專利名稱：從藍(lán)藻中快速分離純化c-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從藍(lán)藻中快速分離純化c-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的方法，屬于藻藍(lán)蛋白分離純化技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景為了研究蛋白質(zhì)等生物大分子的細(xì)胞定位、相互作用及其動態(tài)變化，研究人員急需新技 術(shù)和新材料來實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)等生物大分子的"標(biāo)識"、"閱讀"和"查詢"。現(xiàn)在常用的熒光 標(biāo)記，由于熒光染料分子熒光特性的限制(熒光光譜較寬、量子產(chǎn)率低)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適用于 高通量的生物大分子專一標(biāo)識。藻膽蛋白是一類光合作用捕光色素-蛋白質(zhì)復(fù)合物，主要存在于藍(lán)藻、紅藻、隱藻和少數(shù)甲藻中。在光合作用中起捕獲和傳遞光能的作用，具有強(qiáng)烈的熒光。在藍(lán)藻和紅藻中，由2-3 種藻膽蛋白組成超分子結(jié)構(gòu)藻膽體,形成高效的能量傳遞序列。在80年代中期，美國研究藻 類光合作用的學(xué)者提出將藻膽蛋白作為熒光標(biāo)記物，用于診斷試劑。由于其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，藻膽 蛋白和藻膽蛋白標(biāo)記的診斷試劑在90年代初進(jìn)入國際市場。同常用的熒光標(biāo)記物相比，藻膽蛋白具有下列優(yōu)點(diǎn)生產(chǎn)過程安全、無毒，光能吸收強(qiáng)， 熒光產(chǎn)率高，超過90%，背景光干擾和假陽性率低，在pH4-11的范圍內(nèi)穩(wěn)定，可以作雙色、 三色和四色標(biāo)記。所以，這類試劑的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。但是，由于價(jià)格昂貴，尚未應(yīng)用到 普及型的臨床診斷試劑。我國全部進(jìn)口，也僅限于用細(xì)胞流式儀進(jìn)行的診斷。藻膽蛋白及其診斷試劑主要由美國生產(chǎn)，德國也有產(chǎn)品向我國推銷，英國和我國臺灣正 在研制。最早研制產(chǎn)品的是美國分子探針公司(Molecular Probes, Inc.)現(xiàn)在Sigma公司 共有6種藻膽蛋白產(chǎn)品，藻膽蛋白-Biotin/Avidin標(biāo)記物12種，RPE-IgG或RPE-IgM12種，RPE 單抗標(biāo)記物3種。藻膽蛋白生產(chǎn)沿用已公開的實(shí)驗(yàn)室方法。藻膽蛋白蛋白的種類包括異藻藍(lán) 蛋白(APC)、藻藍(lán)蛋白(PC)、藻紅藍(lán)蛋白(PEC)和藻紅蛋白(PE)四大類，其中，藻藍(lán)蛋白和藻 紅蛋白根據(jù)其光譜特性不同又分為C-藻藍(lán)蛋白(CPC)、R-藻藍(lán)蛋白(RPC)、C-藻紅蛋白(CPE)、 b-藻紅蛋白(b-PE)、 B-藻紅蛋白(BPE)和R-藻紅蛋白(RPE)。其中存在于藍(lán)藻中的C-藻 藍(lán)蛋白(CPC)和異藻藍(lán)蛋白(APC)是目前最常用的藻膽蛋白熒光探針。我國螺旋藻等藍(lán)藻 已經(jīng)開始了工業(yè)化培養(yǎng)，資源非常豐富，是分離純化CPC和APC的很好的材料。國際市場上 決定購、銷關(guān)系的主要是價(jià)格因素。影響普及型診斷試劑的開發(fā)和應(yīng)用的主要因素也是藻膽 蛋白價(jià)格太高。因此，開發(fā)CPC和APC的快速高效分離純化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)高純度CPC和APCE 的低成本大量制備，對于CPC和APC在普及型診斷試劑的應(yīng)用具有重要的意義。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從藍(lán)藻中快速分離純化c-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋 白的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下從藍(lán)藻中快速分離純化C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的方法，步驟如下 (1) C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的提取原料為藍(lán)藻，采用液氮研磨的方法，使藍(lán)藻解體溶解，離心去除細(xì)胞殘?jiān)占锨逡旱玫絚-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白粗提液。(2) C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的初步純化將步驟(l)的粗提液，用硫酸銨沉淀法，使c-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白從粗提液中沉淀 出來，離心收集沉淀，再用pH5.8 6.0、 20mM磷酸緩沖液溶解并透析，除去硫酸銨，即得c-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白溶液。(3) —步法制備高純度C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白將步驟(2)制得的O藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白溶液，用離子交換層析，并用具有恒定的 離子強(qiáng)度、連續(xù)pH梯度的緩沖液進(jìn)行洗脫，分別獲得高純度的C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白。優(yōu)選的，上述步驟(1)中的原料藍(lán)藻為單細(xì)胞藍(lán)藻，具體選自螺旋藻或集胞藻。可以 自行培養(yǎng)或購買。所述步驟(1)具體操作如下取新鮮的藍(lán)藻，按重量體積比l: 1 (g/ml或kg/1)加入液氮進(jìn)行研磨磨碎，然后按鮮藻 重量體積比1: 1 (g/ml或kg/1)加入0.02mol/L磷酸緩沖液(pH5.8~6.0)，溶解，4。C下，8000 rpm 10000rpm離心10 min 15min，上清液即為C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的粗提液。所述步驟(2)具體操作如下向步驟(1)制得的C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白粗提液中加入固體硫酸銨，至濃度為55 60%(w/v)，放置5 6h，然后在4。C下，8000 rpm 10000rpm離心10 min 15min，取沉淀， 并將沉淀溶于20mM的磷酸緩沖液(pH5.8~6.0)中，將溶有沉淀的磷酸緩沖液進(jìn)行透析，透 析液即為C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白溶液。上述沉淀與磷酸緩沖液的比例沒有嚴(yán)格限定，只 要沉淀能夠完全溶解即可。所述步驟(3)具體操作如下取步驟(2)制得的C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白溶液1.5 2.5ml，上瓊脂糖凝膠FF (DEAE Sepharose Fast Flow)離子交換色譜柱，然后用含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸緩沖液 (pH5.6，)洗脫，再用20mmol/L醋酸緩沖液(pH5.8，含0.05mol/L NaCl)和20mmol/L 醋酸緩沖液(pH4.0，含0.05mol/LNaCl)各lOOmL進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度為1 1.2mL/min， 洗脫曲線見圖l，檢測波長280nm，根據(jù)洗脫曲線分別收集蛋白峰A和蛋白峰B，得到高純 度的C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白(圖2A，圖2B)。優(yōu)選的，所述步驟(3)中的DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱是經(jīng)20mmol/L 醋酸緩沖液(pH5.8，含0.05mol/LNaCl)預(yù)先平衡的，規(guī)格為0.6X10cm。以上操作步驟如無特別說明，均按本領(lǐng)域常規(guī)操作。經(jīng)吸收光譜檢測，得到的純化CPC，最大吸收峰為615nm，純度A615/A2犯達(dá)到了 5.59; 580nm光激發(fā)，最大熒光發(fā)射峰位于640nm (圖2A)。純化的APC最大吸收峰為650nm， 純度A650/A28o達(dá)到了 5.19; 580nm光激發(fā)，最大熒光發(fā)射峰位于660nm (圖2B)。 一般 認(rèn)為，A620/A2so和A650/A28o達(dá)到4.5以上，就認(rèn)為CPC和APC己經(jīng)純化，因此，該一步 法離子交換層析得到的CPC和APC是高純化的。Native—PAGE電泳檢測，分離純化的CPC 和APC分別只有一個(gè)條帶，進(jìn)一步表明分離純化的CPC和APC沒有其它蛋白的污染(圖3)。 本發(fā)明的優(yōu)良效果在于，以藍(lán)藻為材料，應(yīng)用液氮研磨快速提取CPC和APC，然后經(jīng) 硫酸銨沉淀進(jìn)行初步純化，最后根據(jù)CPC和APC在較寬的pH范圍內(nèi)保持穩(wěn)定的特性和不 同的等電點(diǎn)特性，利用DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析技術(shù)，用恒定的離子強(qiáng)度、連續(xù)pH梯度的緩沖液進(jìn)行洗脫， 一步法可以同時(shí)得到高純度的CPC和APC。本方法省去 了傳統(tǒng)的應(yīng)用分子篩層析結(jié)合離子強(qiáng)度洗脫的離子交換層析的復(fù)雜分離純化程序，克服了難 于規(guī)模化快速制備的難題，操作簡便，省時(shí)省力，對設(shè)備要求簡單，得率高，容易大量制備 并且大大降低了 CPC和APC的制備成本，從而為將CPC和APC應(yīng)用于超靈敏的生物醫(yī)學(xué)檢測 奠定了基礎(chǔ)，具有很好的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)效益。


圖1是鈍頂螺旋藻CPC和APC連續(xù)剃度離子交換層析洗脫曲線(檢測波長280)，峰A 為CPC，峰B為APC。圖2A是圖1的峰A中分離純化的CPC的吸收光譜(實(shí)線)和熒光發(fā)射光譜(虛線)。 吸收峰分別為615nm， A615/A280達(dá)到了 5. 59，表明已經(jīng)高度純化。用580nm激發(fā)，熒光發(fā) 射峰位于640腦，與標(biāo)準(zhǔn)熒光發(fā)射峰相同。圖2B是圖1的峰B中分離純化的APC的吸收光譜(實(shí)線)和熒光發(fā)射光譜(虛線)。 吸收峰分別為650nm， A650/A280達(dá)到了 5. 19，表明已經(jīng)高度純化。用580nm激發(fā)，熒光發(fā) 射峰位于660nm，與標(biāo)準(zhǔn)熒光發(fā)射峰相同。圖3分離純化的鈍頂螺旋藻CPC和APC的聚丙烯酰氨凝膠電影(Native — PAGE)電泳 圖譜，泳道1為CPC,泳道2為APC。在Native—PAGE中，CPC和APC都分別只有一個(gè)條帶， 進(jìn)一步說明分離純化的CPC和APC沒有其它蛋白的污染。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合說明書附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不僅限于此。實(shí)施例1從藍(lán)藻中快速分離純化C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的方法，步驟如下(1) C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的提取取新鮮的螺旋藻，按重量體積比l: 1 (g/ml)加入液氮研磨磨碎，然后按鮮藻重量體積比l: 1加入0.02mol/L磷酸緩沖液(pH5.8)，溶解，4'C下，8000 rpm離心15min，上清液即為c-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的粗提液。(2) C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的初步純化向上述步驟(1)制得的C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白粗提液中加入固體硫酸銨，至濃度 為60%(w/v)，放置5h，然后在4'C下，10000rpm離心10 min，取沉淀，并將沉淀溶于 20mM的磷酸緩沖液(pH5.8)中，將溶有沉淀的磷酸緩沖液進(jìn)行透析，透析液即為C-藻藍(lán) 蛋白和異藻藍(lán)蛋白溶液。(3) —步法制備高純度C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白取步驟(2)制得的C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白溶液2.0ml，上經(jīng)20mmol/L醋酸緩沖液 (pH5.8，含0.05mol/LNaCl)預(yù)先平衡的DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱，規(guī)格 為0.6X10cm，然后用含O.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸緩沖液(pH5.6，)洗脫，再用 20mmol/L醋酸緩沖液(pH5.8，含0.05mol/L NaCl)和20mmol/L醋酸緩沖液(pH4.0，含 0.05mol/LNaCl)各100mL進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度為lmL/min，洗脫曲線見圖l，檢測波 長280腦，根據(jù)洗脫曲線分別收集蛋白峰A和蛋白峰B，得到高純度的C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán) 蛋白(圖2A，圖2B)。實(shí)施例2從藍(lán)藻中快速分離純化C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的方法，步驟如下(1) C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的提取取新鮮的集胞藻，按重量體積比l: 1 (g/ml)加入液氮研磨磨碎，然后按重量體積比 1: 1加入0.02mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)，溶解，4'C下，10000rpm離心10 min，上清液即為c-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的粗提液。(2) C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的初步純化向上述步驟(1)制得的C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白粗提液中加入固體硫酸銨，至濃度 為55。/。(w/v)，放置6h，然后在4。C下，8000 rpm離心15min，取沉淀，并將沉淀溶于20mM 的磷酸緩沖液(pH6.0)中，將溶有沉淀的磷酸緩沖液進(jìn)行透析，透析液即為C-藻藍(lán)蛋白 和異藻藍(lán)蛋白溶液。(3) —步法制備高純度C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白取步驟(2)制得的C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白溶液2.5ml，上經(jīng)20mmol/L醋酸緩沖液 (pH5.8，含0.05mol/LNaCl)預(yù)先平衡的DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱，規(guī)格 為0.6X10cm，然后用含O.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸緩沖液(pH5.6，)洗脫，再用 20mmol/L醋酸緩沖液(pH5.8,含O.05mol/L NaCl)和20mmol/L醋酸緩沖液(pH4.0，含 O.05mol/L NaCl)各lOOmL進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度為1.2mL/min，洗脫曲線見圖1，檢測 波長280nm，根據(jù)洗脫曲線分別收集蛋白峰A和蛋白峰B，得到高純度的C-藻藍(lán)蛋白和異藻 藍(lán)蛋白(圖2A，圖2B)。
權(quán)利要求
1、從藍(lán)藻中快速分離純化C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的方法，步驟如下(1)原料為藍(lán)藻，采用液氮研磨的方法，使藍(lán)藻解體溶解，離心去除細(xì)胞殘?jiān)占锨逡旱玫紺-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白粗提液；(2)將步驟(1)的粗提液，用硫酸銨沉淀法，使C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白從粗提液中沉淀出來，離心收集沉淀，再用pH5.8～6.0、20mM磷酸緩沖液溶解并透析，除去硫酸銨，即得C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白溶液；(3)將步驟(2)制得的C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白溶液，用離子交換層析，并用具有恒定的離子強(qiáng)度、連續(xù)pH梯度的緩沖液進(jìn)行洗脫，分別獲得高純度的C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白。
2、 如權(quán)利要求l所述的從藍(lán)藻中快速分離純化C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的方法，其特 征在于，所述步驟(1)具體如下取新鮮的藍(lán)藻，按重量體積比1: 1加入液氮研磨磨碎，然后按重量體積比1: 1加入0.02mol/L磷酸緩沖液(pH5.8 6.0)，溶解，4。C下，8000 rpm 10000rpm離心10min 15min,上清液即為c-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的粗提液。
3、 如權(quán)利要求l所述的從藍(lán)藻中快速分離純化C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的方法，其特 征在于，所述藍(lán)藻為單細(xì)胞藍(lán)藻，選自螺旋藻或集胞藻。
4、 如權(quán)利要求1所述的從藍(lán)藻中快速分離純化C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的方法，其特 征在于，所述步驟(2)具體操作為向上述步驟(1)得到的C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白粗 提液中加入固體硫酸銨，至濃度為55 60%，重量體積比，放置5 6h，然后在4。C下，8000 rpm 10000rpm離心10 min 15min，取沉淀，并將沉淀溶于pH5.8 6.0的20mM的磷酸緩沖 液中，將溶有沉淀的磷酸緩沖液進(jìn)行透析，透析液即為C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白溶液。
5、 如權(quán)利要求l所述的從藍(lán)藻中快速分離純化C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的方法，其特 征在于，所述步驟(3)具體操作如下取步驟(2)制得的C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白溶液1.5 2.5ml，上DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱，然后用pH5.6、含0.05mol/LNaCl的20mmol/L醋酸緩沖液洗脫，再 用pH5.8、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸緩沖液和pH4.0、含0.05mol/L NaCl的 20mmol/L醋酸緩沖液各lOOmL進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度為1 1.2mL/min，檢測波長280nm，根據(jù)洗脫曲線分別收集c-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白，得到高純度的c-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白。
6、 如權(quán)利要求5所述的從藍(lán)藻中快速分離純化C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的方法，其特 征在于，所述DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱是經(jīng)pH5.8、含0.05mol/L NaCl的 20mmol/L醋酸緩沖液預(yù)先平衡的，規(guī)格為0.6X lOcm。
全文摘要
一種從藍(lán)藻中快速分離純化C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白的方法，屬于藻藍(lán)蛋白分離純化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明應(yīng)用經(jīng)凍溶和低離子強(qiáng)度溶漲快速提取C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白，然后經(jīng)硫酸銨沉淀進(jìn)行初步純化，最后利用瓊脂糖凝膠FF(DEAE Sepharose Fast Flow)離子交換層析技術(shù)，用恒定的離子強(qiáng)度、pH梯度的緩沖液進(jìn)行洗脫，一步法可以得到高純度的C-藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白。本方法操作簡便，省時(shí)省力，對設(shè)備要求簡單，得率高并且大大降低了CPC和APC的制備成本，從而為將CPC和APC應(yīng)用于超靈敏的生物醫(yī)學(xué)檢測奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C07K1/30GK101240010SQ20081001440
公開日2008年8月13日 申請日期2008年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月28日
發(fā)明者周百成, 張熙穎, 張玉忠, 陳秀蘭, 顏世敢 申請人:山東大學(xué)