本發明屬于制備抑制肽技術領域，具體涉及一種混合酶解制備文蛤血管緊張素轉化酶抑制肽的方法。
背景技術：
高血壓是困擾當今的一種心血管疾病，可導致嚴重的并發癥，對人類健康危害極大。血管緊張素轉化酶（Angiotensin-converting enzyme，ACE）在機體血壓調節過程中起重要作用，一方面ACE將無活性的血管緊張素Ⅰ轉化為具有強烈收縮全身微動脈，使血壓升高的血管緊張素Ⅱ；另一方面ACE能促進有降血壓作用的緩激肽分解，引起血壓升高。
食物蛋白源活性肽不僅能提供人體生長發育所需的營養，還具有調節血壓、抗凝血、抗菌、免疫、抗氧化、降膽固醇、調節神經系統、降血脂、護肝等功能。
先有技術提供多種制備抑制肽的方法，例如，中國發明授權專利文獻 一種利用海參制備ACE 抑制肽的方法 授權公告號 CN 102517364 B 該發明涉及一種利用海參制備ACE 抑制肽的方法，其是以包括鮮海參、或干海參、或水發參、或高壓參在內的海參為原料，脫鹽、軟化處理，制漿后加水，加熱滅除微生物，冷卻后加入復合蛋白水解酶或風味蛋白水解酶中的一種進行酶解，滅酶，冷卻后離心去除不溶物，上清液管濾，濾過液過3000Dalton 的有機膜截留分級，3000Dalton 以下的截留液通過納濾，干燥，得ACE 抑制肽。其酶解技術方案實現了最佳優化，經管濾、超濾、納濾進行分離提取技術，其提取的效率高，所得的ACE 抑制肽降壓效果好。本發明的方法工藝合理、操作簡便、可操作性強，易實現工業化生產。
文蛤是我國沿海常見的貝類，屬于優質蛋白源。文蛤提取物具有抗氧化、調節血壓、抗腫瘤和提高機體免疫作用等功效，是潛在的可開發降血壓活性物質，目前，還未見有利用文蛤制備抑制肽的研究報道。
現有技術中利用海參提取的抑制肽的方法簡單可操作性強，但其酶解效果和抑制肽的提取率有待提升。
技術實現要素：
本發明針對上述技術問題提供一種預處理時間短，抑制肽提取率優異、低失活，采用混合酶解而且酶解效果顯著的一種混合酶解制備文蛤血管緊張素轉化酶抑制肽的方法。
本發明針對上述技術問題所采取的方案為：一種混合酶解制備文蛤血管緊張素轉化酶抑制肽的方法，制備步驟如下：
1）預處理：將文蛤去殼取肉，放入處理液中浸泡后洗凈，勻漿，細化處理；將文蛤肉表面雜質和細菌去除，再進行勻漿及細化處理，便于酶解及提升酶解效果。
2）混合酶解：加入去離子水和鹽酸溶液調節pH，加入文蛤1~3%重量份的α- 胰凝乳蛋白酶，酶解結束后進行滅酶，加入鹽酸溶液調節pH，加入文蛤0.3~1.2%重量份的復合酶，滅酶；采用混合酶解，酶解效果優異，顯著提升了文蛤蛋白酶解成抑制肽，充分酶解，避免了部分蛋白未被酶解的情況，還防止文蛤抑制肽的損失。
3）納濾：將滅酶后的酶解液離心，取上清液，管膜過濾，納濾，收集納濾截留液；可很好的保存得到的文蛤抑制肽的完整結構和有效活性，保證文蛤抑制肽的功效。
4）凍干：將納濾截留液進行凍干處理，得文蛤抑制肽，采用凍干保存可最大程度的避免抑制肽的活性成分產生變性或失去活力。
步驟2中復合酶由以下成分及重量份組成：堿性蛋白酶5~15份、中性蛋白酶8~12份、風味蛋白酶2~6份、嗜熱菌蛋白酶2~4份和乳酸脫氫酶1~2份。在酶解過程中往往是一系列的復雜變化，一種酶只能催化一種反應，采用的復合酶可充分使文蛤蛋白酶解成抑制肽，提高抑制肽含量，避免了部分蛋白未被酶解的情況，而且酶解時間縮短，節約提取時間，采用的復合酶用量少，效果好，節約提取成本。
步驟1中將文蛤肉放入處理液浸泡1~2h后洗凈，采用勻漿機進行勻漿后用膠體磨進一步細化處理。通過1~2h的浸泡，充分的將文蛤肉表面雜質溶解，及殺滅細菌，避免細菌和雜質對酶解的影響，浸泡的時間較短，但效果優異，可節省提取時間，加快提取速度。
步驟2中加入的去離子水是文蛤肉體積的3~5倍，使文蛤肉充分浸泡于去離子水內，為調節pH值作工藝準備。
步驟2中：調節pH至6~7,加入文蛤1~3%重量份的α- 胰凝乳蛋白酶，酶解結束后在90~95℃條件下沸水浴滅酶10~20min，加入鹽酸溶液調節pH至7~8，加入文蛤0.3~1.2%重量份的復合酶，在90~95℃條件下沸水浴滅酶10~30min。以獲得優異的酶解效果。
步驟1中處理液由以下成分及重量份組成：納米銀6~8份、納米二氧化鈦1.5~3份、二氧化硅0.5~1份、抗生素0.01~0.1份、碳酸二甲酯1~3份和氟化氫銨0.3~0.5份。可快速有效的清除文蛤肉的雜質和細菌，對文蛤肉無損傷，無毒，減少預處理時間，加快提取效率。
步驟3中將滅酶后的酶解液冷卻至4℃，采用離心機進行離心，離心機轉速為4000~6000r/min,離心時間為10~20min。有效保證獲得的文蛤抑制肽的活性去除不容物質，獲得高含量抑制肽的上清液。
鹽酸溶液添加有氫氧化鈉1~2重量份、十六烷基三甲基氯化銨0.04~0.08重量份和二甲基乙酰胺0.1~0.2重量份。快速調節pH值，對文蛤蛋白質無損傷，保證酶效果優異。
步驟3中取上清液采用管膜過濾脫除大分子，管膜濾過液通過孔徑3000~6000Da的有機膜截留分級，收集截留液。可過濾掉大分子，獲得純度很高的抑制肽，不會損傷抑制肽的活性，提升抑制肽的提取率。
本發明相對于現有技術具有如下優點：
1)本發明所采用的原料為文蛤，產量高，價格低，獲取方便，提高了文蛤的綜合利用價值。
2）采用的混合酶解方式提高酶解液中的文蛤抑制肽含量，進而提高文蛤抑制肽的提取率，酶解充分，避免了部分蛋白未被酶解的情況，而且酶解時間縮短，用量減少，節約提取時間，效果優異，節約提取成本。
3）本發明制備的處理液可快速有效的清除文蛤肉的雜質和細菌，對文蛤肉無損傷，無毒，減少預處理時間，加快提取效率。
4）本發明使用的鹽酸溶液可達到快速調節pH值效果，對文蛤肉漿無損傷，減少提取時間。
5）本發明提取的文蛤抑制肽可應用于食品業、制藥業和飼料業。
6）本發明提供的制備方法預處理時間短，酶解效果優異，提取到的文蛤抑制肽含量和提取率高。
具體實施例
以下結合具體實施例作進一步詳細描述：
實施例1：
一種混合酶解制備文蛤血管緊張素轉化酶抑制肽的方法，制備步驟如下：
1）預處理：將文蛤去殼取肉，放入處理液中浸泡后洗凈，勻漿，細化處理；將文蛤肉表面雜質和細菌去除，再進行勻漿及細化處理，便于酶解及提升酶解效果。
2）混合酶解：加入去離子水和鹽酸溶液調節pH，加入文蛤1~3%重量份的α- 胰凝乳蛋白酶，酶解結束后進行滅酶，加入鹽酸溶液調節pH，加入文蛤0.3~1.2%重量份的復合酶，滅酶；采用混合酶解，酶解效果優異，顯著提升了文蛤蛋白酶解成抑制肽，充分酶解，避免了部分蛋白未被酶解的情況，還防止文蛤抑制肽的損失。
3）納濾：將滅酶后的酶解液離心，取上清液，管膜過濾，納濾，收集納濾截留液；可很好的保存得到的文蛤抑制肽的完整結構和有效活性，保證文蛤抑制肽的功效。
4）凍干：將納濾截留液進行凍干處理，得文蛤抑制肽，采用凍干保存可最大程度的避免抑制肽的活性成分產生變性或失去活力。
步驟2中復合酶由以下成分及重量份組成：堿性蛋白酶5~15份、中性蛋白酶8~12份、風味蛋白酶2~6份、嗜熱菌蛋白酶2~4份和乳酸脫氫酶1~2份。在酶解過程中往往是一系列的復雜變化，一種酶只能催化一種反應，采用的復合酶可充分使文蛤蛋白酶解成抑制肽，提高抑制肽含量，避免了部分蛋白未被酶解的情況，而且酶解時間縮短，節約提取時間，采用的復合酶用量少，效果好，節約提取成本。
步驟1中將文蛤肉放入處理液浸泡1~2h后洗凈，采用勻漿機進行勻漿后用膠體磨進一步細化處理。通過1~2h的浸泡，充分的將文蛤肉表面雜質溶解，及殺滅細菌，避免細菌和雜質對酶解的影響，浸泡的時間較短，但效果優異，可節省提取時間，加快提取速度。
步驟2中加入的去離子水是文蛤肉體積的3~5倍，使文蛤肉充分浸泡于去離子水內，為調節pH值作工藝準備。
步驟2中：調節pH至6~7,加入文蛤1~3%重量份的α- 胰凝乳蛋白酶，酶解結束后在90~95℃條件下沸水浴滅酶10~20min，加入鹽酸溶液調節pH至7~8，加入文蛤0.3~1.2%重量份的復合酶，在90~95℃條件下沸水浴滅酶10~30min。以獲得優異的酶解效果。
步驟1中處理液由以下成分及重量份組成：納米銀6~8份、納米二氧化鈦1.5~3份、二氧化硅0.5~1份、抗生素0.01~0.1份、碳酸二甲酯1~3份和氟化氫銨0.3~0.5份。可快速有效的清除文蛤肉的雜質和細菌，對文蛤肉無損傷，無毒，減少預處理時間，加快提取效率。
步驟3中將滅酶后的酶解液冷卻至4℃，采用離心機進行離心，離心機轉速為4000~6000r/min,離心時間為10~20min。有效保證獲得的文蛤抑制肽的活性去除不容物質，獲得高含量抑制肽的上清液。
鹽酸溶液添加有氫氧化鈉1~2重量份、十六烷基三甲基氯化銨0.04~0.08重量份和二甲基乙酰胺0.1~0.2重量份。快速調節pH值，對文蛤蛋白質無損傷，保證酶效果優異。
步驟3中取上清液采用管膜過濾脫除大分子，管膜濾過液通過孔徑3000~6000Da的有機膜截留分級，收集截留液。可過濾掉大分子，獲得純度很高的抑制肽，不會損傷抑制肽的活性，提升抑制肽的提取率。
實施例2：
一種混合酶解制備文蛤血管緊張素轉化酶抑制肽的方法，優選制備步驟如下：
1）預處理：將文蛤去殼取肉，放入處理液中優選浸泡1h后洗凈，采用勻漿機進行勻漿后用膠體磨進一步細化處理。通過優選的1h的浸泡，充分的將文蛤肉表面雜質溶解，及殺滅細菌，避免細菌和雜質對酶解的影響，浸泡的時間較短，但效果優異，可節省提取時間，加快提取速度。
2）混合酶解：加入去離子水和鹽酸溶液調節優選pH至6.5,加入優選文蛤1.5%重量份的α- 胰凝乳蛋白酶，酶解結束后優選在93℃條件下沸水浴滅酶優選10min，加入鹽酸溶液調節優選pH至8，加入優選文蛤0.5%重量份的復合酶，在優選92℃條件下沸水浴滅酶優選15min。加入的去離子水是文蛤肉體積優選的5倍，使文蛤肉充分浸泡于去離子水內，為調節pH值作工藝準備。采用混合酶解，酶解效果優異，顯著提升了文蛤蛋白酶解成抑制肽，充分酶解，避免了部分蛋白未被酶解的情況，還防止文蛤抑制肽的損失。
3）納濾：將滅酶后的酶解液冷卻至4℃，采用離心機進行離心，離心機轉速優選為5000r/min,離心時間優選為15min，取上清液，用管膜過濾脫除大分子，管膜濾過液通過孔徑優選5000Da的有機膜截留分級，收集截留液，可過濾掉大分子，獲得純度很高的抑制肽，不會損傷抑制肽的活性，提升抑制肽的提取率。納濾，收集納濾截留液；可很好的保存得到的文蛤抑制肽的完整結構和有效活性，保證文蛤抑制肽的功效。
4）凍干：將納濾截留液進行凍干處理，得文蛤抑制肽，采用凍干保存可最大程度的避免抑制肽的活性成分產生變性或失去活力。
步驟2中復合酶由以下成分及重量份組成：優選堿性蛋白酶10份、優選中性蛋白酶10份、優選風味蛋白酶3份、優選嗜熱菌蛋白酶2份和優選乳酸脫氫酶1份。在酶解過程中往往是一系列的復雜變化，一種酶只能催化一種反應，采用的復合酶可充分使文蛤蛋白酶解成抑制肽，提高抑制肽含量，避免了部分蛋白未被酶解的情況，而且酶解時間縮短，節約提取時間，采用的復合酶用量少，效果好，節約提取成本。
步驟1中處理液由以下成分及重量份組成：優選納米銀7份、優選納米二氧化鈦2份、優選二氧化硅0.7份、優選抗生素0.06份、優選碳酸二甲酯2份和優選氟化氫銨0.4份。可快速有效的清除文蛤肉的雜質和細菌，對文蛤肉無損傷，無毒，減少預處理時間，加快提取效率。
鹽酸溶液添加有優選的氫氧化鈉1重量份、優選的十六烷基三甲基氯化銨0.05重量份、優選的二甲基乙酰胺0.15重量份、乙酰葡糖胺0.01~0.2份（優選0.01份）。快速調節pH值，對文蛤蛋白質無損傷，失活低，保證酶效果優異。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。