一種海綿細(xì)胞膜提取物及其作為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種海綿細(xì)胞膜提取物，以及該種海綿細(xì)胞膜提取物作為血管緊張素 轉(zhuǎn)化酶抑制劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 海綿是世界上第一也是最原始的多細(xì)胞動物，其種類至今已發(fā)展到1萬多種，占 海洋動物種類的1/15,是一個龐大的海洋"家族"。正是由于其數(shù)量巨大，種類眾多，為海洋 天然產(chǎn)物的研究提供了可能。
[0003] 八十年代初用于海綿天然產(chǎn)物的活性研究的樣品主要是萃取混合物，如劉錫金、 方振生等研究了一些海綿萃取液的生物活性。在其論文中所涉及的方法雖然對進一步分離 得到相關(guān)的活性物質(zhì)有一定指導(dǎo)作用，但還是會忽略海綿中可能存在的其它活性物質(zhì)。目 前已經(jīng)從海綿中發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物包括留醇、萜類、脂肪醇甘油醚、生物堿和長鏈酰胺等。除 此之外，也在海綿中發(fā)現(xiàn)了大量具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等活性物質(zhì)。但整體說來，我國對 海綿的研究還處于起步階段，不但分離出來的生理活性物質(zhì)較少，而且也還沒有發(fā)現(xiàn)真正 能應(yīng)用于臨床的藥物。
[0004] 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin Converting Enzyme,簡稱ACE)，主要參與的是 腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。ACE在催化血管緊張素 I (angiotensin I)轉(zhuǎn)變 為具有強效升高血壓作用的物質(zhì)--血管緊張素 II (angiotensin II)。因此，尋找抑制 ACE活性的物質(zhì)和組分是擴張外周血管、降低總外周阻力和降低血壓的重要途徑。
[0005] 心腦血管疾病是威脅當(dāng)代人類健康的主要疾病，高血壓是其中的分類體征之一， 面對高血壓發(fā)病率的不斷增長，越來越多的醫(yī)藥研究致力于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑 (Angiotensinconverting enzyme inhibitor,簡稱ACEI)的發(fā)現(xiàn)與研發(fā)，而在此過程中實 現(xiàn)抑制劑降壓效果體外檢測的重要途徑就是測試其對ACE活性的抑制作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述不足，提出一種海綿細(xì)胞膜提取物，以 及該種海綿細(xì)胞膜提取物作為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種海綿細(xì)胞膜提取物，其特征在于：所述的海綿細(xì) 胞膜提取物按照以下步驟制備獲得： a、 用純水清洗去冰凍的海綿組織表面的雜物，將海綿組織粉碎并勻漿，獲得海綿勻漿， b、 將海綿勻漿與純水按照1:1的體積比混合獲得稀釋海綿勻漿，向稀釋海綿勻漿中加 入蛋白酶K溶液以獲得混合溶液，使混合溶液中蛋白酶K的濃度范圍在200. 0~270. 0 //g/ mL之間，在52~57°C的溫度下使混合溶液酶解80~95min，獲得海綿酶解漿液，對海綿酶解漿 液進行過濾，去除濾渣，獲得海綿酶解液， c、 將海綿酶解液在6~12°C的溫度下以600g離心4~8min，棄去上清液得到沉淀組分A1, 將A1用純水溶解后，再一次在6~12°C的溫度下以600g離心4~8min，棄去上清液得到沉淀 組分A2，將A2用純水溶解后置入勻漿器中，以間隔30s的方式均質(zhì)化120s，然后在6~12°C 的溫度下以600g離心15min，棄去沉淀得到上清液B1，將上清液&在2~6°C的溫度下以 15000g離心20~25min，棄去沉淀得到上清液B 2，將上清液氏在2~6°C的溫度下以IOOOOOg 離心40~50min，棄去上清液得到沉淀組分A3，沉淀組分A3即為海綿細(xì)胞膜提取物。
[0008] -種如上所述的海綿細(xì)胞膜提取物，其特征在于：所述的海綿細(xì)胞膜提取物作為 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的應(yīng)用。
[0009] 所述的海綿組織選用南海多皺軟海綿的海綿組織。
[0010] 本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點： 本申請所公開的海綿細(xì)胞膜提取物的制備方法具有快速、提取效率高等特點，并且該 提取物來自于海洋中的天然產(chǎn)物一海綿，屬于非經(jīng)濟類生物，其經(jīng)濟成本較低，容易獲 得。另外，本提取物與其他同類的天然提取物相比，具有高ACE酶抑制活性，效果更好。綜 上所述，本方法以及利用本方法制備的提取物具有多種優(yōu)點，特別適合于在本領(lǐng)域中推廣 應(yīng)用，其市場前景十分廣闊。
【附圖說明】
[0011] 圖1為本發(fā)明實施例的海綿細(xì)胞膜提取物在熒光顯微鏡下的圖片。
[0012] 圖2為不同濃度下的海綿細(xì)胞膜提取物與ACE酶抑制活性的關(guān)系曲線。
【具體實施方式】
[0013] 下面將結(jié)合【附圖說明】本發(fā)明的【具體實施方式】。如圖1、圖2所示：一種海綿細(xì)胞膜 提取物，按照以下步驟制備獲得：首先用純水清洗去冰凍的海綿組織表面的雜物，將海綿組 織粉碎并勻漿，獲得海綿勻漿；將海綿勻漿與純水按照1:1的體積比混合，獲得稀釋海綿勻 漿，向稀釋海綿勻漿中加入蛋白酶K溶液，并混合均勻，最終保證混合溶液中蛋白酶K的濃 度范圍在200. 0~270. 0 //g/mL之間，并在52~57°C的溫度下使混合溶液酶解80~95min，獲 得海綿酶解漿液，對海綿酶解漿液進行過濾，去除濾渣，獲得海綿酶解液；將海綿酶解液在 6~12°C的溫度下以600g離心4~8min，棄去上清液得到沉淀組分A 1，將A1用純水溶解后，再 一次在6~12°C的溫度下以600g離心4~8min，棄去上清液得到沉淀組分A 2，將^用純水溶 解后置入勻漿器中，以間隔30s的方式均質(zhì)化120s，然后在6~12°C的溫度下以600g離心 15min，棄去沉淀得到上清液B 1，將上清液&在2~6°C的溫度下以15000g離心20~25min，棄 去沉淀得到上清液B2，將上清液氏在2~6°C的溫度下以IOOOOOg離心40~50min，棄去上清 液得到沉淀組分A 3，沉淀組分A3即為海綿細(xì)胞膜提取物。
[0014] 利用上述方法所獲得的海綿細(xì)胞膜提取物，可以作為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE酶） 的抑制劑而應(yīng)用。下面利用上述的海綿細(xì)胞膜提取物進行血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE酶)的抑 制活性實驗： 稱取適量的細(xì)胞膜提取物，加入濃度為1%的甲醇水溶液，配制成一定濃度的細(xì)胞膜提 取物溶液。然后分別移取5//L細(xì)胞膜提取物溶液于離心管中，并置于37°C水浴中。接著 加入ACE緩沖液15//L，37°C條件下震蕩反應(yīng)5分鐘后加入25//L HHL溶液(馬尿酰-組胺 酰-亮氨酸的濃度為7. 6mmol/L，pH=8. 3)，震蕩反應(yīng)30分鐘。然后加入5 //L的10%三氟 乙酸終止反應(yīng)，得到反應(yīng)液樣品。將上述反應(yīng)液在4°C條件下以6745Xg離心20min,取上 清液直接進行HPLC分析。由ACE作用底物得到的馬尿酸通過HPLC進行定量分析。同時作 空白試驗,除加等量1%甲醇水溶液替代樣品外,其他操作相同。
[0015] 實驗結(jié)果表明：海綿細(xì)胞膜提取物對ACE酶的抑制活性是隨著其濃度的增加而增 長的。且在濃度達到30mg/mL時抑制率達到最大，約為93. 58%。隨后，隨著細(xì)胞膜提取物濃 度的增加，抑制率保持不變，約為93. 06%。
[0016] 實驗例1 :配制海綿細(xì)胞膜樣品濃度梯度為20. 00、30. 00、40. 00、50. 00、60. 00、 70. 00、80. 00mg/mL，測定此系列樣品及空白對照組中馬尿酸的峰面積，具體數(shù)據(jù)如表1所 示。從表中可知，該梯度濃度系列的海綿細(xì)胞膜樣品對ACE的抑制率都高達90%以上，并且 在該系列濃度梯度范圍內(nèi)并沒有體現(xiàn)出明顯的抑制活性的變化。
[0017] 實驗例2 :配制海綿細(xì)胞膜提取物梯度濃度為0· 50、L 25、2· 50、5· 00、10· OOmg/ mL，測定其相應(yīng)的ACE酶抑制率，其結(jié)果如表2所示。表中的數(shù)值明確顯示：樣品濃度為0. 5 mg/mL時，對ACE酶沒有抑制率；可隨著濃度的升高，抑制率隨之增加，且濃度在1. 25 mg/mL 和2. 5 mg/mL后ACE抑制率產(chǎn)生激增的現(xiàn)象，最高抑制率達到了 88. 07%。
[0018] 表1是實驗例1中海綿細(xì)胞膜提取物濃度與對ACE酶活性抑制后所得的實驗數(shù) 據(jù)。
【主權(quán)項】
1. 一種海綿細(xì)胞膜提取物，其特征在于：所述的海綿細(xì)胞膜提取物按照以下步驟制備 獲得： a、 用純水清洗去冰凍的海綿組織表面的雜物，將海綿組織粉碎并勻漿，獲得海綿勻漿， b、 將海綿勻漿與純水按照1:1的體積比混合獲得稀釋海綿勻漿，向稀釋海綿勻漿中加 入蛋白酶K溶液以獲得混合溶液，使混合溶液中蛋白酶K的濃度范圍在200. 0~270. O //g/ mL之間，在52~57°C的溫度下使混合溶液酶解80~95min，獲得海綿酶解漿液，對海綿酶解漿 液進行過濾，去除濾渣，獲得海綿酶解液， c、 將海綿酶解液在6~12°C的溫度下以600g離心4~8min，棄去上清液得到沉淀組分A1, 將A 1用純水溶解后，再一次在6~12°C的溫度下以600g離心4~8min，棄去上清液得到沉淀 組分A2，將A 2用純水溶解后置入勻漿器中，以間隔30s的方式均質(zhì)化120s，然后在6~12°C 的溫度下以600g離心15min，棄去沉淀得到上清液B1，將上清液&在2~6°C的溫度下以 15000g離心20~25min，棄去沉淀得到上清液B 2，將上清液氏在2~6°C的溫度下以IOOOOOg 離心40~50min，棄去上清液得到沉淀組分A3，沉淀組分A3即為海綿細(xì)胞膜提取物。
2. -種如權(quán)利要求1所述的海綿細(xì)胞膜提取物，其特征在于：所述的海綿細(xì)胞膜提取 物作為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海綿細(xì)胞膜提取物，其特征在于：所述的海綿組織選用南海 多皺軟海綿的海綿組織。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種對ACE酶具有抑制活性的海綿細(xì)胞膜提取物的制備方法。該海綿細(xì)胞膜提取物主采用差速離心的方法，先后經(jīng)過5次離心制備得到純度較高的細(xì)胞膜提取物。并將此細(xì)胞膜提取物進行了ACE酶抑制活性實驗。實驗結(jié)果表明：海綿細(xì)胞膜提取物對ACE酶的抑制活性是隨著其濃度的增加而增長的。且在濃度達到30mg/mL時抑制率達到最大，約為93.58%。因此，可以根據(jù)本制備方法得到的海綿細(xì)胞膜提取物研發(fā)具有降血壓活性的藥物和保健品等。
【IPC分類】A61K35-618, A61P9-12
【公開號】CN104546920
【申請?zhí)枴緾N201410840767
【發(fā)明人】孔亮, 劉琪, 李偉, 譚成玉
【申請人】大連海洋大學(xué), 孔亮
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月29日