專利名稱：一種二甲四氯除草劑降解菌se08及其篩選方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于環境污染生物修復領域，具體是一種二甲四氯除草劑降解菌SE08及其篩選方法和應用。
背景技術：
中國從1956年開始在稻田和煙田大規模使用苯氧羧酸類除草劑，其中二甲四氯除草劑因除草效果顯著、價格低廉而被廣泛應用。二甲四氯除草劑是激素型內吸傳導選擇性苯氧羧酸類除草劑，易被植物的根和葉部吸收，對植物有強烈的生理活性，低濃度時促進生長，高濃度時抑制生長。但是二甲四氯容易進入水生系統，對水生生物的毒性不容忽視。二甲四氯在土壤表面容易轉移且存在污染地下水的可能性；另一方面，自20世紀70年代初以來，隨著除草劑的廣泛使用，雜草對除草劑產生的耐藥性、抗藥性問題凸顯，自然界中也已產生越來越多不同類型的抗除草劑的物種，因此，消除環境中除草劑的殘留危害具有重要意義。近年來，隨著人們對生物修復技術研究的深入，利用微生物來降解環境中殘留的除草劑已成為當今的熱點。國內外學者在除草劑的微生物降解方面做了大量研究，但有關二甲四氯微生物降解的報道甚少。

發明內容
本發明所要 解決的一個技術問題是針對現有技術的不足而提供一種二甲四氯除草劑降解菌SE08，利用了該菌株降解環境中殘留的除草劑，適用于降解土壤或水中的二甲四氯殘留，本發明要解決的第二個技術問題是提供上述二甲四氯除草劑降解菌SE08的篩選方法。本發明要解決的第三個技術問題是提供上述二甲四氯除草劑降解菌SE08的應用。本發明的一個技術方案是:一種二甲四氯除草劑降解菌SE08，該降解菌為腸桿菌(Enterobacter sp.)，保藏編號為CGMCC N0.7016，保藏日期:2012.12.18，保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心。進一步地，上述二甲四氯除草劑降解菌SE08菌株的形態鑒定:該菌株為革蘭氏陰性好氧菌，無芽孢無莢膜；在NA固體培養基上37°C培養24h，菌落的形狀為橢圓，邊緣整齊，表面光滑凸起，菌落為奶白色，不透明，體細胞呈短桿狀，長2.(Γ2.5 μ m，寬0.6^0.8 μ m ;該菌株16S rRNA序列全長1076bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1。進一步地,NA固體培養基配方如下:牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,氯化鈉5.0g,蒸懼水 1L,瓊脂 20.0g，調節 ρΗ7.0-7.4，121°C 滅菌 30min。本發明的第二個技術方案是提供上述二甲四氯除草劑降解菌SE08的篩選方法，具體包括以下步驟:(I)取污染土樣10.0g于三角瓶中，加入IOOmL含50mg/L 二甲四氯的無機鹽培養液，25 37°C下，15(T220rpm振蕩培養5天；(2)取出IOmL振蕩液加入到90mL含125mg/L 二甲四氯的無機鹽培養液，在25^37°C, 150^220rpm繼續振蕩培養5天，依次類推，提高二甲四氯濃度分別為250、500、750、1000mg/L，每隔5天，取出IOmL培養液加入到90mL含梯度升高濃度的二甲四氯無機鹽培養液中，25 37°C下，15(T220rpm繼續振蕩培養5天；(3)取1000mg/L 二甲四氯無機鹽培養液中的培養物，加入到含有濃度為20g/L瓊脂的無機鹽培養基中進行稀釋涂布，30°C下培養5天； (4)挑取單菌落，然后在含250mg/L 二甲四氯和20g/L瓊脂的無機鹽培養基上采用平板劃線法進行分離純化，獲得純化的以二甲四氯為唯一碳源和能量生長的菌株。作為優選，所述無機鹽培養液的配方如下=KH2PO40.5g，K2HPO40.5g，MgSO4.7Η200.2g，CaCl20.lg, NaCl0.2g 和 1.0mL 微量元素溶液，蒸餾水 IOOOmL,調節 pH 為7.0,121°C滅菌 30min。進一步地，所述的微量元素溶液配方為:ZnCl270mg，MnCl2.4H20100mg，HSb0360mg，CoCl2.6H20200mg, NiCl2.H2040mg, Na2MoO4.2H2035mg, CuCl2.H2020mg, CuSO4.5H2030mg,37%的濃鹽酸0.9mL,蒸餾水1000mL。本發明的第三個技術方案是提供上述二甲四氯除草劑降解菌SE08在降解土壤或水中的二甲四氯的應用。本發明采用上述技術方案，具有以下優點:從湖南省郴州市煙區二甲四氯重污染土壤中經過初篩，然后再復篩及分離純化得到的二甲四氯除草劑降解菌SE08，該降解菌可以有效地降解環境中的二甲四氯殘留，適用于二甲四氯污染的土壤和水中的生物修復。


`圖1為本發明的二甲四氯除草劑降解菌SE08的掃描電子顯微鏡圖；圖2為本發明的二甲四氯除草劑降解菌SE08的系統發育樹；圖3為本發明的二甲四氯除草劑降解菌SE08的基因全序列；圖4為本發明的二甲四氯除草劑降解菌SE08生長曲線和二甲四氯降解動力學圖；圖5為本發明的二甲四氯除草劑降解菌SE08在不同初始二甲四氯濃度影響下的生長及二甲四氯降解圖；圖6為本發明的二甲四氯除草劑降解菌SE08在不同pH影響下的生長及二甲四氯降解圖；圖7為本發明的二甲四氯除草劑降解菌SE08在不同溫度影響下的生長及二甲四氯降解圖；圖8為本發明的二甲四氯除草劑降解菌SE08在不同第二碳源葡萄糖添加量影響下的生長及二甲四氯降解圖；圖9為本發明的二甲四氯除草劑降解菌SE08在不同氮源添加量和5mg/L葡萄糖共培養條件下的生長及二甲四氯降解圖。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，但本發明不限于此。實施例1二甲四氯除草劑降解菌SE08的分離、純化和鑒定
1、二甲四氯除草劑降解菌SE08的分離純化取污染土樣10.0g于三角瓶中，加入IOOmL含50mg/L 二甲四氯的無機鹽培養液，在30°C，200rpm振蕩培養5天；取出IOmL振蕩液加入到90mL含125mg/L二甲四氯的無機鹽培養液，在30°C，200rpm繼續振蕩培養5天，依次類推，提高二甲四氯濃度分別為250、500、750、1000mg/L，每隔5天，取出IOmL培養液加入到90mL含梯度升高濃度的二甲四氯無機鹽培養液中，在30°C，200rpm繼續振蕩培養5天；取1000mg/L 二甲四氯無機鹽培養液中的培養物在加入瓊脂(20g/L)的無機鹽培養基中進行稀釋涂布，在30°C培養5天；挑取單菌落，然后在含250mg/L 二甲四氯和瓊脂(20gL)的無機鹽培養基上采用平板劃線法進行分離純化，獲得純化的以二甲四氯為唯一碳源和能量生長的菌株。將該菌株接入斜面培養，4°C斜面保存備用。2、二甲四氯除草劑降解菌SE08的形態結構觀察及生理生化實驗(I)形態鑒定該菌株為革蘭氏陰性好氧菌，無芽孢無莢膜；在含NA固體培養基上37°C培養24h，其形態電鏡掃描如圖1所示，菌落的形狀為橢圓，邊緣整齊，表面光滑凸起，菌落為奶白色，不透明，體細胞呈短桿狀，長2.0 2.5 μ m，寬0.6 0.8 μ m。(2)生理生化鑒定依據《伯杰氏細菌學鑒定手冊》對二甲四氯降解菌SE08進行常規生理生化鑒定，鑒定結果為:該降解菌SE08能以二甲四氯為唯一碳源和能量生長，二甲四氯降解菌SE08接觸酶試驗為陽性，過氧化氫酶陰性，產吲哚試驗陰性，甲基紅試驗反應陰性，檸檬酸利用試驗為陰性，V-P試驗為陽性，淀粉水解試驗陰性，明膠液化試驗為陽性，鳥氨酸脫羧酶為陽性，賴氨酸脫羧為陰性。(3) 二甲四氯降解 菌SE08的16S rRNA的PCR擴增和序列測定用試劑盒提取純化后菌株的總RNA，采用細菌16S rRNA的通用引物進行16S rRNA的PCR擴增。測序及與GeneBank已知序列中進行同源性比較，其系統進化樹見圖2，基因全序列見圖3。結果表明:該菌株16S rRNA序列全長1076bp，其核苷酸序列如SEQ IDN0.1 ;該菌株與Enterobactersp.菌株的相似性為99%，GeneBank登錄號為N0.HM461219.1，結合其形態學，生理生化特征和16S rRNA比對結果,可以判定該菌株為腸桿菌屬(Enterobactersp.)。實施例2降解菌生長和降解特性試驗采用高效液相色譜(HPLC)分析測定無機鹽培養液中二甲四氯的殘留量，菌體生長量通過測定樣品的OD6citol來確定。(I) 二甲四氯降解動力學和菌株SE08生長曲線:將3mL菌懸液(OD6tltlnm 0.3)加入到IOOmL含500mg/L 二甲四氯的無機鹽培養液中，pH6.0，30°C條件下培養72h，結果見圖4，培養36h，OD6tltlnm達最大為0.64，后期由于二甲四氯降解無法提供足夠碳源和能量導致菌體死亡，OD6tltol有所下降，72h的OD6tltlnmS 0.64。隨著菌體數量的增加，二甲四氯降解率逐漸增大，但培養60h后降解率變化不大但有略微增長，培養72h降解率達最大為68.5%,由此選擇最佳培養時間為72h。
(2)不同初始二甲四氯濃度影響下的降解菌SE08生長及二甲四氯降解情況:將3mL 菌懸液(OD6tltlnm 0.3)加入到 IOOmL 含 125,250,500,750,1000,2000 和 3000mg/L 二甲四氯的無機鹽培養液中，pH6.0，30°C條件下培養72h，結果見圖5，在125、250、500mg/L二甲四氯的無機鹽培養液中，菌體生長量和二甲四氯降解率隨初始濃度的增加而增大，在500mg/L均達最大值，OD600nm和降解率分別為0.64和68.5%。當二甲四氯濃度大于750mg/L，降解率和菌體生長受到明顯抑制，在3000mg/L時菌體基本不生長，二甲四氯降解率為0，但在2000mg/L時有少量菌體生長，這表明降解菌SE08表現出對二甲四氯較強的耐受能力。因此，選擇500mg/L 二甲四氯為最佳初始濃度。(3)不同pH影響下的降解菌SE08生長及二甲四氯降解情況將3mL 菌懸液(OD6ticinm ^ 0.3)加入到 IOOmL 不同 pH 值 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的無機鹽培養液(含二甲四氯500mg/L)中，30°C條件下培養72h，結果見圖6，當pH為6、7、8條件下，菌體生長量和二甲四氯降解率都較大，當pH為6.0時，菌體生長和二甲四氯降解率同時達最大值，在PH為4、9、10的條件下，菌體生長量較小，因此菌株最適生長環境pH為6.0，其次為pH7和8。(4)不同溫度影響下降解菌SE08生長及二甲四氯降解情況:將3mL菌懸液(OD600nm 一 0.3)加入到IOOmL含500mg/L 二甲四氯的無機鹽培養液中，pH6.0，在不同溫度20 V、25°C、30 V、35°C、40 V、45 V條件下培養 72h，結果見圖 7，在 30°C、35°C、40°C條件下有較高的菌體生長量和降解率，在30°C時菌體生長量和二甲四氯降解率達最大，因此30°C為菌株最適培養溫度，高溫(45°C)或者低溫(20°C、25°C)均會影響菌株的生長和降解能力。最終得到的二甲四氯降解菌株SE08最優生長條件是溫度30°C、pH6.0、二甲四氯底物濃度500mg/L，在此條件下，不添加其他碳源和氮源，二甲四氯在無機鹽培養液中培養72h小時可降解68.5%。(5)添加第二碳源葡萄糖和氮源酵母粉對降解菌SE08生長及二甲四氯降解的影響:從圖8可以看出，添加第二到碳源葡萄糖能有效促進菌株的生長和加強二甲四氯降解，當葡萄糖添加量為5mg/L時，菌體生長量和降解率均達最大值，OD600nm和降解率分別為81.0%和0.95，當葡萄糖添加量為7.5mg/L時，菌體生長量和降解率與和添加葡萄糖5.0mg/L相當。當在無機鹽培養液中添加第二碳源葡萄糖5g/L和不同酵母粉氮源添加量(1.0、
2.5,5.0,7.5mg/L)進行共培養時，如圖9所示，酵母粉添加量1.0mg/L和2.5mg/L均能在一定程度上促進菌株生長和加強二甲四氯降解。在溫度30°C、pH6.0、二甲四氯底物濃度500mg/L條件下,添加第二碳源葡萄糖5.0mg/L和氮源酵母粉2.5mg/L時,共培養72小時二甲四氯的降解率達最大值 83.8%，OD600nm為1.09。實驗證明，降解菌SE08對高濃度二甲四氯有較好的耐受性，且有較高效的降解效率，這對于降低土壤和水中高濃度除草劑藥害和毒性具有非常重要的意義。
權利要求
1.一種二甲四氯除草劑降解菌SE08,其特征在于,該降解菌為腸桿菌(Enterobactersp.)，保藏編號為CGMCC N0.7016，保藏日期:2012.12.18，保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心。
2.根據權利要求1所述的二甲四氯除草劑降解菌SE08，其特征在于，該菌株為革蘭氏陰性好氧菌，無芽孢無莢膜；在NA固體培養基上37 V培養24h，菌落的形狀為橢圓，邊緣整齊，表面光滑凸起，菌落為奶白色，不透明，體細胞呈短桿狀，長2.(Γ2.5μπι，寬0.6 0.8 μ m ;該菌株16S rRNA序列全長1076bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1。
3.根據權利要求2所述的二甲四氯除草劑降解菌SE08，其特征在于，所述NA固 體培養基配方如下:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，蒸餾水1L，瓊脂 20.0g，調節 ρΗ7.0-7.4，121°C滅菌 30min。
4.一種權利要求1所述的二甲四氯除草劑降解菌SE08的篩選方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟: (O取污染土樣10.0g于三角瓶中，加入IOOmL含50mg/L 二甲四氯的無機鹽培養液，25 37°C下，15(T220rpm振蕩培養5天； (2)取出IOmL振蕩液加入到90mL含125mg/L二甲四氯的無機鹽培養液，在25 37°C，15(T220rpm繼續振蕩培養5天，依次類推，提高二甲四氯濃度分別為250、500、750、IOOOmg/L,每隔5天，取出IOmL培養液加入到90mL含梯度升高濃度的二甲四氯無機鹽培養液中，25 37°C下，15(T220rpm繼續振蕩培養5天； (3)取1000mg/L二甲四氯無機鹽培養液中的培養物，加入到含有濃度為20g/L瓊脂的無機鹽培養基中進行稀釋涂布，30°`C下培養5天； (4)挑取單菌落，然后在含250mg/L二甲四氯和20g/L瓊脂的無機鹽培養基上采用平板劃線法進行分離純化，獲得純化的以二甲四氯為唯一碳源和能量生長的菌株。
5.根據權利要求4所述的二甲四氯除草劑降解菌SE08的篩選方法，其特征在于，所述無機鹽培養液的配方如下=KH2PO40.5g，K2HPO40.5g，MgSO4.7Η200.2g，CaCl20.lg，NaCl0.2g和1.0mL微量元素溶液，蒸餾水lOOOmL，調節pH為7.0,121°C滅菌30min。
6.根據權利要求5所述的二甲四氯除草劑降解菌SE08的篩選方法，其特征在于，所述的微量元素溶液配方為:ZnCl270mg，MnCl2.4H20100mg, HSb0360mg, CoCl2.6H20200mg,NiCl2.H2040mg, Na2MoO4.2H2035mg, CuCl2.H2020mg, CuSO4.5H2030mg, 37 % 的濃鹽酸 0.9mL,蒸懼水1000mL。
7.—種權利要求1所述的二甲四氯除草劑降解菌SE08在降解土壤或水中的二甲四氯的應用。
全文摘要
本發明屬于環境污染生物修復領域，具體是一種二甲四氯除草劑降解菌SE08及其篩選方法和應用。二甲四氯除草劑降解菌SE08，為腸桿菌(Enterobacter sp.)，保藏編號為CGMCC No.7016，保藏日期2012.12.18，保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心。本發明還公開了上述二甲四氯除草劑降解菌SE08的篩選方法和應用。本發明從湖南省郴州市煙區二甲四氯重污染土壤中經過初篩，然后再復篩及分離純化得到的二甲四氯除草劑降解菌SE08，該降解菌可以有效地降解環境中的二甲四氯殘留，適用于二甲四氯污染的土壤和水中的生物修復。
文檔編號C12N1/02GK103173377SQ20121055868
公開日2013年6月26日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者譚琳, 曾維愛, 鄭雄志, 周志成, 李宏光, 胡秋龍, 譚濟才, 江紫薇 申請人:湖南農業大學, 湖南省煙草公司郴州市公司