專利名稱：一種降解除草劑氰氟草酯的細菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于環境污染生物修復領域，涉及一種降解除草劑氰氟草酯的細菌及其應用。
背景技術：
氰氟草酯(cyhalofop-butyl)是一種芳氧苯氧羧酸酯類除草劑，由美國陶氏公司(Dow Elanw Co. Ltd) 1987年首先開發,化學名稱為(R) _2_[4 (4-氰基-2-氟苯氧基)苯氧基]-丙酸丁酯，分子式為C2tlH2tlFNCV氰氟草酯在極低劑量即對雜草呈很高活性和選擇性，尤其對稗草、千金子、看麥娘、小康草等有卓越的效果，具有較好的發展前景，在我國的應用日益廣泛。但是，隨著該類除草劑的長期大量使用，其在環境中的遷移、轉化和分解等環境行為正受到日益關注。 氰氟草酯在我國得到廣泛應用的同時，其在土壤和水體中的殘留導致的環境污染問題也日趨嚴重，有以下幾方面的危害(I)氰氟草酯隨生產廢水、農業灌溉水和雨水縱向和橫向擴散，造成地表水和地下水污染；(2)氰氟草酯及其芳烴代謝產物對哺乳動物和人體健康具有較大的危害；(3) 土壤中氰氟草酯殘留對下茬作物產生藥害，使下茬作物死亡或減產，導致農業生產損失；(4)氰氟草酯對一些水生生物毒性較高，水體中的氰氟草酯殘留會導致土壤和水體生物多樣性降低，危及水生生物安全。微生物降解修復技術是近幾十年才興起的一種新型的環境污染修復技術。該技術和物理化學方法相比，具有很多無可比擬的優點，如處理效果好，適合有毒有害有機污染物大面積面源污染的降解修復，修復費用較低(僅為傳統化學、物理修復經費的10%左右)，不產生二次污染等。在國內外，生物修復技術已經廣泛應用于石油、化工和農藥殘留有機污染的清除。但到目前為止還未見氰氟草酯殘留污染生物修復技術專利的研究和應用報道。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一株降解除草劑氰氟草酯的細菌。本發明的另一目的是提供含有該細菌的菌劑。本發明的又一目的是提供該細菌的應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現一種降解除草劑氰氟草酯的細菌Aquamicrobium lusatiense JW_1,保藏于中國典型培養物保藏中心，菌種保藏號為=CCTCC NO M 2012297，保藏日期為2012年7月20日。該菌的主要生物學特性為G_，菌體為短桿狀，大小為O. 5-1. 0X1. 0-1. 5 μ m ;菌落表面光滑，有光澤，邊緣整齊，隆起，呈淡黃色。氧化酶、接觸酶、硝酸鹽還原、檸檬酸利用反應為陽性；甲基紅試驗、脂酶反應、V. P.反應、M. R反應、吲哚反應為陰性；不能水解淀粉。一種含有所述的菌種保藏號為CCTCC NO M 2012297的降解除草劑氰氟草酯的細菌JW-I的降解菌劑。該菌劑可通過試管斜面種一搖瓶種一種子罐一生產罐一產品(包裝劑型為液體菌劑或固體吸附菌劑)的生產工藝制備得到。所述的菌種保藏號為CCTCC NO M 2012297的降解除草劑氰氟草酯的細菌JW-I在降解水體和/或土壤中的除草劑氰氟草酯殘留的應用。所述的含有菌種保藏號為CCTCC NO M 2012297的降解除草劑氰氟草酯的細菌JW-I的菌劑在降解水體和/或土壤中的除草劑氰氟草酯殘留的應用。
有益效果本發明提供了一株降解除草劑氰氟草酯的細菌JW-I (CCTCC NO M 2012297)，由該細菌制備的菌劑對氰氟草酯降解效率高達到95%以上，降解速度快，消除農產品中除草劑氰氟草酯殘留，可用于降解土壤和水體中除草劑氰氟草酯殘留，解決除草劑氰氟草酯對對土壤水體環境的危害問題。


圖I菌株JW-I在含氰氟草酯的LB平板上形態。圖2菌株JW-I的透射電鏡照片。圖3菌株JW-I以氰氟草酯為唯一碳源生長及對氰氟草酯的降解情況菌種保藏信息細菌JW-1,分類命名為Aquamicrobium lusatiense JW-1,保藏于中國典型培養物保藏中心，地址為中國，武漢，武漢大學，菌種保藏號為=CCTCC NO M 2012297,保藏日期為2012年7月20日。
具體實施例方式實施例I菌種分離純化和鑒定取3g生產氰氟草酯的農藥廠生化污泥于IOOmL含50mg/L氰氟草酯基礎鹽培養基中，震蕩搖勻，30°C、180rpm搖床培養，每隔7d以5%接種量轉接至新的含氰氟草酯的基礎鹽培養基中，按同樣的培養富集方式轉接5代，氰氟草酯的濃度每次轉接提高10mg/L，逐漸提高到100mg/L。富集培養液經紫外檢測有降解效果后，對富集液進行稀釋，并分別在含100mg/L的氰氟草酯基礎鹽固體培養基平板上接入0. IOmL稀釋富集液涂布，30°C烘箱培養.待平板上出現菌落后，挑取有透明圈的菌落劃線3次進行純化，純化后取單菌于LB培養基中擴大培養，轉接至含氰氟草酯100mg/L的基礎鹽液體中，30°C、180rpm搖床培養，驗證純菌的降解效果。經過富集分離純化，從生產氰氟草酯的農藥廠生化污泥中分離獲得I株氰氟草酯降解菌，命名為JW-I，該菌能在含氰氟草酯100mg/L的基礎鹽液體培養基中降解氰氟草酯，降解率約為99. 5%。同時，菌株JW-I可在含氰氟草酯的LB平板上因將水溶性低的氰氟草酯降解為水溶性高的降解產物而形成透明圈(圖I)。以菌株JW-I的基因組DNA為模板，用細菌16S rRNA通用引物(27f和1452r)進行PCR擴增，得到長度約為1400bp的16S rRNA基因序列。在RDP數據庫(https://rdp.cme. msu. edu/)中進行 Blast,結果表明菌株 JW-I 與 Aquamicrobium lusatiense 屬菌株的同源性最近，同源性大于99%。菌株JW-I在LB固體培養基上生長Id后，菌落表面光滑，有光澤，邊緣整齊，隆起，呈淡黃色，經過負染，在透射電子顯微鏡下該菌呈桿狀，單極生鞭毛，無莢膜，不形成芽孢(圖2)。G_，菌體為短桿狀，大小為O. 5-1. OX I. 0-1. 5 μ m。氧化酶、接觸酶、硝酸鹽還原、檸檬酸利用反應為陽性；甲基紅試驗、脂酶反應、V. P.反應、M. R反應、吲哚反應為陰性；不能水解淀粉、尿素和TW80。菌株JW-I的形態和生理生化特征和Bergey’ smanual of systematic bacteriology 上對 Aquamicrobium lusatiense 的描述是一致的。結合形態、生理生化特征和16S rRNA同源性分析,將菌株JW-I鑒定為Aquamicrobiumlusatiense。本實施例中所涉及的培養基配方如下LB培養基蛋白胨10.0g/L，酵母膏5.0g/L，NaCl 10. Og/L，去離子水加至lOOOmL。固體LB培養基加入I. 5%的瓊脂粉。基礎鹽培養基(MM)=NH4NO3 I. Og/L, K2HPO4 I. 5g/L, KH2PO4 O. 5g/L, NaCl O. 5g/L,MgSO4O. 2g/L，去離子水加至 lOOOmL，pH=7. 0。
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固體基礎鹽培養基加入I. 5%的瓊脂粉。富集選擇培養基在IOOmL基礎培養基中加入一定量的氰氟草酯原藥作為唯一碳源進行選擇培養。富集基質采用江蘇揚州某生產氰氟草酯的農藥廠生化污泥。氰氟草酯原藥購自江蘇揚州某農藥廠(純度為99%)，按所需濃度添加到培養基中。甲醇(色譜純)購自西格瑪奧德里奇公司。其它化學試劑為分析純，購自上海化學試劑有限公司。實施例2氰氟草酯降解菌劑的制備I.將菌株JW-I (CCTCC NO M 2012297)試管種接種于肉湯蛋白胨培養基搖瓶中，200rpm振蕩培養至對數期；2.將上述培養好的菌種按種子罐培養基的10%接種量(v/v)接入500升種子罐，種子罐裝液量為400升，培養至對數生長期，種子罐所用的培養基配方(質量百分比)葡萄糖 I. 0%, NH4NO3 0. 8%, K2HPO4 0. 3%, MgSO4 0. 05%, FeSO4 0. 01%, NaCl 0. 5%, CaCO3 0. 3%, W-母膏 0. 5%, pH 值 7. 2-7. 5 ；3.將種子液按生產罐培養基的10wt%接種量接入5噸的生產罐培養，裝液量為4噸，生產罐所用培養基與種子罐培養基相同；在種子罐和生產罐的培養過程中無菌空氣的通氣比為I :0. 5，攪拌速度為180-240轉/分，培養溫度為30°C，整個工藝流程培養時間為36小時。發酵結束后菌體數量達到10億個/ml以上，發酵完成后培養液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑，或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。實施例3氰氟草酯降解菌劑對氰氟草酯殘留的降解效果在基礎鹽培養基中加入終濃度為100mg/L的氰氟草酯，1%的接種量接入實施例2制備的菌株JW-I (CCTCC NO M 2012297)菌液，設接種滅活的菌株JW-1 (CCTCC NO M2012297)為對照。每隔Id定時取樣檢測菌株的生長情況和氰氟草酯的降解情況，結果見圖
3。菌株JW-I (CCTCC NO M 2012297)在5d內對氰氟草酯的降解率達到99. 2%。同時，在氰氟草酯的降解過程中，培養液的菌體量也隨著氰氟草酯的降解而增加，5d內菌株量從接種時 I. 5X IO6Cfumr1 增加到約 I. IXlO7Cfu mL_1 ;表明菌株 Jff-I (CCTCC NO M 2012297)在基本完全降解氰氟草酯的同時，能夠利用氰氟草酯作為碳源生長。實施例4菌株JW-I對土壤中氰氟草酯殘留的降解效果
Jff-I (CCTCC NO M 2012297)對土壤中除草劑氰氟草酯殘留降解效果測定在IOOOg 土壤中加入氰氟草酯，使土壤中含藥濃度為10mg/kg，加入實施例2制備的JW-I菌液，混勻，置于30°C培養箱中黑暗條件下恒溫培養，定時取樣測定氰氟草酯在土壤中的殘留量，同時設置不接菌的對照。結果見表1，表I中數據表明在不接菌的對照土壤中，氰氟草酯殘留濃度在第一天下降了 21. 2%，可能是由于土壤吸附的原因，而非氰氟草酯被降解，在此后的十多天里下降十分緩慢。而接種了降解菌JW-I (CCTCC NO M 2012297)的土壤，氰氟草酯殘留濃度在第一天下降了 25. 1%，在此后的幾天下降非常迅速，到第15天氰氟草酯殘留濃度降解率達到95. 6%。表I菌株JW-I (CCTCC NO M 2012297)在土壤中對氰氟草酯殘留解效果
權利要求
1.一種降解除草劑氰氟草酯的細菌Aquamicrobium lusatiense JW_1,保藏于中國典型培養物保藏中心，菌種保藏號為=CCTCC NO M 2012297，保藏日期為2012年7月20日。
2.一種含有權利要求I所述的降解除草劑氰氟草酯的細菌JW-I的降解菌劑。
3.權利要求I所述的降解除草劑氰氟草酯的細菌JW-I在降解水體和/或土壤中的除草劑氰氟草酯殘留的應用。
4.權利要求2所述的含有降解除草劑氰氟草酯的細菌JW-I的菌劑在降解水體和/或土壤中的除草劑氰氟草酯殘留的應用。
全文摘要
本發明屬于環境污染生物修復領域，公開了一種降解除草劑氰氟草酯的細菌及其應用。一種降解除草劑氰氟草酯的細菌Aquamicrobium lusatiense JW-1，保藏于中國典型培養物保藏中心，菌種保藏號為CCTCC NOM2012297，保藏日期為2012年7月20日。由該細菌制備的菌劑對氰氟草酯降解效率高達到95％以上，降解速度快，消除農產品中除草劑氰氟草酯殘留，可用于降解土壤和水體中除草劑氰氟草酯殘留，解決除草劑氰氟草酯對對土壤水體環境的危害問題。
文檔編號A62D101/04GK102827799SQ20121034276
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月14日 優先權日2012年9月14日
發明者顧立鋒, 顧子衡, 蔣子才 申請人:江蘇碧諾環保科技有限公司