專利名稱：五味子多糖提取物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于中藥技術領域，涉及一種植物提取物，具體涉及一種五味子多糖提取物及其制備方法和應用，特別是涉及所述五味子多糖提取物在制備抗變態反應藥物、功能性食品及化妝品中的應用。
背景技術：
變態反應又稱超敏反應，是指機體對某些抗原初次應答后，再次接受相同抗原刺激時，發生的一種以機體生理功能紊亂或組織細胞損傷為主的特異性免疫應答。正常的免疫反應，對異體物質產生排斥，使機體得到保護，而變態反應，則是機體對這類抗原物質的過強反應，它導致組織損傷，產生輕重不等的危害。常見的變態反應疾病主要有變應性鼻炎(常年性變應性鼻炎和季節性變應性鼻 炎)、支氣管哮喘、蕁麻疹、濕疹、過敏性紫癜、藥物過敏、食物過敏、過敏性休克等。近年來，由于人們生活方式的變化，以及生態環境的破壞等，變態反應性疾病的發病率在全球范圍迅速增加，尤其是在發達國家與地區。據世界衛生組織(WHO)估計，全球約有I億5千萬人患有哮喘，其中50%以上的成人及至少80%的兒童，患者均由過敏因素誘發，每年約有18萬人死于哮喘。食物過敏、濕疹和藥物過敏的患病率近年也明顯升高，美國有300萬人對花生和堅果過敏，6歲以下兒童食物過敏的患病率為4%，成人為I % 2%。美國每年因變態反應性疾病要花掉醫療保障體系近180億美元的費用。國內流行病學調查顯示，目前我國變態反應性疾病的發病率也高達37. 3%，其中患過變應性鼻炎的病人已達
最高可達4 %，過敏性皮膚病的發病率在3 %以內。傳統醫學界對變態反應性沒有很好的根治手段，西醫治療的藥物主要有抗組胺藥、激素，還有過敏反應介質阻釋劑等。這些藥物普遍副作用較大，停藥易發，特別對嬰幼兒、兒童、青少年的發育有極大的影響。天然來源的植物藥，特別是中藥，相對化學藥物來說，安全性高，副作用小，往往作用于多個環節，具有顯著的療效，因而越來越受到國內外醫學界的關注。但從單味中藥里分離出來的具有預防和治療變態反應性疾病的成分清楚、含量明確的有效部位，很少見到報導。中藥五味子是木蘭科植物五味子(Schisandra chinensis (Turcz. ) Baill.)的干燥成熟果實，習稱北五味子，是藥食同源的常用滋補性中藥，臨床應用廣泛。五味子酯溶性部位中的聯苯烯類木脂素是目前公認的主要生物活性成分，臨床主要用于治療慢性肝炎。五味子的水溶性部位主要為多糖，研究表明具有多種生理活性。但關于五味子多糖的抗變態反應活性目前還未有公開的文獻或專利報道。

發明內容
為解決上述問題，本發明的目的在于提供一種從藥食同源的單味中藥五味子提取制備的有效部位一具有顯著抗變態反應活性的五味子多糖提取物，使用安全，無副作用之憂。并且本發明還首次闡明所述五味子多糖提取物具有顯著的抗變態反應活性，可用于制備預防和治療變態反應性疾病的藥物，以及功能性食品和化妝品，具有顯著的優越性。本發明的另一目的是提供一種所述五味子多糖提取物的制備方法。本發明的又一目的是提供所述五味子多糖提取物的應用，特別是提供所述五味子多糖提取物在制備抗變態反應藥物、功能性食品及化妝品中的應用。本發明是采用以下技術方案來實現上述目的的。本發明所述的具有顯著抗變態反應活性的五味子多糖提取物，以D-葡萄糖計，多糖含量不低于多糖提取物總重量的45% ;單糖組成主要為D-葡萄糖、D-半乳糖和D-半乳糖醛酸；其中，D-葡萄糖與D-半乳糖的質量比為3 9 I，D-半乳糖醛酸占多糖提取物總重量的5 40%。所述五味子多糖提取物的制備方法，包括以下步驟 (I)取五味子藥材，粉碎成最粗粉或粗粉，加入五味子粉重量6 10倍的65 95% (v/v)乙醇，回流提取I 3次，每次I 3小時，提取結束降至室溫后，過濾；濾液可用于本發明以外的用途；(2)藥渣加入藥材重量6 10倍量的水，回流提取I 3次，每次I 3小時，提取結束降至室溫后，過濾，合并水提取液，減壓濃縮至每ml相當于生藥量O. 3 O. 5g ；(3)上述濃縮液離心，棄去沉淀，溶液進一步減壓濃縮至相對密度I. 12 I. 18/60°C，加95% (v/v)乙醇，用酒精比重計測量，至含醇量為70% 90% (v/v)，靜置，離心或過濾得沉淀，沉淀用2 4倍重量的無水乙醇、丙酮分別洗滌后，得到多糖提取物粗品;(4)多糖提取物粗品經以下兩種方法中的任一種進行凈化A)多糖提取物粗品用蒸餾水充分溶解成I 5wt%的水溶液，用透析膜(截留分子量Da 10000)在純水中透析24 72小時，或者用截留分子量Da 10000的超濾膜進行超濾，去除鹽等小分子，溶液再經后處理得凈化后的五味子多糖提取物。B)多糖提取物粗品用蒸餾水充分溶解成I 5wt%的水溶液，冰浴下每IOOml加入2 8g三氯乙酸，用透析膜(截留分子量Da 10000)在純水中透析24 72小時，或者用截留分子量Da 10000的超濾膜進行超濾，溶液再經后處理得凈化后的五味子多糖提取物。上述兩種凈化方法中所述的后處理，可以采用下面4種方法中的任一種a)將溶液直接冷凍干燥得到五味子多糖提取物；b)將溶液減壓濃縮至比重I. 2 I. 5(60°C )后，真空干燥，得到五味子多糖提取物。c)將溶液減壓濃縮至比重I. I I. 3(60°C )后，噴霧干燥，得到五味子多糖提取物。d)將溶液濃縮至相對于粗品重量的2 4倍后加95% (v/v)乙醇，使醇含量為70% 90% (v/v)，靜置，離心或過濾得到沉淀，將沉淀于30 50°C鼓風干燥得到五味子多糖提取物。其中，本發明制備方法的步驟(I)主要考慮到五味子藥材的綜合用途，本發明的制備方法也可以從第(2)步直接開始，即五味子藥材，粉碎成最粗粉或粗粉后，直接加水回流提取，進行以后的步驟。
本發明以中藥五味子為原料，經粉碎、先醇提去酯溶性成分后再水提(或直接水提)、醇沉，透析或超濾(或脫蛋白后再透析或超濾)，干燥，即制得所述五味子多糖提取物。其中，五味子多糖提取物的含量，是以D-葡萄糖為標準品，按照分光光度法(2010年版中國藥典一部附錄VA)、苯酚-硫酸法測定，證明其多糖含量不低于多糖提取物總重量的45% ；其單糖組成中，D-葡萄糖與D-半乳糖質量比的測定，是采用D-葡萄糖與D-半乳糖的還原氫化乙酰化產物為標準品，照氣相色譜面積歸一化法(2010年版中國藥典一部附錄VI E)測定，證明其峰面積比為3 9 I ;D-半乳糖醛酸含量的測定，是以D-半乳糖醛酸為標準品，采用分光光度法(2010年版中國藥典一部附錄VA)、間羥聯苯法測定，證明D-半乳糖醛酸占多糖提取物總重量的5 40%。經動物試驗(小鼠耳異種被動皮膚過敏試驗、大鼠腹腔肥大細胞脫顆粒試驗，參看實施例10和實施例11，試驗所選的陽性對照藥物為酮替芬，酮替芬是常用的抗變態反應藥物，屬抗組胺藥，也是肥大細胞穩定劑，但有明顯的副作用)驗證，模型結果可靠。試驗結果顯示，本發明的五味子多糖提取物具有顯著的抗變態反應活性，可用于制備預防和治療變態反應疾病的藥物或者功能性食品及化妝品。其可以以原型、水溶液稀釋等形式，通過與載體材料結合制成一定制劑，如片劑、膠囊、滴丸、顆粒劑、口服液、注射劑、混懸劑、乳劑、軟 膏齊 、貼齊 、霜齊 、噴霧齊 、擦劑或洗劑等，供藥品、功能性食品和化妝品市場的消費。可根據各制劑的需要加入適當輔料。


圖I是實施例8的單糖組成標準品的氣相色譜圖。圖中依次是D-鼠李糖(15. lllmin)、L_ 巖藻糖(15. 544min)、D_ 木糖(16. 738min)、D_ 甘露糖(29. 703min)、D_ 葡萄糖(30. 519min)、D-半乳糖(31. 170min)、D-氨基葡萄糖(36. 532min)和D-氨基半乳糖(37. 409min)的乙酰化衍生物。圖2是實施例8的五味子多糖單糖組成的氣相色譜圖。主要的兩個峰是D-葡萄糖(30. 519min)和 D-半乳糖(31. 170min)。
具體實施例方式以下結合具體實施例進一步詳細描述本發明的技術方案。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域的普通技術人員應當理解，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明的技術方案的細節和形式進行修改或等同替換，但這些修改或替換均落入本發明保護范圍內。實施例I五味子多糖提取物的制備取五味子藥材2kg，粉碎成最粗粉，加入五味子粉重量8倍的80 %乙醇，回流提取2次，每次2小時，提取結束降至室溫后，過濾；藥渣加入重量8倍的水，回流提取2次，每次2小時，提取結束降至室溫后，過濾，合并水提取液，減壓濃縮至每ml相當于生藥量O. 4g ;濃縮液離心，溶液進一步減壓濃縮至相對密度I. 15/60°C，加95%乙醇，用酒精比重計測量，至含醇量為80%，靜置，離心得到沉淀，沉淀分別用2倍重量的無水乙醇、丙酮洗滌后，得到多糖提取物粗品176克；多糖提取物粗品用蒸餾水充分溶解成I %的水溶液，用透析膜(截留分子量Da 10000)在純水中透析48小時，去除小分子，冷凍干燥得到五味子多糖提取物126克。然后將該五味子多糖提取物以原型、水溶液稀釋等形式，或通過與載體材料結合，制備成為預防和治療變態反應疾病的藥物或功能性食品，或化妝品。實施例2五味子多糖提取物的制備取五味子藥材2kg，粉碎成粗粉，加入五味子粉重量8倍的80%乙醇，回流提取3次，每次I. 5小時，提取結束降至室溫后，過濾；藥渣加入重量9倍的水，回流提取2次，每次2小時，提取結束降至室溫后，過濾，合并水提取液，減壓濃縮至每ml相當于含生藥O. 4g;濃縮液離心，進一步減壓濃縮至相對密度I. 15/60°C，加95%乙醇，用酒精比重計測量，至含醇量為85%，靜置，離心得到沉淀，沉淀分別用2倍重量的無水乙醇、丙酮洗滌后，得到多糖提取物粗品180克；多糖提取物粗品用蒸餾水充分溶解成I %的水溶液，冰浴下每IOOml加入4g三氯乙酸，用透析膜(截留分子量Da 10000)在純水中透析48小時，將溶液濃縮至相對于粗品重量的4倍后加95%乙醇，使醇含量為80%，靜置，離心或過濾得到沉淀，將沉淀于40°C鼓風干燥，得到五味子多糖提取物106克。然后將該五味子多糖提取物以原型、水溶液稀釋等形式，或通過與載體材料結合，制備成為預防和治療變態反應疾病的藥物或功能性食品，或化妝品。 實施例3五味子多糖提取物的制備取五味子藥材4kg，粉碎成最粗粉，加入五味子粉重量10倍的65%乙醇，回流提取3小時，提取結束降至室溫后，過濾；藥渣加入重量6倍的水，回流提取3次，每次2小時，提取結束降至室溫后，過濾，合并水提取液，減壓濃縮至每ml相當于生藥量O. 4g ;濃縮液離心，溶液進一步減壓濃縮至相對密度I. 16/60°C，加95%乙醇，用酒精比重計測量，至含醇量為75%，靜置，離心得到沉淀，沉淀分別用2倍重量的無水乙醇、丙酮洗滌后，得到多糖提取物粗品448克；多糖提取物粗品用蒸餾水充分溶解成2%的水溶液，以截留分子量Da10000的超濾膜，超濾，再將溶液減壓濃縮至比重I. 30 (60 0C )后，真空干燥，得到五味子多糖提取物301克。然后將該五味子多糖提取物以原型、水溶液稀釋等形式，或通過與載體材料結合，制備成為預防和治療變態反應疾病的藥物或功能性食品，或化妝品。實施例4五味子多糖提取物的制備取五味子藥材5kg，粉碎成粗粉，加入五味子粉重量8倍的95%乙醇，回流提取2次，每次2小時，提取結束降至室溫后，過濾；藥渣加入重量10倍的水，回流提取3小時，提取結束降至室溫后，過濾，將水提取液減壓濃縮至每ml相當于含生藥O. 4g ;濃縮液離心，進一步減壓濃縮至相對密度I. 14/60°C，加95%乙醇，用酒精比重計測量，至含醇量為80%，靜置，離心得到沉淀，沉淀分別用2倍重量的無水乙醇、丙酮洗滌后，得到多糖提取物粗品402克；多糖提取物粗品用蒸餾水充分溶解成2%的水溶液，冰浴下每IOOml加入3. 5g三氯乙酸，用透析膜(截留分子量Da 10000)在純水中透析48小時，將溶液減壓濃縮至比重I. 21(60°C )后，噴霧干燥，得到五味子多糖提取物262克。然后將該五味子多糖提取物以原型、水溶液稀釋等形式，或通過與載體材料結合，制備成為預防和治療變態反應疾病的藥物或功能性食品，或化妝品。實施例5五味子多糖提取物的制備取五味子藥材5kg，粉碎成最粗粉，藥渣加入重量8倍的水，回流提取2次，每次2小時，提取結束降至室溫后，過濾，合并提取液，減壓濃縮至每ml相當于含生藥O. 4g ;濃縮液離心，進一步減壓濃縮至相對密度I. 14/60°C，加95%乙醇，用酒精比重計測量，至含醇量為85%，靜置，離心得到得到多糖提取物粗品464克；多糖提取物粗品用蒸餾水充分溶解成3%的水溶液，冰浴下每IOOml加入4g三氯乙酸，以截留分子量Da 10000的超濾膜，超濾，再將溶液冷凍干燥，得到五味子多糖提取物258克。然后將該五味子多糖提取物以原型、水溶液稀釋等形式，或通過與載體材料結合，制備成為預防和治療變態反應疾病的藥物或功能性食品，或化妝品。實施例6五味子多糖提取物的制備取五味子藥材20kg，粉碎成最粗粉，加入五味子粉重量8倍的80%乙醇，回流提取2次，每次2小時，提取結束后降溫至室溫，過濾；藥渣加入重量8倍的水，回流提取2次，每次2小時，提取結束降至室溫后，過濾，合并水提取液，減壓濃縮至每ml相當于含生藥O. 4g；濃縮液離心，進一步減壓濃縮至相對密度I. 15/60°C，加95%乙醇，用酒精比重計測量，至含醇量為80%，靜置，離心得到沉淀，沉淀分別用2倍重量的無水乙醇、丙酮洗滌后，得到多糖提取物粗品I. 79kg ;多糖提取物粗品用蒸餾水充分溶解成I %的水溶液，以截留分子量Da 10000的超濾膜，超濾，再將溶液濃縮至相對于粗品重量的2. 5倍后加95%乙醇，使醇含量為80%，靜置，離心或過濾得到沉淀，將沉淀于45°C鼓風干燥，得到五味子多糖提取物 I. 27kg。然后將該五味子多糖提取物以原型、水溶液稀釋等形式，或通過與載體材料結合，制備成為預防和治療變態反應疾病的藥物或功能性食品，或化妝品。實施例7五味子多糖提取物含量測定I)試劑與儀器苯酚，濃硫酸，乙醇，分析純；D_葡萄糖，購自中國藥品生物制品檢定所；比色計，UV-2401PC型，日本島灃公司生產。2)對照品溶液的制備精密稱取D-葡萄糖對照品適量，加蒸餾水制成每Iml含40 μ g的溶液。3)供試品溶液的制備精密稱取五味子多糖提取物O. 25g，至250ml量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，精密量取5. Oml置IOml量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。4)標準曲線制備分別吸取對照品溶液O. 4,0. 6,0. 8、I. O、I. 2、I. 4、I. 6、I. 8ml，各以水補至2ml，分別加入6 %苯酚溶液1ml，搖勻，緩慢滴加濃硫酸4ml蓋好塞子，迅速搖勻，室溫放置30分鐘，以蒸餾水作為空白對照，在波長488nm處測定吸光度，繪制標準曲線。5)測定精密吸取供試品溶液1ml，按上述操作，測定吸光度，計算各實施例多糖提取物中多糖的含量。其中，實施例I所制得的五味子多糖提取物中多糖的含量為50. 1%;實施例2所制得的五味子多糖提取物中多糖的含量為68. 1% ;實施例3所制得的五味子多糖提取物中多糖的含量為51. 3% ;實施例4所制得的五味子多糖提取物中多糖的含量為66. 5% ;實施例5所制得的五味子多糖提取物中多糖的含量為67. 0% ;實施例6所制得的五味子多糖提取物中多糖的含量為50.4%。實施例8五味子多糖提取物中多糖的單糖組成實驗
I)儀器和試劑Agilent 6890 氣相色譜儀，HP-5(30mX0. 32mmX0. 5μπι)色譜柱。乙醇、乙腈、氯仿、乙酸酐、無水硫酸鈉、三氯乙酸、三氟乙酸、4-甲基嗎啡啉硼烷均為分析純。2)對照品D-鼠李糖、L-巖藻糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-氨基葡萄糖和D-氨基半乳糖對照品由上海中醫藥大學中藥研究所贈送。3)對照品溶液的制備精密稱定各單糖對照品I. Omg,至IOml圓底燒瓶中，加80mg/ml 4_甲基嗎啡啉硼烷50μ l，3mol/L三氟乙酸200μ 1，搖勻；80°C油浴5分鐘；加入80mg/ml 4-甲基嗎啡 啉硼烷50μ 1，搖勻，120°C油浴I小時，冷卻至室溫，再加入80mg/ml 4-甲基嗎啡啉硼烷100 μ I ;50°C濃縮蒸干，加入2ml乙腈蒸干，重復3次，完全帶除水分；加入乙酸酐100 μ 1，三氟乙酸100 μ I ;50°C水浴10分鐘；加入3ml冰水，搖勻；用氯仿萃取乙酰化產物三次，每次3ml ;合并萃取液，濃縮，無水硫酸鈉干燥，氯仿定容至2ml，作為對照品溶液。4)供試品溶液的制備精密稱定實施例2所制得的五味子多糖提取物l.Omg，至IOml圓底燒瓶中，力口80mg/ml 4-甲基嗎啡啉硼烷50 μ 1，3mol/L三氟乙酸200 μ 1，搖勻;80°C油浴5分鐘;加入80mg/ml 4-甲基嗎啡啉硼烷50 μ 1，搖勻，120°C油浴I小時，冷卻至室溫，再加入80mg/ml4-甲基嗎啡啉硼烷100 μ I ;50°C濃縮蒸干，加入2ml乙腈蒸干，重復3次，完全帶除水分；加入乙酸酐100 μ I,三氟乙酸100 μ I ;50°C水浴10分鐘；加入3ml冰水,搖勻；用氯仿萃取乙酰化產物三次，每次3ml ;合并萃取液，濃縮，無水硫酸鈉干燥，氯仿定容至2ml，作為供試品溶液。5)氣相色譜條件采用HP-5(30mX0. 32mmX0. 5ym)色譜柱，進樣器溫度280°C，檢測器(FID)溫度310°C。采用程序升溫130°C恒溫5min, 2°C /min升溫至180°C ,恒溫5min, 10°C /min升溫至310°C。載氣為高純氮，流速l.Oml/min，進樣量Ι.Ομ 1，分流比30 I。6)測定采用氣相色譜法分別測定各對照品與供樣試品溶液，通過保留時間的比較可知，五味子多糖提取物中多糖的單糖組成(除糖醛酸外)主要為D-葡萄糖和D-半乳糖，通過面積歸一化法可知，D-葡萄糖與D-半乳糖的峰面積比例為5. 67 1，見圖I和圖2(注糖醛酸類，用此方法測不出，需另測)。采用同樣方法測定其他實施例五味子多糖提取物中多糖的單糖組成，測得D-葡萄糖與D-半乳糖的峰面積比例在3 9 I間。實施例9五味子多糖提取物中D-半乳糖醛酸含量測定I)試劑與儀器間羥苯酚，氫氧化鈉，四硼酸鈉，濃硫酸，分析純；D_半乳糖醛酸，購自中國藥品生物制品檢定所；比色計，UV-2401PC型，日本島灃公司生產。2)對照品溶液的制備精密稱取D-半乳糖醛酸對照品適量，加蒸餾水制成每Iml含60 μ g溶液。
3)供試品溶液的制備精密稱定五味子多糖提取物O. 25g，至250ml量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，精密量取5. Oml置IOml量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。4)標準曲線制備分別吸取對照品溶液O. 00、0. 05、0. 10,0. 15,0. 20,0. 25ml于具塞試管中，各以水補至O. 25ml。在冰浴中預冷后加入O. 0125mol/L四硼酸鈉濃硫酸試液I. 5ml,振搖混合，在沸騰水浴中加入5分鐘。以冰浴冷卻至室溫后，以微量加液器加入O. 15%間羥聯苯試液(O. 5%氫氧化鈉配制)25 μ L。搖勻后，在520nm處測定光吸收，以“O. 00”管作空白對照，繪制標準曲線。5)測定法精密吸取供試品溶液1ml，按上述操作，測定吸光度。實施例2所制得五味子多糖 提取物中D-半乳糖醛酸占多糖提取物總重量的21. 41%。采用同樣方法測定其他實施例五味子多糖提取物中多糖的D-半乳糖醛酸的含量，測得五味子多糖提取物中D-半乳糖醛酸占多糖提取物總重量的5 40%。實施例10小鼠耳異種被動皮膚過敏試驗I)實驗原理將致敏大鼠的血清(內含豐富IgE抗體)皮內注射于正常小鼠的耳廓，使之被動致敏。當抗原攻擊時，耳廓局部血管通透性增加，注入伊文思藍，可滲入耳廓中，按滲入伊文思藍量的多少，反映皮膚過敏程度。2)實驗動物Balb/C小鼠，18 22g，40只，雌雄各半。Wistar大鼠，90 IOOg, 8只，雌雄各半。飼養條件室溫20°C 23°C，相對濕度45% 65%，14h光照/IOh黑暗循環(光照時間6:30 20:30)，自由給水給食，購買后在SPF級動物房飼養2日后開始實驗。3)大鼠抗血清的制備對大鼠每足跖注射卵白蛋白O. 1ml，同時腹腔注射氫氧化鋁凝膠O. 4ml，隔天致敏一次，共三次，于末次致敏14天后采血，收集血清，于-20°C保存備用。4)小鼠被動過敏試驗Balb/C小鼠隨機分為5組，每組8只，分別為空白組、模型組、陽性對照組(酮替芬)、樣品A組和樣品B組。空白組注射生理鹽水七天。模型組注射生理鹽水七天，于第五天兩只耳廓各注射大鼠抗血清20μ 1，后續同樣品組。陽性對照組于抗原攻擊前半小時注射酮替芬(5mg/kg)，其余同模型組。樣品A組(實施例I所制得的五味子多糖提取物，用蒸餾水溶解，灌胃給藥，劑量150mg/kg，每日I次，每次O. 2ml)、樣品B組(實施例2所制得的五味子多糖提取物，用蒸餾水溶解，灌胃給藥，劑量150mg/kg，每日I次，每次O. 2ml)給藥7天，于第五天時，小鼠兩只耳廓各注射大鼠抗血清20 μ I，48小時后進行抗原攻擊，尾靜脈注射O. 5%伊文斯藍溶液(含卵白蛋白O. 25mg)0. 25ml，30min后將小鼠脫臼處死，剪下耳廓，兩只耳廓置于試管內，加入lmol/L氫氧化鉀溶液O. 75ml，37°C過夜消化，次日加入3.5mL，0.6mol/L磷酸溶液和丙酮混合液(按5 13比例混合)，經渦旋器震搖提取，再離心(2500rpm，15min)，上清液以640nm測定光密度，結果見表I。
5)實驗結果與模型對照組相比，樣品A組、樣品B組對小鼠耳異種皮膚過敏反應都有顯著的抑制作用，表明本發明的五味子多糖提取物有顯著的抗變態反應活性。表I小鼠被動皮膚過敏試驗結果
_組別劑量(g/kg)耳提液光密度平均值抑制率(％)
空白組__等體積生理鹽水 O. 03853±0. 0154___
模型組一等體積生理鹽水 0.2226 ±0.0234# _ -一
陽性對照藥 5mg/kgO. 1106±0. 0353λλ60.84"
樣品 A 組150mg/kgO. 1221±0· 0325λλ54.58"
樣品 B 組150mg/kg0· 1639±0· 0339λλ31.89**ρ < O. Olvs 正常組；Δ Δρ < O. Olvs 模型組實施例11大鼠主動腹腔肥大細胞脫顆粒試驗I)實驗材料SD大鼠30只，雄性，體重200克左右。氫氧化鋁凝膠(sigma)、中性紅(國藥集團化學試劑有限公司，批號F20100521)、卵白蛋白(sigma)、肝素鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號:F20091029)、D-Hanks液(吉諾生物科技有限公司)、酮替芬(中國藥品生物制品檢定所，100230-200602)。2)空白血清及藥物血清的制備雄性SD大鼠，隨機分為4組，即空白血清組、樣品A藥物血清組(樣品A為實施例I所制得的五味子多糖提取物，用蒸餾水溶解，灌胃給藥，150mg/kg)、樣品B藥物血清組(樣品B為實施例2所制得的五味子多糖提取物，用蒸餾水溶解，灌胃給藥，150mg/kg)、陽性藥血清組，每組3只。樣品A和B藥物血清組每次灌胃給藥3ml，一天2次，共三天，然后禁食12h，第四天早上劑量加倍；空白血清組灌服等量生理鹽水。第四天給完藥Ih后腹主動脈取血，陽性藥血清組在采血前I小時，腹腔注射酮替芬O. 2ml (5mg/kg)。采血后，收集血清于_20°C保存,使用前過濾。3)大鼠主動腹腔肥大細胞脫顆粒試驗SD大鼠，分為正常對照組和致敏組，正常對照組3只，致敏組15只。致敏組又分為5組，每組3只，即模型組、空白血清組、陽性藥組、樣品A組、樣品B組。致敏組每足跖注射含有卵白蛋白(OVA)的氫氧化鋁凝膠O. Iml (每ml凝膠中含有Img 0VA)，隔天致敏一次，共3次，正常對照組注射等量生理鹽水，14天后，頸動脈放血處死，在腹部注入IOml的D-Hanks液(含肝素O. 005%),按摩腹部2min，打開腹腔抽取液體，放入試管中，冰浴，離心1500r/min,5min,棄去上清液,加入約2ml的D-Hanks液,混勻待用。各組分別吸取O. 5ml混勻的肥大細胞懸液，正常組加入Iml的D-Hanks液，模型組加入O. 75ml的D-Hanks液，其余各組加入相對應的含藥血清O. 75ml，搖勻放置5min，除正常組外,每組均加入O. 25ml的80 μ g/ml的卵白蛋白溶液(用生理鹽水溶解),使得每個樣本總體積均為I. 5ml，37°C水浴5min，吸去上清液，吸取底部混勻的肥大細胞懸液，滴加I 2滴于中性紅染色的載玻片上，加蓋玻片，于37°C溫箱中孵育3min，高倍鏡下觀察肥大細胞脫顆粒的情況，每個樣本做復片，每張片子查看60個細胞，正常肥大細胞為圓形，邊緣光滑，細胞內有均勻分布的石榴紅色顆粒，而脫顆粒的細胞顆粒脫失，邊緣變形，沒有完整的細胞結構。實驗結果見表2。
4)實驗結果與模型對照組相比，樣品A和樣品B都能顯著抑制大鼠主動腹腔肥大細胞脫顆粒，說明五味子多糖提取物有顯著的抗變態反應活性。表2大鼠主動腹腔肥大細胞脫顆粒試驗結果
權利要求
1.一種五味子多糖提取物，其特征在于，以D-葡萄糖計，多糖含量不低于多糖提取物總重量的45%。
2.根據權利要求I所述的五味子多糖提取物，其特征在于，所述多糖的單糖組成主要有D-葡萄糖、D-半乳糖和D-半乳糖醛酸，其中，D-葡萄糖與D-半乳糖的質量比為3 9 1，D-半乳糖醛酸占多糖提取物總重量的5 40%。
3.權利要求I或2所述的五味子多糖提取物的制備方法，包括以下步驟 (1)取五味子藥材，粉碎成最粗粉或粗粉，加入五味子粉重量6 10倍的65 95%(v/v)乙醇，回流提取I 3次，每次I 3小時，提取結束降至室溫后，過濾，濾液回收另用； (2)藥渣加入藥材重量6 10倍量的水，回流提取I 3次，每次I 3小時，提取結束降至室溫后，過濾，合并水提取液，減壓濃縮至每ml相當于生藥量O. 3 O. 5g ; (3)上述濃縮液離心，棄去沉淀，溶液進一步減壓濃縮至相對密度I.12 I. 18/60°C,加95% (v/v)乙醇,用酒精比重計測量,至含醇量為70% 90% (v/v),靜置,離心或過濾得沉淀，沉淀用2 4倍重量的無水乙醇、丙酮分別洗滌后，得多糖提取物粗品。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述多糖提取物粗品采用以下方法凈化多糖提取物粗品用蒸餾水充分溶解成I 5wt%的水溶液，用透析膜在純水中透析24 72小時，或者用超濾的方法，去除小分子，溶液再經后處理，即得到凈化后的五味子多糖提取物。
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述多糖提取物粗品采用以下方法凈化多糖提取物粗品用蒸餾水充分溶解成I 5wt%的水溶液，冰浴下每IOOml加入2 Sg三氯乙酸，用透析膜在純水中透析24 72小時，溶液再經后處理，即得到凈化后五味子多糖提取物。
6.根據權利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，所述透析膜或者超濾用的超濾膜的截留分子量Da為10000。
7.根據權利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，所述的后處理采用以下任一種方式 a、將溶液直接冷凍干燥得到五味子多糖提取物； b、將溶液減壓濃縮至比重I.2 I. 5/60°C后，真空干燥，得到五味子多糖提取物； C、將溶液減壓濃縮至比重I. I I. 3/60°C后，噴霧干燥，得到五味子多糖提取物； d、將溶液濃縮至相對于粗品重量的2 4倍后加95% (v/v)乙醇，使醇含量為70% 90% (v/v)，靜置，離心或過濾得到沉淀，將沉淀于30 50°C鼓風干燥得到五味子多糖提取物。
8.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述方法可從第(2)步直接開始，即五味子藥材，粉碎成最粗粉或粗粉后，直接加水回流提取，進行以后的步驟。
9.權利要求I或2所述的五味子多糖提取物在制備抗變態反應藥物、功能性食品及化妝品中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述的五味子多糖提取物以原型或水溶液稀釋形式，通過與載體材料結合制成片劑、膠囊、滴丸、顆粒劑、口服液、注射劑、混懸劑、乳劑、軟膏劑、貼劑、霜劑、噴霧劑、擦劑或洗劑。
全文摘要
本發明公開了一種五味子多糖提取物及其制備方法和應用。以D-葡萄糖計，多糖含量不低于多糖提取物總重量的45％，單糖組成主要為D-葡萄糖、D-半乳糖和D-半乳糖醛酸，其中D-葡萄糖與D-半乳糖的質量比為3～9∶1，D-半乳糖醛酸占多糖提取物總重量的5～40％。通過小鼠耳異種被動皮膚過敏試驗、大鼠腹腔肥大細胞脫顆粒實驗證明，本發明的五味子多糖提取物具有顯著的抗變態反應活性，可用于制備抗變態反應藥物、功能性食品及化妝品。
文檔編號A61Q19/00GK102805762SQ201110147158
公開日2012年12月5日 申請日期2011年6月2日 優先權日2011年6月2日
發明者曾佳烽, 劉淼, 潘俊芳, 朱勤, 李寶瑩, 陳慶花 申請人:上海華拓醫藥科技發展股份有限公司