劑和中性白細胞刺激物特性的炎性細胞因子)。PGE2和LTB4的組織濃度與患潰瘍性結腸炎的病人的病情有關，患有炎癥性腸病的病人具有高的IL-1和IL-8的組織濃度。因此，IL-1拮抗劑，如本發明化合物，能夠有效治療炎癥性腸病。
對于急性和慢性髓細胞性白血病，越來越多的證據表明對于這種腫瘤細胞，IL-1相當于一生長因子。因此本發明化合物應當能有效防止急性和慢性髓細胞性白血病的惡化。
胰島素依賴性糖尿病晚期合并癥(IDDM)被認為是由免疫活性細胞傳遞的胰島內β細胞變性的自身免疫病。患有自發性IDDM的動物(如BB鼠或NOD鼠)的小島中存在著含有IL-1的炎性細胞。因此本發明化合物應當能用于預防和治療IDDM。
IL-1也對動脈粥樣硬化的發育起一定的作用。內皮細胞為IL-1靶。IL-1刺激血管平滑肌細胞增生。泡沫細胞從含有IL-1β和IL-1β信使RNA的血膽固醇過多的鼠的脂肪動脈斑中分離得到。這些細胞攝取周圍血單核細胞導致IL-1產物產生。IL-1也刺激PDGF的產生。總之，IL-1對動脈粥樣硬化的發育起部分作用。因此，IL-1拮抗劑，如本發明化合物應能夠用于預防和治療動脈粥樣硬化。
體外測試本發明化合物的生理及藥理效應試驗利用不同的細胞類型，多種體外試驗可用于測定本發明化合物調節(module)免疫活性以及抗腫瘤活性的效應。例如，混合淋巴細胞反應(MLR)提供了一種有價值的測定各個發明化合物生物活性的熒光屏檢查工具。在MLR中，PBMCs(周圍血單核細胞)通過在肝素化容器中從健康自愿者體中抽出全部血液而得到，并用等體積控制(hanks)平衡鹽溶液(HBSS)稀釋。在室溫或冷卻下將該混合物經蔗糖密度梯度法，如Ficoll Hypaque
梯度(比重1.08)分層，并在1000×g下離心25分鐘。PBMC從血漿-Ficoll界層間的帶狀物中得到，分離并用鹽水溶液如HBSS至少洗滌兩次。溶解污染的紅細胞，如用ACK在37℃溶解10分鐘，PBMCs用HBSS洗滌兩次。將純化PBMCs小丸再懸浮在全培養基中，如RPMI16540加上20%人滅活血清。PBMC對同種刺激應答增生可用在一96孔微量滴定離心板中進行的兩種方式MLR測定。簡言之，將處在200μl全培養基中的大約105試驗用純化PBMC細胞用約105自身固有的(對照培養物)或同種的(刺激培養物)PBMC細胞共同培養，其中同種細胞來自HLA不同單體。在細胞加到微量滴定離心板中時加入變劑量的化合物(藥物)。培養物在5%CO2氣氛中于37℃溫育6天。在溫育終結時加入氚化胸苷(例如，40至60Ci/mmole的1μCi/well)。通過液態閃爍計數測定增生。
胸腺細胞輔助刺激因子試驗旨在評估本發明化合物抑制由ConA和白細胞介素1(IL-1)，或白細胞介素2(IL-2)刺激引起的胸腺細胞的活化和增生。胸腺從老鼠(如雌性Blab/C鼠)中獲得，將胸腺切除并離解到培養基中(如無血清附加物的RPMI 1640)。離解的胸腺組織和細胞懸浮液轉移至離子管中使其靜置沉淀，用HBSS洗滌，然后再懸浮在有血清補充的培養基(如具有10%胎兒腓腸血清的RPMI 1640)。溶解任何污染的紅細胞，將活細胞再懸浮并計數。平皿培養胸腺細胞(如密度為2×105細胞/每孔的96孔滴定板)，向孔中加入刺激物，如ConA，IL-1(如IL-1α)或IL-2。該細胞在37℃溫育4天，在第四天，細胞用氚代胸苷脈沖并測定細胞增生。本發明化合物在刺激劑加入時加入。
通過測定生物活性試驗的適宜劑量以及防止體外活性試驗中的細胞毒性反應研究了本發明的各個化合物的細胞毒性。將細胞(如NIH-3T3，Ras變形3T3細胞，惡性黑素瘤LD2細胞，等)加到微量滴定離心板內，平皿培養約二天后加入藥物。利用熒光活性染劑(如2′，7′-二-(2-羥乙基)-5-(和-6)-羥基熒光生乙酰氧甲基酯(2′，7′-bis-(2-carboroxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester)，BCECF在488nm激發，525nm放射)，在藥物加入后24，48或72小時測定細胞活力。
另一種測量本發明化合物活性的試驗包括利用人源間質細胞測定PDGF(血小板源生長因子)增生應答。將人間質細胞在規定培養基(如69%McCoy培養基，12.5%胎兒腓膀血清，12.5%馬血清，1%抗生素，1%谷氨酰胺，1%維它命附加物，0.8%必需氨基酸，1%丙酮酸鈉，1%碳酸氫鈉，0.4%非必需氨基酸和0.36%氫化可的松)中平皿培養(如每孔約2000細胞)。二至三天后，間質細胞在無血清培養基中禁食。二十四小時后，細胞用刺激劑如PDGF-AA，PDGF-BB或具有或沒有IL-1α或TNF的基礎GFG(纖維母細胞生長因子)，以及氚化胸苷處理。利用液態閃爍計數法測定細胞增生。
B細胞增生試驗測定本發明化合物對由抗mu抗體(40μg/ml)，IL-4或PMA(2.5mM)刺激的刺激B細胞增生的抑制效應。分支B細胞腫瘤細胞或鼠脾細胞用刺激劑，一種本發明化合物和氚化胸苷溫育，測量對由刺激劑引起的細胞增生的抑制。
也可通過測量刺激細胞內血管細胞粘連分子(VCAM)的濃度來測量藥物抑制活性。將早期傳代(Early passage)人臍靜脈內皮樣細胞(HUVEC)(從商業供應得到，如Cell Systems，Inc.or Clonetics)在含有10%胎兒腓膀血清的培養基(如Hepes緩沖培養基，Cell Systems)中培養，并補充有刺激劑，這種刺激劑如纖維母細胞生長因子(基礎FGF，Cell Systems Inc.)或TNF。細胞在微量滴定離心板的孔中培養(如每孔5×104)并在37℃溫育72hrs。移出休止細胞(如用0.4%EDTA處理20-30分鐘)，在培養基(如磷酸鹽緩沖鹽水加上含有0.01%疊氮化鈉的0.1%牛血清蛋白)中洗滌并標記在含有能識別人VCAM的單克隆抗體(“第一抗體”)的冰上(如1μg能識別人VCAM的單克隆抗體，Genzyme)。在冰上60分鐘后，細胞用涼洗滌培養基洗滌(最好兩次)并使用能識別第一抗體的抗體溫育(如1μg與藻紅蛋白結合的山羊抗鼠IgG，Cal Tag，Inc)。在冰上30分鐘后，將細胞洗滌兩次并利用流動白細胞計數器(Coulter Elite
)在適當的放射和激發波長分析(如對于藻紅蛋白使用在488nm激發和525nm的發射)。
一種體外試驗用于測量相關酶溶血磷脂酸酰基轉移酶(LPAAT)和磷脂酸磷酸水解酶(PAPH)的抑制。該試驗包括在可變劑量濃度的一種本發明化合物的存在下或無本發明化合物存在下用一種初次刺激(如各種細胞因子，生長因子，腫瘤基因產物，公認治療劑，輻射，病毒感染，毒素，細菌感染及其產物，以及任何，如果不對抗，對靶細胞有有害作用的刺激)溫育靶細胞。靶細胞包括，例如，亞細胞體，如由間質和/或外胚層細胞衍生的微粒體，特別是從骨髓基質細胞或人或鼠的腎小球膜細胞衍生的微粒體;由腦衍生的微粒體或突觸體;富含質膜的微粒體(plasma membraneenriched microsomes)，質膜-膜按Bursten等(J.Biol.Chem.22620732-20743，1991)所述取得，或去污加溶微粒體，突觸體，和膜或其它利用，例如，NP-40，Miranal，SDS或其它中性去污劑加溶的細胞制品;以及去污加溶，重組體，或進一步純化的細胞蛋白質制品，包括蛋白質LPAAT和/或PAPH。短時間溫育后，提取細胞脂質并按照常規方法利用薄層色譜測定。簡言之，將脂質用例如氯仿∶甲醇2∶1(V/V)提取，提取物然后按照Bursten和Harris，Biochemistry 306195-6203，1991中所述進行HPLC。使用含有3∶4己烷∶丙醇有機載體的Raining
mu-Porasil柱，在分離的起初10分鐘內用1-10%水梯度洗脫，洗脫曲線中峰通過檢測孤立雙鍵在紫外線范圍內的吸收來檢測。相關的不飽和PA和DAG的峰見洗脫曲線中所示。重要的是應注意該試驗方法允許區別PA和DAG的不同形式，這樣那些與本發明的(R)或(S)化合物所影響的途徑有關的PA和DAG可直接被測量。利用快原子轟擊質譜確定這些組份的酰基取代基性質。因而可以檢測相關的不飽和(非花生四烯酸類)PA和DAG亞種。所用時間周期為刺激刺激物如細胞因子刺激后5-60秒。這種技術容許評估各種脂質體組分的濃度與時間的函數關系。
可以測試本發明化合物保護TNF傳遞的細胞因子的活性。在該試驗中，將L929鼠成纖維細胞(每孔104細胞)用可變劑量的化合物或培養基對照物溫育2小時。加入濃度為500pg/ml的TNF-α(R& D Systems)，該濃度為TNF的LD50(125pg/ml)的四倍。含有(或不含)藥物以及含有TNF的細胞在37℃溫育40hrs。將培養基移去并用含有20%血清和10μg/ml BCECF熒光染料的新鮮培養基取代，再溫育30分鐘。將包含熒光染料的培養基移去并用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)取代，測試各孔的熒光。
另一種試驗測量藥物抑制U937細胞對TNF活化的HUVEC細胞沾連的效果。在該實驗中，HUVEC細胞用人TNF-α(20ng/ml)和可變濃度的藥物誘導14-16hrs。將U937細胞(一種人單核細胞細胞系)溫育并用BCECF(10μg/ml)(一種熒光染料)標記。U937細胞制品(每孔2.5×104細胞)在活化HUVEC細胞頂端分層。將細胞反向旋轉以除去部分粘連和非粘連的U937細胞。利用熒光板讀數器(fluorescence plate reader)所記載的熒光測量粘連U937細胞。
本發明化合物和藥物組合物為在3，7-二取代黃嘌呤的1-位上被直鏈烷基(C5-8)取代的ω-1醇的拆分R或S(優選R)對映體。本發明化合物能有效調節細胞對外部或原位刺激的應答，以及對給用有效量這種化合物的特定給藥方式應答。
本發明化合物包括具有下式黃嘌呤母核化合物的化合物和藥物組合物
其中R1代表獨立的基本上不含其它對映體的拆分對映體ω-1仲醇取代的烷基(C3-8)，并且其中各個R2和R3獨立表示可任意含有一個或兩個非相鄰的取代其中碳原子的氧原子的烷基(C1-12)。優選的R1是具有羥基的C6烷基的R對映體。
本發明進一步提供了包含有一種本發明化合物和藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物，其中藥物組合物可被制成適于病人口服，非腸道或局部給藥的劑型。
本發明進一步包括一種藥物組合物，該組合物由一種或多種本發明化合物及藥學上可接受的載體或賦形劑組成。使用本發明化合物或藥物組合物治療的個體可以在體外治療中與本發明化合物在體外培養物中接觸，或者通過對細胞需要處理的受治療者給用(口服，非腸道或局部)本發明化合物或藥物組合物而治療。
1-(5-羥基-正己基)-3，7-二甲基黃嘌呤的(R)或(S)對映體是已知的，可通過本專業已知的常規方法制備，這些方法包括微生物技術，如Davis et al.，Xenobiotica，151001，1985和Davis et al.，Applied and Environmental Microbiology，48327，1984中所述，例如，利用Rhodotorula rubra，將與光活性酸如(R)-α-甲氧基-α-三氟甲基-苯乙酸((γ)-MTFPA)和其它上述Davis等的文獻中所用的光活性酸形成的非對映體酯形式的外消旋體拆分，直接化學合成法按歐洲專利公開0435153中所述，將(R)或(S)-S-羥基-正己基殘基導入二甲基黃嘌呤的1位，將對映體選擇性轉換，例如將其中對映體酯與叔膦，偶氮二甲酸二烷基酯和羧酸一同加熱，或將對映體醇在任意的質子惰性溶劑中在堿存在下轉換成有機磺酸酯。產生的脂族碳酸酯在堿存在下于含醇或含水溶劑中溶劑分解(如在碳酸鉀存在下甲醇分解)得到如歐洲專利說明書435153或435152中所述的對映體醇。
一種制得(R)或(S)對映體的特別優選方法是根據J.Org.Chem.552274，1990中公開的方法而改進的直接合成法并如附圖9所示。在該方法中，將4-溴-1-丁烯與三氯化硼和三乙基甲硅烷在惰性烴類溶劑如戊烷中于約-10℃至-78℃低溫條件下一同加熱，生成4-溴-1(二氯)丁硼烷。該產物然后在同樣的低溫條件下用(R)-或(S)-蒎烷二醇在惰性溶劑如乙醚或二甘醇二甲醚中處理，得到(R)-或(S)-蒎烷二醇4-溴丁基硼酸酯。該產物在惰性氣氛如氬氣中，在-100℃(或者稍微加熱)于惰性溶劑如四氫呋喃中用LiCHCl2處理，隨后加入無水氯化鋅，生成(R)-或(S)-蒎烷二醇5-溴-1-氯戊基硼酸酯。所得的這種產物在四氫呋喃中于約-10℃至-78℃下用溴化甲基鎂處理，得到R或S蒎烷二醇5-溴-1-甲基戊基硼酸酯。該產物在二甲亞砜(DMSO)中于約-10℃至0℃下用可可堿處理，隨后在約28℃和5毫米汞柱下蒸去DMSO，產生相應的1-N-烷基化黃嘌呤，產率高達95%。隨后用強堿溶液如過量氫氧化鈉水溶液氧化水解除去硼原子和(R)-或(S)-蒎烷二醇殘基。按照常規回收方法如從象異丙醇這種溶劑中重結晶的方法得到所要產物。下述反應圖也用以說明該優選合成方法。
從“溴乙酸酯”和可可堿合成CT-1501R的反應圖
合成可可堿鈉(Ⅱ)的反應略圖
通過在0.7mm汞柱，60℃加熱溫度下蒸餾純化作為參考，反應5至9參見J.Am.Chem.Soc.Vol.108，No.4，1986，Matteson，Sadhu & Peterson.
優選的合成方法中所用的蒎烷二醇為手性源。蒎烷二醇可按下述合成步驟合成。
合成蒎烷二醇(手性源)的反應略圖
(1R，2R，3S，5R)-(-)-蒎烷二醇對于大于99% ee的產物，[α]21＝-8.6°(C＝6.5，甲苯)
合成步驟中使用(-)-α-蒎烯，該化合物通常不可能以工業規模數量買到。但是，-(-)-α-蒎烯可按下述步驟制備。
α-蒎烯合成略圖
同樣重要的是根據反應10再生蒎烷二醇，回收這種在許多反應中重復使用的有價值的原料和手性源。優選的回收再生蒎烷二醇的方法如下圖解。
本發明化合物和藥物制劑的用途本發明化合物提供了一種通過減輕初級刺激對在兩次初級刺激之間引發的第二信號途徑的作用從而保持被初級刺激接觸的細胞體內平衡的機理。例如，體內或體外施用本發明化合物提供了一種改變細胞行為的方法，該方法包括接觸的細胞(體內或體外)的行為用有效量的本發明化合物或其藥物組合物來改變，所述方法是(1).一種抑制腫瘤細胞增生的方法，其用量應足以抑制所述的增生;或(2).一種促進血細胞生成的干細胞分化成紅血細胞、血小板、淋巴細胞和粒細胞的方法，其用量應足以促進所述的分化;或(3).一種抑制抗原或IL-2刺激T細胞活化的方法，其用量應足以抑制所述的活化;或(4).一種抑制內毒素，TNF，IL-1或GM-CSF刺激單核細胞/巨噬細胞活化的方法，其用量應足以抑制所述的活化;或(5).一種提高間充質細胞對腫瘤壞死因子的細胞毒素作用的抵抗力的方法，其用量應足以提高所述的抵抗力;或(6).一種抑制B細胞對抗原、IL-4或CD40配位體應答產生抗體的方法，其用量應足以抑制所述的抗體的產生;或(7).一種抑制對能夠刺激增生的生長因子應答的平滑肌細胞的增生的方法，其用量應足以抑制所述的增生;或(8).一種降低由內皮細胞導致的系統血管抵抗力的方法，其量應足以減少誘導高血壓的物質的釋放;或(9).一種降低由內皮細胞誘導的系統血管抵抗力的方法，其用量應足以提高抗高血壓物質的釋放;或(10).一種降低由增強劑誘導的粘連分子出現的方法，其用量應足以降低所述的出現;或(11).一種抑制HIV活化T細胞的方法，其用量應足以抑制所述的活化從而抑制病毒復制;或(12).一種抑制應答IL-1和/或mip-1α和/或PDGF和/或FGF刺激腎小球膜細胞增生的方法，其用量應足以抑制所述的增生;或(13).一種提高腎小球或小管細胞對環胞霉素A或兩性霉素B的抵抗力的方法，其用量應足以提高所述的抵抗力;或(14).一種防止在TNF處理的骨髓間質狀細胞中生長刺激因子產生的抑制的方法，其用量應足以防止所述的抑制;或(15).一種防止IL-1，TNF或內毒素刺激的單核細胞和巨噬細胞釋放mip-1α的方法;或(16).一種防止IL-1，TNF或內毒素處理的巨核細胞，或纖維細胞和巨噬細胞釋放血小板活化因子的方法;或(17).一種防止在TNF處理的血細胞生成的原本細胞中的細胞活素受體的降低調節的方法，其用量應足以防止所述的降低調節;或(18).一種抑制在IL-1刺激或TNF刺激的小球上皮細胞或滑液細胞中產生金屬蛋白酶的方法，其用量應足以抑制所述的產生;或(19).一種提高胃腸的或肺的上皮細胞對細胞毒素藥物或放射療法的抵抗力的方法，其用量應足以提高所述的抵抗力;或(20).一種提高非烷基化抗腫瘤劑的抗腫瘤作用的方法，其用量應足以提高所述的作用;或(21).一種抑制應答IL-1產生破骨細胞活化因子的方法，其用量應足以抑制所述的產生;或(22).一種抑制應答IgE去粒的方法，其用量應足以抑制所述的去粒;或(23).一種提高腎上腺素能神經遞質，多巴胺，去甲腎上腺素或腎上腺素或神經遞質，乙酰膽堿的釋放的方法，其用量應足以提高所述的釋放，或(24).一種調節腎上腺素能神經遞質、多巴胺、腎上腺素或去甲腎上腺素，或神經遞質乙酰膽堿的突觸后的“慢流”作用的方法，其用量應足以調節所述的慢流。
例如，本發明的化合物用于進行骨髓移植(BMT)的病人，不管BMT是選配的同種異體，非選配的同種異體或是自身的。接受自身移植的病人可輔助以本發明化合物的治療，盡管他們不必服用免疫抑制劑，因為他們不會產生移植-排斥-宿主病(GVHD)。然而，用于與移植完成后有關的疾病的化學療法或放射療法的毒作用構成了對病人細胞的負刺激。
通常，進行BMT的所有病人需要全身照射或非全身照射的化療量超過正常骨髓恢復的致死量。這提供了使用貯存的病人骨髓或供體骨髓救治病人的基本原理。通常，在新的或貯存的骨髓注入之前，給病人進行化學療法或放射療法連續7-10天。將骨髓給予病人的這天作為移植的0天，在此之前病人接受化療/放療的天數作為負數，在此之后的天數作為正數。
在BMF受體中發生陰性應答的中間時間是在移植后的第一個100天。因此，從統計上看，如果病人生存100天，那么連續生存的機率會顯著地提高。本發明化合物能夠增加病人生存的百分數。在認為可接受的第一個100天內的死亡百分數對于“十分危險”的病人來說為15-20%，對于“高危”病人來說為30-40%。死亡是由于高劑量的化療/放療的直接作用所造成的。此外，在同種異體骨髓受體中GVHD也增加了死亡率。
可服用本發明化合物的其他指征包括存在腫瘤負擔，與激素有關的疾病，神經病，自體免疫病，炎癥，再狹窄，冠狀動脈病，動脈粥樣硬化，高血壓，非需要的免疫應答，病毒傳染病，腎炎，粘膜炎和各種變態反應。防止變態反應包括防止急性變態反應，因此減輕或防止鼻溢，竇導液，彌散的組織水腫和擴散的瘙癢。慢性變態反應的其他癥狀包括上述癥狀，頭暈，腹瀉，組織充血和局部淋巴細胞浸潤的淚腫脹。變態反應也與白細胞三烯釋放和其末梢作用有關，如哮喘癥狀包括氣道阻塞的發展，TEVI減少，肺活量變化和過多的粘液的產生。
可服用本發明化合物的其他合適受體包括為治療腫瘤服用細胞減少劑如化療劑或放療劑的病人，以及用生物應答調節劑如IL-2和腫瘤抑制細胞如淋巴因子激活殺傷細胞(LAK)和浸潤于腫瘤的淋巴細胞(TIL細胞)治療的病人;患有瘤形成的病人，通常不管是否進行其他治療，瘤形成包括急性和慢性骨髓性白血病，毛細胞性白血病，淋巴瘤，巨核細胞白血病等;由細菌、真菌、原蟲或病毒傳染引起的病癥的病人;以例如再狹窄形式表現出非需要的平滑肌細胞增生的病人，如進行心臟外科手術的病人;遭受自體免疫病，因而需要使T和B細胞失活的病人;以及有神經病的病人。
本發明化合物還能夠降低由于用乙酰膽堿和/或腎上腺素刺激突觸小體所升高的有關PA和DAG的濃度。這表明本發明化合物既能提高抑制神經遞質如多巴胺的釋放，也能調節這些神經遞質的末梢“慢流”作用。
因此，本發明的藥物還用于提高發作閾，穩定對神經毒素如馬錢子堿的突觸，增強抗帕金森藥物如L多巴的作用，增強催眠化合物的作用，減輕由于服用安定藥的運動病，減少或防止與進行性神經死亡接著大腦血管活動如中風有關的神經元過熱。此外，本發明化合物可用于治療去甲腎上腺素缺損抑郁癥和與內生的糖腎上腺皮質激素釋放有關的抑郁癥。防止地塞米松或甲基去氫氫化可的松對中樞神經系統的毒性作用，以及治療沒有藥癮的慢性痛。此外，本發明化合物可用于治療患有學習和注意力缺陷的小孩，通常能改善患有器質性缺陷的受體包括阿爾茨海默病的病人的記憶力。
盡管劑量可以變化，但當本發明化合物給需要如此治療的人受體以有效的口服、腸胃外或靜脈內亞致死量每天約200mg至約5000mg(取決于病人的體重)給藥時，可達到治療功效。特別優選的治療白血病的規則是4-50mg/Kg體重。然而，顯而易見對于任何具體的受體，特殊的劑量規則應根據個體的需要和管理或監督本發明化合物給藥的人的職業判斷而調節。
與P-450抑制劑共給藥由于本發明的化合物具有較長的半衰期，因此本發明化合物與P-450抑制劑體內共給藥可提高藥效。體內的藥效是由于本發明的化合物特別是在黃嘌呤環的N7位的脫烷基化的化合物抑制了脫粒途徑。例如，NIH3T3-D5C3細胞被用于單獨的本發明化合物和與P450抑制劑結合的對照效果，它是通過單獨用本發明化合物培養和用本發明化合物和P450酶抑制劑共培養比較轉形變異表現型的控制。
抑制P-450化合物包括例如(每天劑量范圍mg)，萘心安(20-100)，metaprolol(20-100);戊脈安(100-400)，硫氮
酮(100-400)，硝苯吡啶(60-100)，甲氰咪胍(400-2，400);ciprofloxacin(500-2000)，enoxacin(500-2，000)，norfloxacin(500-2000)，ofloxacin(500-2，000)，哌氟喹酸(500-2，000);紅霉素(100-1，000)，三乙酰竹桃霉素(100-1，000);Ketoconizole(100-2，000)，噻苯咪唑(100-1，000);異煙肼(100-1000);慢心利(100-1，000);和地塞米松(1-100mg)。
合適的制劑取決于所治療的疾病的性質，所選擇的藥劑的性質以及主治醫師的診斷。通常，本發明化合物可配制成注射或口服形式，盡管其他給藥方式如轉移粘膜或轉移皮膚途徑也可使用。這些化合物的合適的制劑如在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Latest edition)，Mack Publishing Company，Easton，PA，中所示。
劑量取決于所選擇的本發明化合物，并且通過與P-450抑制劑如喹諾酮共給藥而顯著地減少，另外，用這些喹諾酮可得到較強的增效作用。
下列實施例用于說明本發明而不是對本發明的任何限制。在這些實施例中PTX為己酮可可堿。
實施例1本實施例說明通過拆分外消旋的M1合成CT1501R。向乙醚飽和的M1反應管形瓶中加入3.0當量吡啶(從氫化鈣中新蒸餾出的)和3當量R-(+)-1-甲氧基-1-三氟甲基苯基乙酸((+)-MTFPA)的酰基氯溶液。將反應管形瓶密封，在50℃下加熱1小時，置于氮氣氛下至干，然而用75%MeOH/H2O分配。用90%(75%MeOH/水)，3%乙腈(AcN)，7%水的異構化體系以3.0ml/min流速通過250×10mm Ultremex 5C-18柱(Phenomenex，Torrance，CA90501)進行分離。用10%MTFPA-M1的75%MeOH/水的溶液制成試樣，每7分鐘注射100μl等分試樣，歷時21分鐘(4次注射)。在29.8分鐘洗脫的化合物為(S-M1)-MTFPA，在31.4分鐘洗脫的化合物為(R-M1)-MTFPA，95%的己分離。用Dale等描述的方法(J.Org.Chem.342543，1969)，用NMR確定絕對構型的排布。合并收集的組分，用旋轉蒸發器減少體積。試樣用氯仿萃取后，開始蒸發僅除去MeOH和AcN，將溶劑干燥并真空除去。之后，在研究表明對除去水所需的溫度的較少的提高，酯是穩定的時，可以略去萃取步驟。
(+)-MTFPA-M1立體異構體的水解為了監測MTFPA酯的水解過程，必須設計一種直接定量測定存在的M1和總的酯的測試方法。使用梯度法，即在注射后1.0-8.0min間改變流動相從40%(75%MeOH/水)10%AcN50%水至40%(75%MeOH/水)60%AcN。最終條件保持3分鐘后，將柱再回到初始條件。在280nm處監測洗脫液，對于游離的和衍生的M1來說，保留時間分別為6.5分鐘和12.3分鐘。使用這種體系，不需要分離衍生的M1的立體異構體，所以它可用于監測MTFPA酯的水解的測定。
向30mg純MTFPA-M1酶(R或S衍生物)的4.0ml EtOH溶液中加入約40mg硼氫化鈉(NaBH)，將此混合物在油浴中加熱至70℃。每4小時加入另外的硼氫化鈉(20mg)歷時一天。54小時后，反應完成幾乎90%(通過HPLC)，此時M1+M1-酯的總峰面積沒有損失;反應用磷酸-鈉/水終止，用HCl調節至pH3.5，真空除去EtOH，用氯仿萃取未反應的酯和M1。氯仿用硫酸鈉干燥并真空除去。粗產物用制備型色譜純化，用上述M1所用的溶劑梯度洗脫，用流速為3.0ml/min，250×10mm柱。收集的餾分真空減少體積至干，用乙醚研制，分析對映體過量(＞95%兩種異構體)。在氮氣氛下除去乙醚，將所得的晶體溶于少量體積的生理鹽水中。用生理鹽水稀釋此標準溶液制得每一對映體的10mM溶液。對映體的鑒定通過重組的MTFPA酯的HPLC來證實。
實施例2本實施例說明在實驗范圍內用R蒎烷二醇作為手性源制備(R)1-(5-羥庚基)-3，7-二甲基黃嘌呤)(CT1501R)的方法。在500ml園底燒瓶中將三乙基硅烷(83.49g，0.718mol)和4-溴-1-丁烯(97g，0.718mol)混合，并冷卻至-78℃。在1升園底燒瓶中，將三氯化硼(84.13g，0.718mol)氣體在-78℃下冷凝，然后加入400ml戊烷。在攪拌、氮氣氛下，通過套管將硅烷/丁烯混合物滴加到三氯化硼溶液中，同時保持內部溫度為-78℃。加完后，向此溶液中滴加入三當量甲醇，然后加熱至室溫，在氮氣氛、大氣壓下蒸餾出戊烷、HCl和過量的甲醇。殘余物真空蒸餾得到4-溴丁基硼酸二甲酯;(bp 70-79℃，在0.9托下，得到127.5g，85%產率)。
在500ml園底燒瓶中，將(R)-蒎烷二醇(62g;0.365mol)和4-溴丁基硼酸二甲酯(75g;0.359mol)與200ml乙醚一起攪拌。30分鐘后，真空除去乙醚，殘余物蒸餾得到(R)-蒎烷二醇-4-溴丁基硼酸酯(bp 134-141℃，在1.6-1.9托下，110.85g，98%產率)。
為了進行同系化反應，在帶有側臂的1升園底燒瓶中，在氮氣氛、攪拌下將二氯甲烷(31.47g;0.370mol)和500ml無水THF冷卻至-100℃。向該冷卻的溶液中，通過燒瓶的側臂滴加入212ml正丁基鋰(1.4N的己烷溶液)，歷時45分鐘，并且在氮氣氛下攪拌，同時保持內部溫度為-100℃。加完后，將溶液攪拌20分鐘。將蒎烷二醇4-溴丁基硼酸酯(77.82g;0.247mol)與100ml無水THF混合，冷卻至-78℃，然后滴加入甲基二氯鋰，同時保持內部溫度為100℃。加完后，加入嚴格干燥的氯化鋅(30.29g;0.222mol)。氮氣氛下攪拌溶液10小時，然后加熱至室溫，真空除去溶劑。向殘余物中加入500ml石油醚和300ml飽和的氯化銨水溶液。分離有機相，用飽和的氯化銨洗滌(2×250ml)。合并水相，用石油醚洗滌(2×250ml)。合并有機相，用硫酸鈉干燥，過濾并蒸發得到粗蒎烷二醇(R)-溴戊基硼酸酯，粗產物重92.13g(102%)。
在500ml園底燒瓶中，將300ml無水THF和上述反應得到的粗的蒎烷二醇(R)-1-氯-5-溴戊基硼酸酯(假定89g，0.247mol)混合并冷卻至-78℃，同時在氮氣氛下攪拌。向此溶液中加入甲基溴化鎂(3.26N，79.6ml)。將溶液加熱至室溫過夜。加入石油醚(500ml)和飽和的氯化銨(250ml)，從而形成乳液。分出水相，有機相用飽和的氯化銨(2×250ml)洗滌，使乳液消散。合并的水相用石油醚(2×250ml)洗滌。合并的有機相用硫酸鈉干燥、過濾并真空干燥得到85.85g粗蒎烷二醇(R)-5-溴-1-甲基戊基硼酸酯。
在5升燒瓶中，在氮氣氛、攪拌下將2升DMSO和可可堿(44.51g，0.247mol)混合。將氫化鈉(9.9g;0.247mol)混合。將氫化鈉(9.9g;0.247mol)分兩批加入到溶液中，進行攪拌至可可堿溶解。3小時后，將上述反應得到的蒎烷二醇(R)-5-溴-1-甲基戊基硼酸酯(84.75g，0.247mol)滴加到該溶液中，并攪拌12小時。
從溶液中蒸餾出DMSO(可以循環使用)，殘余物用500ml二氯甲烷和500ml水處理。除去水相，有機相用水洗滌(3×750ml)。合并水相，用2×500ml二氯甲烷萃取。合并有機相，用硫酸鈉干燥，過濾并真空除去溶劑，得到88.14g，80%產率，蒎烷二醇(R)-5-(3，7-二甲基黃嘌呤)-1-甲基戊基硼酸酯。
在氮氣氛、攪拌下，將硼酸酯溶于THF/水(每次300ml)，將混合物冷卻至0℃。保持內部溫度為0℃，滴加入95ml 3N氫氧化鉀，接著滴加入30%過氧化氫。將混合物攪拌2小時，濾出固體。加入水和二氯甲烷(每次300ml)。分離各相，水相用二氯甲烷洗滌4×100ml。合并的有機相用硫酸鈉干燥，過濾并蒸發。用少量二氯甲烷和大量乙醚重結晶。得到46.3g(87%)(R)-1-(5-羥己基)-3，7-二甲基黃嘌呤，m.p.105-108℃，[α]D＝-5.63，ca.96%ee實施例3本實施例說明用DICHED作為手性源制備(R)-1-(5-羥己基)-3，7-二甲基黃嘌呤(CT1501R)的方法用(1S，2S)-(1，2)-二環己基乙二醇(DICHED)代替實施例2所述的蒎烷二醇手性源。該手性源比蒎烷二醇更易回收。根據sharpless等，J.Org.Chem.572768，1992所述方法制備DICHED。將上述制備的二甲基-4-溴丁基硼酸酯(10.1g，48.06mmol)與10.54g(46.6mmol)(S，S)-DICHED的100ml乙醚溶液混合。30分鐘后，除去乙醚，殘余物通過10g硅膠短柱，用石油醚/乙醚(9∶1)洗脫，得到17.8g(S，S)DICHED4-溴丁基硼酸酯類似物。
用下列試劑量按實施例2所述方法進行同系化反應17.8g DICHED4-溴丁基硼酸酯;6.11g二氯甲烷;41.2ml 1.4N正丁基鋰;100ml THF和5.89g無水氯化鋅。
用下列試劑量按實施例2所述方法進行格利雅反應DICHED(R)-1-氯-5-溴戊基硼酸酯，20.04g;3.0N甲基溴化鎂，16.7ml;150mlTHF。在50ml燒瓶中，將DICHED5-溴-1-甲基戊基硼酸酯溶于THF(10ml)中，氧化DICHED硼酸酯得到(R)-6-溴己-2-醇。將水(10ml)加至該溶液中。溶液冷卻至0℃同時在氮氣氛下攪拌。加入碳酸鈉(16.5ml，3M溶液)。接著加入8ml 30%過氧化氫。將溶液過濾，加入20ml戊烷，再次過濾。分出水相，用戊烷(2×10ml)洗滌。有機相用硫酸鈉干燥，過濾，蒸發溶劑得到(R)-6-溴-己-2-醇，粗產量8.9g，真空蒸餾得到產量7.1g(84%)純物質，旋光度為-13.89[α]549。
將(R)-溴醇加至可可堿中，可可堿(2.02g，11.2mmol)與DMSO(30ml)的混合物攪拌，加入282mg氫化鈉(11.8mmol)。反應混合物劇烈攪拌80分鐘。滴加入溴醇(2.03g，11.2mmol)，繼續攪拌21小時。用高真空泵蒸出DMSO。加入水(100ml)。混合物用25%乙醇/二氯甲烷(3×50ml)萃取，合并的萃取液用硫酸鎂干燥并蒸發。將殘余物溶于20ml二氯甲烷中，加入150ml乙醚。得到米黃色晶體(R)-1-(5-羥己基)-3，7-二甲基黃嘌呤(1.5g，5.36mmol，47.8%產率)。將另外500mg產物結晶24小時得到總產量2g(64%總量)，ee大于94%(通過層析)。
實施例4本實施例說明合成(R或S)-1-(6-羥庚基)-3，7-二甲基-10-黃嘌呤或(R或S)-7-羥辛基-3，7-二甲基黃嘌呤的方法。用上述方法，使用合適的蒎烷二醇和DICHED，用長鏈溴烯，5-溴-1-戊烯和6-溴-1-己烯分別作為起始原料制備這些化合物。
實施例5本實施例說明CT1501R和PTX的混合淋巴細胞反應。混合淋巴細胞反應表示PBMC(外周血液單核細胞)對同種異體刺激的增生應答，它是用雙路混合淋巴細胞反應測定的。用這種免疫調節活性測定方法測定的CT1501R和PTX的活性如圖1所示。
實施例6本實施例表示CT1501R對被交聯的抗鼠抗體和/或白細胞介素-4(IL-4)刺激的鼠B-細胞增生的抑制作用。圖2表示CT1501R抑制由表現為增生信號引起的B細胞增生。
圖3表示CT1501R抑制由伴刀豆球蛋白A(Con A)和白細胞介素-1α(IL-1α)或白細胞介素-2(IL-2)引起的增生的作用。在用Con A和IL-1α或IL-2活性化之前2小時將CT1501R以所示劑量加到細胞中。CT1501R以劑量-應答方式抑制胸腺細胞增生如圖3所示。底數小于200cpm。
圖4表示CT1501R和PTX對由PDGF(血小板來源的生長因子)和IL-1刺激的平滑肌增生的抑制作用。在用PDGF和IL-1活化之前2小時將CT1501R和PTX分別加到細胞中。兩種藥劑均以較高劑量抑制平滑肌細胞增生如圖4所示，CT1501R活性高于PTX。
實施例7本實施例說明CT1501R的體外作用，包括抑制細胞因子釋放和細胞粘連。測定CT1501R對內毒素，TNF-α或IL-1α刺激的細胞因子的釋發，對活化的人臍內皮細胞的粘連的作用。
通過灌注小鼠腹膜分離出鼠腹膜滲出細胞的巨噬細胞(PEC)，并以每井5×105細胞裝入96井盤中。細胞用5μg/ml由馬流產沙門氏菌衍生的內毒素(LPS;Sigma Chemical Co.，L-1887)或50μg/ml IL-1α(Genzyme;Cambridge，MA)刺激，在加入刺激物之前一小時向培養液中加入或不加入CT1501R。在此后的各種時間，除去上層清液，用商品96井微型免疫測定包(Genzyme;TNFEndogen，Boston，MA;IL-1α)，根據制造商的說明書測定TNF-α或IL-1α的濃度。為了進行粘連研究，將由商品供應者(Clonetics，San Diego，CA或Cell Systems，Seattle WA)得到早期繼代移植的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，并在加有酸性FGF(Cell Systems cat 401-111)的確定的、Hepes緩沖的血清游離培養基(Cell，Systems，cat 301-180)中培養。將4000個細胞裝入96井微型盤的每一井中并在37℃下培養72小時。在加有10%胎腓腸血清的RPMI 1640培養基中刺激組織細胞的白血病細胞系U937。用LPS，IL-1α或TNF-α刺激HUVEC或U937細胞12小時。為了進行粘連測定，U937細胞用熒光成活的著色劑，2′，7′-雙(2-羧乙基)-5(和-6)-羧熒光素乙酸基甲酯(BCECF)進行標記。簡單地說，細胞用10μg/ml BCECF的RPMI-1640培養基加上10%胎腓腸血清在37℃下標記30分鐘。細胞用整個培養基洗滌一次，將50，000個細胞/井加至HUVEC培養物中。試樣在37℃培養30分鐘，在400×g下轉化和離心10分鐘，在加入100ml Hanks平衡鹽水溶液(HBSS)后，用Millipore Cytofluor熒光板讀出器(激勵488nm;發射525nm)分析微型板。一系列細胞稀釋劑的熒光表示在很寬的細胞濃度每井20至100，000個細胞范圍內線性濃度關系(沒有數據表示)。所有實驗重復至少兩次，所有結果均證實了所示的發現。
CT1501R抑制LPS刺激PEC細胞釋放的TNF-α。細胞用250mM CT1501R預處理，在LPS刺激后，用ELISA以釋放的TNF-α用為時間的函數測定上清液。在所有所測的時間點，CT1501R明顯地抑制了TNF-α的釋放，從在6-24小時的約50%LPS誘導深度至在48小時的約70%。CT1501R對釋放的TNF的作用的劑量反應如圖18所示。PEC細胞用LPS刺激1小時后，接著用各種濃度的CT1501R處理。CT1501R 50%抑制的濃度為大約30μM。在500μM時，CT1501R的抑制作用是最大LPS刺激(1428pg/ml)的大約40%。
LPS刺激腹膜巨噬細胞的IL-1α釋放，在LPS刺激后，在12小時內增加至濃度為24pg/ml，在48小時內至31pg/ml(圖19)。加入CT1501R在12-48小時內明顯地減少了IL-1α的釋放，在24小時，最大的抑制率為約50%。如果腹膜巨噬細胞用50ng/ml IL-1α刺激而不是用LPS刺激(圖20)，CT1501R也能抑制TNF-α的釋放(圖20)。在測定時間點，加入CT1501R產生TNF-α誘導濃度的50%-70%抑制率。
通過辨認和約束血管內皮細胞使免疫譜系細胞離開血液。因此免疫細胞在內皮細胞和周圍組織之間移動。粘連在內皮細胞和滲出物上的免疫細胞試樣提供了體內處理炎癥和致動脈粥樣化的應答的預想試樣。用TNF-α，IL-1α或LPS活化內皮細胞向上調節了某些粘連分子，并增加了它們的淋巴細胞、單核細胞、嗜曙紅細胞和中性白細胞的粘連力。細胞系U937用于試驗CT1501R抑制對活化的HUVEC的粘連。U937細胞表現出許多單核細胞的表現型特征，包括出現integnin VLA-4(它通過血管粘連分子1(VCAM)使單核細胞連接內皮細胞)，以及出現在內皮細胞上的一些免疫球蛋白總科。HUVEC用選自IL-1α，TNF-α或LPS的活化劑處理過夜，在加入活化劑之前一小時加入或不加入250μM CT1501R。如圖21所示，通過加入CT1501RU937細胞對HUVEC的本底附著沒有明顯的作用。然而，用CT1501R預處理能明顯地抑制活化的HUVEC的相對粘連力。可觀測到CT1501R能抑制用TNF-α，IL-1α或LPS刺激的HUVEC。
相反地，用IL-1α活化的U937也能增加未刺激的HUVEC的相對粘連力(圖22)。用250μM CT1501R預處理U937細胞能有效地阻止IL-1α傳導增大對HUVEC的粘連至接近本底濃度。
CT1501R抑制在腹膜巨噬細胞、人U937組織細胞的白血病細胞系和人臍靜脈內皮細胞中LPS，TNF-α和IL-1α傳導的炎癥信號途徑和伴發的細胞應答。CT1501R能明顯地減少從用LPS刺激的腹膜巨噬細胞釋放前炎癥細胞因子TNF-α和IL-1α。用10μg/ml LPS刺激的TNF-α抑制的IC30為大約30μM。CT1501R阻止IL-1α活化的PEC釋放TNF-α。CT1501R抑制增大U937細胞對TNF-α，IL-1α或LPS活化的HUVEC的粘連。最后，CT1501R抑制IL-1α誘導的活化和增大U937細胞對未刺激的HUVEC的粘連力。
實施例8本實施例說明裸體小鼠毛發研究包括CT1501R的表面應用。將來自Charles River Laboratories的6至8周齡，雌性，nu/nu小鼠在Biosupport Research Support Services(Seattle，WA)的高壓滅菌小型隔離單元中，用過氯化高壓滅菌水、照射過的嚙齒食物喂養，并置于層流通風櫥中。每周換一次籠子，每周換兩次水。在開始每次研究之前，小鼠適應水土5天。
第一個表面制劑的制備是通過將CT1501R以1%濃度加到熱的親水的藥膏中，并固化。
用無菌的涂藥器將CT1501R的第一個表面制劑涂敷在裸鼠的左脅上，同樣基質的其他化合物涂敷在右脅上，每天兩次，歷時16天。用帶有面罩和無菌手套的涂藥器在層流通風櫥中處理小鼠。16天后，通過頸脫位使一只小鼠致死，在經處理的肩/脅區域和未處理的背側骨盆(rump)區域進行皮膚活組織檢查。將樣品置于10%緩沖的福爾馬林溶液中，活組織檢查試樣送至獸醫皮膚病專家進行病理組織學研究，處理后6周，使另一只小鼠安然致死，與第一只一樣進行活組織檢查。試樣也進行病理組織學研究。
第一只的試樣的結果表明處理過的部分比未處理的部分明顯出現更多的毛囊。用CT1501R和其他化合物處理的部分大量毛干從毛囊中伸出，而未處理的部分則沒有。
在第二次試驗中，CT1501R的表面應用與已被批準為毛發生長指示劑商品的表面長壓定制劑(Rogaine
，Upjohn)一起進行。將來自Bantin and Kingman Universal的5至6周齡，雌性，nu/nu小鼠在Biosupport Research Support Services(Seattle，WA)的高壓滅菌小型隔離單元中，用過氯化高壓滅菌水、照射過的嚙齒食物喂養，并置于層流通風櫥中。每周換一次籠子，每周換兩次水。在開始每次研究之前，小鼠適應水土7天。
將CT1501R和其他兩種化合物配制在60%ETOH，10%水和30%PEG的表面制劑中以及僅有一種載體的表面制劑中。Minoxidil作為商品制劑Rogaine 可從當地藥房購買。Rogaine 是以相同的制劑基準出售。對于每一特定試驗帶，小鼠用特殊的尾標記確定，每組兩只小鼠用CT1501R和其他化合物處理，一只小鼠用載體和Minoxidil之一處理。在層流通風櫥中用帶有面罩和無菌手套的涂藥器處理小鼠。每只小鼠每天處理兩次，并且用各自的無菌涂藥器以避免溶液或小鼠的污染。所有的小鼠被涂以沿從頭顱底部至尾底部的背部中心線的一條合適的試驗帶，約1.5cm寬。34天后，用過量的氟烷麻醉劑使所有小鼠安然致死。將7只小鼠的每一只在肩胛(大小約為1×1.5cm)之間頸的頸背進行皮膚活組織檢查，所有試樣吸附在紗布上，除去血液和液體，并固定在一片切開的木制壓舌板中，將試樣分別側下置于有標記的含有10%緩沖福爾馬林容器中。試樣送至獸醫皮膚病專家進行定性病理組織學測定。
主觀檢查表明載體處理的小鼠(對照)僅有少量充分發育的毛囊。毛發對處理的反應在用Minoxidil處理小鼠中非常明顯。CT1501R和其他化合物處理的小鼠具有最大的毛囊密集度。另外，小鼠的可見檢查表明CT1501R鼠是在CT1501R、Minoxidil和對照中具有最多的“毛發”。因此，以這種模式促進毛發生長，CT1501R至少與Minoxidil一樣好。所以，1-4%CT1501R(重量)的表面制劑是治療禿發和促進毛發生長的有效治療組合物。
實施例9本實施例說明CT1501R對給予致死劑量內毒素的小鼠的存活的作用。用鼠模型測定CT1501R是否能防止內毒素誘導的致死率。將內毒素注射給6-8周齡雌性Balb/c鼠作為腐敗性休克模型，它類似于以前公開的報告(Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8810535-10539，1991)，報告的原始記錄已被Animal Use Committee of the Biomembrane Institute，Seattle，WA批準。動物被靜脈內(i.v)注射大約LD100劑量(10μg/g)馬流產沙門氏菌衍生的內毒素(Sigma Chemical Co.，L-1887)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。CT1501R以劑量100μg/Kg腹膜內(IP)注射每天3次(100ml/每次注射)，對照鼠在同樣時間用相同體積的載體對照樣(PBS)注射，存活至少為72小時。
為了進行血漿中細胞因子濃度的ELISA測定，從麻醉的鼠的眶后或心臟穿刺收集血液，馬上離心并將EDTA血漿貯存在-70℃。將顆粒狀游離的血漿融化在冰上，用商品ELISA測定儀測定細胞因子的濃度，用正常鼠血漿繪出標準曲線。鼠腫瘤壞死因子-α和白細胞-1α包可分別從Genzyme(Cambridge，MA)和Endogen(Boston，MA)購買。每個數據點是由三只鼠的混合EDTA血漿的兩次ELISA測定的平均值。總結在表3中的數據是由兩次獨立的實驗完成的;表4和5的數據是由每個數據點三只鼠的單一實驗得來的。
用與實驗鼠一樣的時間安排，將10只鼠每只單獨用PBS或單獨用CT1501R處理。在整個實驗過程中(沒有數據表示)沒有明顯的不利影響，存活率為100%。內毒素存活率數據是由總共6次獨立實驗所總結的。概括的表1詳細地說明了6次實驗的每一次的結果。累積的存活百分率在表2中給出并繪成圖5。在圖5中，每一時間點表示3次實驗的最小值，該實驗每組至少20只鼠。用Fisher精確一尾試驗進行存活數據的可靠性分析在表3中給出。在LPS處理后馬上服用CT1501R呈現出明顯的保護作用。用LPS處理后72小時累積的存活百分率為60%，而僅用LPS處理的動物為7%(P＝＜0.0005;表3)。
用LPS處理后，延遲CT1501R給藥時間的作用也如圖5所示。動物用LPS處理并在LPS處理后兩小時或四小時施用CT1501R。CT1501R再一次表現出明顯的保護作用。CT1501R處理的鼠的存活率在2小時內為55%，在4小時內為37%，與此相比，僅用LPS處理的鼠的存活率為7%(分別為P＝0.0005和P＝0.001;表3)。
測定鼠血漿中TNF-α，IL-1α和IL-6的濃度并作為用馬流產沙門氏菌內毒素處理后的時間函數。這些數據與用內毒素處理動物接著馬上單獨腹膜內注射CT1501R的數據比較。TNF-α濃度在用內毒素處理后1小時內達到最高點(表4和圖6)。在所有所測的時間點，用CT1501R處理鼠降低了內毒素處理鼠的EDTA血漿中TNF-α的濃度。特別是，內毒素處理后0.5和1小時的TNF-α最高濃度在CT1501R處理的鼠中分別降低了2.5和2.6倍。
用內毒素處理后馬上用CT1501R處理也降低了血漿的IL-1α濃度(表5;圖7)。特別是，用內毒素處理后的6.12和18小時所觀察到的最高濃度分別降低了1.2，4.3和3.2倍。最后用同樣的方法測定IL-6(表6，圖8)。在CT1501R處理的動物中在3，6和12小時最高血漿濃度也降低了(分別降低了1.7，2.0和4.1倍)。
CT1501R明顯地提高了接受使44只鼠中41只鼠致死的劑量內毒素的鼠的存活率。與對照樣相比，在用內毒素刺激或用內毒素處理后2小時或4小時施用CT1501R，存活率提高了。在內毒素處理后馬上施用單劑量的CT1501R明顯地降低了最大的TNF-α，IL-1α和IL-6的血漿濃度。
表2.由表1數據所得的總的鼠存活率
實施例10本實施例說明CT1501R對5-氟尿嘧啶(5-FU)誘導的鼠骨髓抑制的作用。用鼠模型測定CT1501R是否影響在具有細胞毒素作用的化療后造血重組所需時間。將雌性Balb/c鼠(VAF，Charles River Laboratories，6-8周齡，約17.3-18.5g)用5-FU處理，在實驗1中以劑量200mg/Kg腹膜內(i.p)注射，在實驗2中劑量為190μg/Kg。CT1501R或載體對照樣在5-FU處理前一天開始以劑量100μg/Kg腹膜內給藥每天二次，繼續給藥直至在實驗1的第13天，在實驗2的第15天使最后一只鼠致死。對照樣包括用CT1501R或載體而沒有5-FU處理的鼠。在5-FU處理后的開始2天，通過在氟烷麻醉下進行心臟穿刺接著使頸脫位而使鼠(每組4只)致死，進行總的白血細胞計數和分別計數。用相-對比顯微鏡對副本進行血小板計數。收集股骨，用美洲商陸有絲分裂源脾調節介質作為生長因子，用標準測試器(Terry Fox Laboratories，Vancouver，British Columbia)測定每股骨中粒細胞-巨噬細胞集落形成細胞(CFU-GM)的數量。將每根股骨分別涂敷三次，計算每次試驗點的平均值，用于統計分析的標準偏差是每根股內測定的集落的數量的平均值的偏差。
用載體對照樣式CT1501R處理的鼠沒有出現副作用。僅用載體對照樣處理的鼠提高了絕對中性白細胞數(ANC)和白血細胞數(WBC)，而此時在CT1501R處理的鼠中沒有觀察到。這些差異在4天和8天明顯不同于0天的值(分別為P＝0.012和P＝0.016;二尾學生T試驗)。與接受CT1501R的鼠相比，對照樣處理的鼠在第4天明顯具有較高的白血細胞數(P＝0.009)，在第12天明顯具有較高的中性白細胞數(P＝0.028)。與0天的值(P＝0.028)相比，對照樣處理的鼠在第12天明顯提高了粒細胞數(P＝0.028)。CT1501R處理的鼠的WBC和ANC保持在對照樣值的1SD內。
在第6和10天，5-FU處理鼠的WBC，在用載體處理對照樣時明顯低于CT1501R處理的鼠(分別為P＝0.019和0.036)(圖10)。對于不同血液計數，在第6和8天的兩組，所有細胞具有淋巴細胞的形態。在第10天，一些單核細胞和少量粒細胞出現在CT1501R處理的動物中。在第13天，CT1501R具有平均值±SD ANC440±17/mm3，而對照鼠具有180±10/mm3(P＝0.05)(圖10)。
通過測定CFU-GM數量/股骨估計造血前體細胞的恢復。在5-FU處理后，用載體對照樣和CT1501R處理的鼠抑制CFU-GM至接近不能測到的濃度，直至第8天當恢復開始時(圖13)。到第13天，出現明顯的偏離。在第13天，CT1501R處理的鼠具有的CFU-GM/股骨明顯多于載體對照樣動物(P＝0.024)和在0天處理前致死的動物(P＝0.05)，從而表明出現前體恢復。
實驗2類似于實驗1，但下列除外(1)5-FU劑量降至185mg/Kg;(2)在第10至第15天進行每天抽血。(3)進行血小板計數。實驗2的結果用圖10-13圖形表示。與實驗1一樣，用CT1501R處理的鼠具有明顯較高的WBC值(圖10)，在CT1501R處理的鼠的中性白細胞恢復加速(圖12)。與載體對照樣動物相比，血小板計數最低值與恢復速度也增加(圖11)。與對照動物相比，在造血恢復中，每根股骨的細胞數增加，每根股骨的CFU-GM數也增加(圖13)。
在接受較高骨髓抑制劑量的5-FU的鼠中，CT1501R處理提高了增加中性白細胞數的速度以及具有定型的骨髓前體細胞的骨髓的再生速度。在每一所測時間點，CT1501R抑制了5-FU誘導的總WBC的抑制。然而，直至第10天，在細胞中少量淋巴細胞形態出現增加。在實驗1的第13天和在實驗2的第10天，在用CT1501R處理的鼠中的中性白細胞明顯高于對照處理的鼠。通過CT1501R刺激造血恢復也影響了巨核細胞系。試驗動物的血小板最低數明顯高于對照動物，并迅速增加血小板數且大大地超過載體對照動物。
刺激造血也可通過恢復骨髓細胞構成并定量計算骨髓前體細胞來證實。與對照動物相比，在造血恢復中，CT1501R處理的鼠幾乎增加了二倍的CFU-GM數/股骨。
在沒有接受5-FU的動物中，用CT1501R處理防止了與載體對照樣有關的ANC上升和CFU-GM/股骨上升。所有CT1501R處理的動物使ANC保持在未注射的對照樣的一個標準偏差內。很明顯CT1501R防止了緊張誘導以及可能是細胞因子傳導的對每天兩次腹膜內注射的應答。
與未處理小鼠相比，用CT1501R處理的小鼠顯示出較好的存活率(圖14)總之，這些數據支持在細胞毒性或細胞減少治療后使用CT1501R和本發明化合物加速造血重組的方法。
權利要求
1.一種包含下式結構的取代黃嘌呤化合物
其中R1代表獨立的實質上不含其它異構體的拆分對映體ω-1仲醇取代的烷基(C5-8)，并且各個R2和R3獨立表示可任意含有一個或兩個非相鄰的取代替了其中碳原子的氧原子的烷基(C1-12)。
2.權利要求1的化合物，其中R1代表R-對映體形式具有羥基的C6烷基。
3.權利要求2的化合物，包括R-1-(5-羥基己基)可可堿。
4.權利要求1的化合物，其中R1代表R-異構體的6-羥基-庚基或7-羥基辛基。
5.一種藥物組合物，包括權利要求1的化合物和藥學上可接受的賦形劑，其中藥物組合物可被制成適合病人口服，非腸道，活體外或局部給藥的制劑。
6.權利要求5的藥物組合物，其中化合物的口服劑量為每天約500mg至1500mg，分二或三次給用，非腸道劑量為24小時時間內給用約1.0g至5.0g(靜脈注射，腹膜內給藥，肌內注射，或S.C.)，局部制劑濃度為約1%至4%重量比，且體外培養物濃度為約10μM至500μM。
7.權利要求1中所述的取代黃嘌呤化合物在制備用于治療由增加的第二信使活性傳遞的疾病的藥物中的應用，其中所述疾病通過抑制對外部或原位初次刺激的免疫應答來表征或被治療，其中所述細胞應答通過特異性磷脂堿化的第二信使作用相鄰的細胞的細胞膜的內部小葉來傳遞。
8.權利要求1中所述的取代黃嘌呤化合物在制備用于治療疾病的藥物中的應用，其中所述疾病選自應答活化致腫瘤基因的腫瘤細胞增生;細胞減少療法引起的血細胞減少;T細胞應答或B細胞應答和抗體產物引起的自身免疫病;敗血性休克;間質細胞對腫瘤壞死因子(TNF)的抵抗;平滑肌細胞，內皮細胞，成纖維細胞及其它細胞種類應答生長因子的增生;動脈粥樣硬化，再狹窄，冠狀動脈疾病，血管病，人免疫缺陷病毒感染，應答IL-1mip-1α，PDGF或FGF的腎小球膜細胞增生;炎癥;應答環孢菌素A或兩性霉素B治療的腎小球或腎小管毒性;應答細胞減少療法的器官毒性;非烷基化抗腫瘤劑的增大抗腫瘤效應;應答由細胞表面金屬蛋白酶的產生表征的或由應答IgE的肥大細胞和嗜堿細胞的失粒表征的炎性刺激的變應性，由過多的破骨細胞的破骨細胞活化因子(OAF)引起的骨病，由降低神經腎上腺素和乙酰膽堿的信號傳導而引起的CNS病，以及它們的結合病癥。
9.權利要求1中所述的取代黃嘌呤化合物在制備用于治療或預防敗血性綜合癥，包括敗血性休克的藥物中的應用。
10.權利要求1中所述的取代黃嘌呤化合物在制備用于治療或預防由細胞減少療法引起的白細胞減少或器宮毒性的藥物中的應用。
11.權利要求1中所述的取代黃嘌呤化合物在制備用于治療或預防由免疫抑制劑，包括環孢菌素A和FK506引起的副作用的藥物中的應用。
12.權利要求1中所述的取代黃嘌呤化合物在制備用于治療由細胞減少療法引起的禿頭，頭發損傷或allopecia。
13.權利要求1中所述的取代黃嘌呤化合物在制備用于治療疾病的藥物中的應用，其中所述疾病選自腫瘤負擔，激素有關疾病，神經疾病，自身免疫疾病，炎癥，再狹窄，高血壓，不需要的免疫應答，病毒感染，腎炎，粘膜炎，變應性應答，以及中樞神經系統疾病。
全文摘要
本發明公開了在3，7-二取代黃嘌呤的1位上具有被直鏈烷基(C
文檔編號A61K31/519GK1085557SQ9310368
公開日1994年4月20日 申請日期1993年3月4日 優先權日1992年3月4日
發明者J·A·比安科, P·伍德森, D·波盧伯克, J·辛格 申請人:細胞治療有限公司