專利名稱：修飾的動物促紅細胞生成素多肽和其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及經至少一個非天然編碼的氨基酸修飾的貓、犬和馬促紅細胞生成素多肽。
背景技術：
生長激素(GH)超基因家族(貝贊F. (Bazan, F.)，現代免疫學(Immunology Today)，11 :350-354(1991)；莫特 H. R. (Mott，H. R.)和坎貝爾 I. D. (Campbell，I. D.)，結構生物學的當前觀點(Current Opinion in Structural Biology) 5 :114-121 (1995)；西文諾曼0. (Silvennoinen, 0.)和艾利J. N. (Ihle，J. N.) (1996)造血細胞因子受體的信號傳導(SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS))代表了一組具有類似結構特征的蛋白質。盡管這一家族中仍有較多的成員有待鑒別，但一些家族成員包括下述各物 生長激素、催乳激素、胎盤催乳素、促紅細胞生成素(erythropoietin，ΕΡ0)、血栓形成素 (thrombopoietin, ΤΡ0)、白細胞介素 _2 (IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、 IL-IU IL-12(p35亞基)、IL-13、IL-15、制瘤素M、睫狀神經營養因子、白血病抑制因子、 α干擾素、β干擾素、Y干擾素、ω干擾素、τ干擾素、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細Ifi - (granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)和心肌營養素-1(0虹肚0廿叩1^11-1，01-1)( “GH超基因家族”)。盡管GH超基因家族的成員一般具有有限的氨基酸或DNA序列一致性，但其具有類似的二級結構和三級結構。共有的結構特征使得易于鑒別出基因家族的新成員。GH超基因家族的一個成員是貓促紅細胞生成素(feline erythropoietin，fEPO)。 天然存在的促紅細胞生成素(EPO)是在哺乳動物腎臟和肝中產生的分子量為34千道爾頓 (kDa)的糖蛋白激素。EPO是紅細胞生成過程中的關鍵組分，可誘導祖先紅細胞增殖和分化。EPO的活性還與包括球蛋白和碳酸酐酶在內的多種紅細胞特異性基因的活化相關。例如參見邦德倫特(Bondurant)等人，分子細胞生物學(Mol. Cell Biol.) 5 :675-683(1985)； 考雷(Koury)等人，細胞生理學雜志(J. Cell. Physiol. ) 126 :259-265 (1986)。促紅細胞生成素受體(EpoR)是造血/細胞因子/生長因子受體家族的成員，這一家族包括數種其它生長因子受體，例如白細胞介素(IL)-3、IL-4和IL-6受體、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)受體以及催乳激素和生長激素受體。參見貝贊(Bazan)，美國國家科學院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci USA) 87 :6934-6938 (1990)。細胞因子受體家族的成員含有4個保守半胱氨酸殘基和剛好位于跨膜區外部的色氨酸-絲氨酸-X-色氨酸-絲氨酸基序。這些保守序列被認為涉及蛋白質-蛋白質相互作用。例如參見千葉(Chiba)等人，生物化學與生物物理研究通訊(Biochim. Biophys. Res. Comm) 184 :485-490 (1992)。美國專利第5，441，868 號、第 5，547，933 號、第 5，618，698 號和第 5，621，080 號描述了編碼人EPO的DNA序列，以及具有天然存在的EPO的部分或全部一級結構構象和生物特性的分離多肽。
EPO的生物作用是來源于其與特定細胞受體的相互作用。人們已經充分了解了 EPO與其受體細胞外結構域(EPObp)之間的相互作用。高分辨率χ射線晶體學數據顯示， EPO具有兩個受體結合位點，并依序使用分子上的不同位點結合兩個受體分子。這兩個受體結合位點稱為位點I和位點II。位點I包括螺旋D的羧基末端以及部分螺旋A和A-B環， 而位點II涵蓋螺旋A的氨基末端區和一部分螺旋C。EPO與其受體的結合是依序發生的， 其中位點I首先結合。接著，位點Π與第二個EPO受體接合，引起受體二聚化以及細胞內信號傳導路徑的活化，從而產生細胞對激素的反應。重組人EPO可用作治療劑，并且已經被批準用于治療人類個體。EPO缺乏會引起貧血，例如，這已經通過外源投予激素成功地進行治療。貧血可大致分為兩類再生性和非再生性貧血。再生性貧血傾向于由失血引起，或是由免疫系統引起紅細胞破壞所致。另一方面，非再生性貧血是骨髓沒有或無法對貧血作出反應的病癥。引起貧血的常見原因是慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)，而其它病例中大部分是由感染貓白血病毒(feline leukemia virus, FeLV)所引起。這兩種病癥是導致寵物貓死亡的1號O^LV)和2號(CRF)原因。人們已經使用hEPO來治療貓貧血。 不幸的是，當使用hEPO治療貓貧血時，會出現有關免疫原性的問題，而且用hEPO治療的貓中約25%到33%出現紅細胞再生障礙性貧血(red cell aplasia，RCA)。曾進行了多項研究，包括用重組hEPO治療患有CRF的11只貓和6只狗的研究，盡管重組hEPO在某種程度上顯示出增加紅細胞(RBC)和網織紅細胞計數的能力，但11只貓中有5只產生了抗r-hEPO抗體(LD考基爾(LD Cowgill)等人，美國獸醫協會雜志(J Am Vet Med Assoc.) 1998年2月 15日；212 ) :521-8)。利用沈只測試貓個體進行了有關重組貓促紅細胞生成素(rfEPO) 的安全性和功效的研究，發現盡管RBC和網織紅細胞計數也有所升高，但沈只貓中有8只 (即，超過30% )產生了抗r-fEP0抗體(JE雷多夫(JE Randolph)等人，美國獸醫研究雜志(Am J Vet Res.) 2004年10月；65(10) =1355-66) 在另一項研究中，對由10只貓構成的研究組投予含有貓促紅細胞生成素cDNA的重組2型腺相關病毒(rAAW)載體，發現在所有用載體處理的貓中都檢測到了 rAAV2抗體，1只貓患上純紅細胞再生障礙性貧血，而用較低量處理的貓未顯示出作用(MC沃克(MC Walker)等人，美國獸醫研究雜志(Am J Vet Res. )2005 年 3 月；66 (3) :450-6)。共價連接親水性聚合物聚(乙二醇)(縮寫為PEG)是一種增加許多生物活性分子 (包括蛋白質、肽，尤其是疏水性分子)的水溶性、生物利用率；增加血清半衰期；增加治療半衰期；調節免疫原性；調節生物活性；或延長循環時間的方法。PEG已被廣泛用于醫藥品或人工移植物以及生物相容性、無毒和無免疫原性極為重要的其它應用中。為了使PEG的所需特性最大化，與生物活性分子連接的PEG聚合物的總分子量和水合狀態必須足夠高， 以便賦予通常與PEG聚合物連接相關的有利特征，例如增加的水溶性和循環半衰期，同時不會不利地影響母體分子的生物活性。PEG衍生物常常是通過反應性化學官能團(例如賴氨酸、半胱氨酸和組氨酸殘基、N末端和碳水化合物部分)與生物活性分子鍵聯。蛋白質和其它分子通常具有少數反應性位點可供聚合物連接。通常，最適于經由聚合物連接而修飾的位點在受體結合中起到重要作用，并且是保留分子的生物活性所必需的。因此，不加選擇地將聚合物鏈與生物活性分子上的這些反應性位點連接，通常會使經聚合物修飾的分子的生物活性顯著降低或甚至完全喪失。R.克拉克(R. Clark)等人，(1996)，牛物化學雜志(T. Biol. Chem.)，271 21969-21977。為了形成具有足夠聚合物分子量以賦予目標分子所需優勢的結合物，現有技術方法通常涉及將多個聚合物臂與分子隨機連接，由此增加了母體分子生物活性降低乃至完全喪失的風險。形成PEG衍生物與蛋白質的連接點的反應性位點可由蛋白質的結構指示。蛋白質 (包括酶)是由各種α-氨基酸序列構成，這些序列的一般結構為H2N--CHR--C00H。一個氨基酸的α氨基部分(H2N-)與相鄰氨基酸的羧基部分(一C00H)連接形成酰胺鍵，其可表示為一(NH--CHR--CO)n--,其中下標“η”可等于數百或數千。R表示的片段可含有關于蛋白質生物活性和連接PEG衍生物的反應性位點。舉例來說，在氨基酸賴氨酸的情況下，在ε位以及α位中存在一NH2部分。 ε -NH2在堿性ρΗ條件下自由反應。用PEG進行蛋白質衍生化領域中的很多技術都是針對開發用于連接蛋白質中存在的賴氨酸殘基的ε-NH2部分的PEG衍生物。“用于先進聚乙二醇化技術的聚乙二醇禾口 行生物(Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation) ”，奈克塔分子工程目錄(Nektar Molecular Engineering Catalog)，2003，第 1-17頁。然而，這些PEG衍生物都具有共有的局限性，即，無法將其選擇性地安裝于蛋白質表面上存在的常見的多種賴氨酸殘基上。在賴氨酸殘基對于蛋白質活性極為重要(例如存在于酶活性位點中)的情況下，或在賴氨酸殘基對于介導蛋白質與其它生物分子的相互作用起作用的情況下，如在受體結合位點的情況下，這將會成為顯著的局限性?，F有蛋白質聚乙二醇化方法的另一同等重要的難題在于，PEG衍生物可與除所需殘基外的其它殘基發生不必要的副反應。組氨酸含有結構以一N(H)--表示的反應性亞氨基部分，而許多與ε -NH2反應的衍生物也可與一N(H)--反應。類似地，氨基酸半胱氨酸的側鏈具有游離硫氫基，結構以-SH表示。在一些情況下，針對賴氨酸ε--ΝΗ2基團的PEG衍生物也與半胱氨酸、組氨酸或其它殘基反應。這樣可產生經PEG衍生化的生物活性分子的復雜不均勻混合物，并且有破壞目標生物活性分子活性的風險。需要開發出這樣的PEG衍生物，其允許在蛋白質內的單一位點引入化學官能團，隨后使一種或一種以上PEG聚合物能夠在蛋白質表面上明確界定且可預測的特定位點與生物活性分子選擇性偶合。除賴氨酸殘基外，此項技術中還曾就開發靶向其它氨基酸側鏈(包括半胱氨酸、組氨酸和N末端)的活性PEG試劑進行了大量嘗試。美國專利第6，610，281號。“用于先進聚乙二醇化技術的聚乙二醇和衍生物(Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation)，，，奈克塔分子工禾呈目錄(Nektar Molecular Engineering Catalog)，2003，第1_17頁?？梢允褂枚c誘變和此項技術中已知的其它技術，將半胱氨酸殘基位點選擇性地引入蛋白質結構中，并且由此得到的游離硫氫基部分可與具有硫醇反應性官能團的PEG衍生物反應。但這種方法比較麻煩，因為引入游離硫氫基會使所得蛋白質的表達、折疊和穩定性變得復雜。因此，需要具有一種將化學官能團引入生物活性分子中的方式，其能使一種或一種以上PEG聚合物與蛋白質選擇性偶合，同時還與硫氫基以及蛋白質中常見的其它化學官能團相容(即，不會與之發生不必要的副反應)。從此項技術的抽樣(sampling)中可以了解到，所開發的用于連接蛋白質側鏈，尤其賴氨酸氨基酸側鏈上的一NH2部分和半胱氨酸側鏈上的-SH部分的許多此類衍生物都證實在合成和使用方面存在問題。一些衍生物與蛋白質形成不穩定鍵，這些鍵將經歷水解，并因此分解、降解，或者以其它方式在水性環境(例如血流)中不穩定。一些衍生物可形成較為穩定的鍵，但會在形成鍵之前經歷水解，這意味著PEG衍生物上的反應性基團可能會在連接蛋白質之前就失活。一些衍生物略帶毒性，因此不太適于體內使用。一些衍生物反應過慢而無法實際使用。一些衍生物會因連接到負責蛋白質活性的位點而導致蛋白質活性喪失。一些衍生物對其將連接的位點不具特異性，這也會導致喪失所需活性以及缺乏結果的可再現性。為了克服用聚(乙二醇)部分修飾蛋白質所帶來的問題，人們開發出了更為穩定(例如，美國專利第6，602，498號)或與分子和表面上的硫醇部分選擇性反應(例如，美國專利6，610，觀1)的PEG衍生物。此項技術中無疑需要在生理環境中具化學惰性，而只有在需要的情況下才選擇性反應形成穩定化學鍵的PEG衍生物。近來，已經報導了蛋白質科學中的一種全新技術，這項技術有望克服與蛋白質位點特異性修飾相關的眾多局限。具體點說，已將新的組分加入到原核生物大腸桿菌 (Escherichia coli,E. coli)(例如參見 L.王(L.Wang)等人，(2001),科學(Science) 292 498-500)和真核生物釀酒酵母菌(Sacchromyces cerevisia, S. cerevisiae)(例如 J.秦 (J. Chin)等人，—301 :964-7(2003))的蛋白質生物合成機器中，使得所述機器能夠在體內將非基因編碼氨基酸并入蛋白質中。已使用這一方法，對琥珀密碼子TAG作出反應，以高保真度將大量具有新穎化學、物理或生物特性的新氨基酸有效地并入大腸桿菌和酵母中的蛋白質中，所述氨基酸包括光親和性標記和光敏異構化氨基酸、酮基氨基酸和糖基化氨基酸。例如參見J. W.秦(J. W. Chin)等人，(2002)，美國化學協會雜志(Journal of the American Chemical Society) 124 :9026-9027 ;J. W.秦和 P. G.查魯茲(P. G. Schultz)， (2002)，化學與生物化學(ChemBioChem)Il :1135-1137 ;J. ff.秦等人，(2002)，美國國家科學院院刊(PNAS United States of America) 99 :11020-11024 ；禾口 L··王(L. ffang)和P. G.查魯茲(P. G. Schultz)，(2002)，化學通訊(Chem. Comm.)，1_10。這些研究已證實，有可能選擇性地以常規方式引入一些化學官能團，例如炔基和疊氮部分，這些官能團不存在于蛋白質中，對20種常見的基因編碼氨基酸中所見的所有官能團具化學惰性，并能用于有效且選擇性反應而形成穩定共價鍵。將非基因編碼氨基酸并入蛋白質的能力允許引入可向天然存在的官能團(例如賴氨酸的-NH2、半胱氨酸的硫氫基-SH、組氨酸的亞氨基等)提供有價值的替代選擇的化學官能團。已知某些化學官能團對20種常見的基因編碼氨基酸中所見的官能團呈惰性，但能干凈且有效地反應以形成穩定鍵。例如此項技術中已知，疊氮基和乙炔基在催化量銅存在下，可在水性條件中進行胡伊斯根(Huisgen) [3+2]環加成反應。例如參見托尼諾(Tornoe) 等人，(2002)有機化學(Org. Chem.)67 :3057-3064 和羅斯托瑟夫(Rostovtsev)等人， (2002)德國應用化學(AnSew. Chem. Int. Ed. )41 :2596_2599。舉例來說，通過將疊氮部分引入蛋白質結構中，就能夠并入對蛋白質中所見的胺、硫氫基、羧酸、羥基具化學惰性，但也可與乙炔部分平穩且有效地反應而形成環加成產物的官能團。重要的是，在不存在乙炔部分的情況下，疊氮基仍保留化學惰性，而且在其它蛋白質側鏈存在時在生理條件下不發生反應。本發明將特別針對與EPO的活性和制備有關的問題，并且還針對具有改進的生物或藥理學特性(例如改進的治療半衰期)的hEPO多肽的制備。
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發明內容
本發明提供包含非天然編碼氨基酸的fEPO多肽。在一些實施例中，fEPO多肽與第二 fEPO連接。 在一些實施例中，非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。在一些實施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些實施例中，聚(乙二醇)分子是一種雙官能聚合物。在一些實施例中，雙官能聚合物與第二多肽連接。在一些實施例中，所述第二多肽是 fEPO多肽。在一些實施例中，fEPO多肽包含至少兩個氨基酸，連接到包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物。在一些實施例中，至少一個氨基酸是非天然編碼氨基酸。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入fEPO中以下一個或一個以上對應于二級結構的區域中的任一位置1-7 (N末端)、8力6 (A螺旋)、27巧4 (A螺旋與B螺旋之間的區域),55-83 (B螺旋),84-89 (B螺旋與C螺旋之間的區域),90-112 (C螺旋)、113-137 (C螺旋與D螺旋之間的區域)、138-161 (D螺旋)、162-166 (C末端)、39-41 ( β 折疊1)、133-135 ( β折疊2) ,47-52 (微型B環)、114-121 (微型C環),34-38 (Α螺旋與反平行β 折疊之間的環)、51-57(Β'螺旋的C末端、B'螺旋與B螺旋之間的環以及B螺旋的N末端)、82-92(Β螺旋與C螺旋之間的區域)和120-133(C'螺旋與反平行β折疊2 之間的區域)。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入fEPO中以下位置中的一者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、 76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、 101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、 139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、 158、159、160、161、162、163、164、165和166。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入fEPO中以下位置中的一者:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、 152、153、154、155、156、157、158，159、160、161、162、163、164、165 和 166。在一些實施例中， 將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入fEPO中以下位置中的一者1、2、3、4、5、6、17、 21、24、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58、68、72、76、 80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、113、116、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、136、162、163、164、165 和 166。在一些實施例中，將一個或一個以上非天然編碼氨基酸并入fEPO中以下位置中的一者1、2、3、4、5、6、17、18、 21、24、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58、68、72、76、
1180、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、113、116、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、136、162、163、164、165 和 166。在一些實施例中，本發明的fEPO多肽在以下一個或一個以上位置包含一個或一個以上非天然編碼氨基酸21、 24、27、28、30、31、34、36、37、38、40、55、68、72、76、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、
123、124、125、126、127、128、129、130、136和162。在一些實施例中，在這些或其它位置的非天然存在氨基酸與水溶性分子連接，所述位置包括(但不限于)以下位置21、M、38、83、 85、116和119。在一些實施例中，本發明的fEPO多肽在以下一個或一個以上位置包含一個或一個以上非天然編碼氨基酸18、53、58、116、121、89、94、72、77、86、91、31、36、132、137、 163、168、120、125、55和60。在一些實施例中，本發明的fEPO多肽在以下一個或一個以上位置包含一個或一個以上非天然編碼氨基酸53、58、116、121、89、94、72、77、86、91、31、36、 132、137、163、168、120、125、55和60。在一些實施例中，本發明的fEPO多肽在以下一個或一個以上位置包含一個或一個以上非天然編碼氨基酸18、53、58、116、121、89、94、72、77、86、 91、31、36、132、137、163、168、120、125、55和60。在一些實施例中，在這些或其它位置的非天然存在氨基酸與水溶性分子連接，所述位置包括(但不限于)以下位置53、58、116、121、 89、94、72、77、86、91、31、36、132、137、163、168、120、125、55 和 60。在一些實施例中，本發明的fEPO多肽在以下一個或一個以上位置包含一個或一個以上非天然編碼氨基酸123、
124、125、126、127、128、1 和130。在一些實施例中，在這些或其它位置的非天然存在氨基酸與水溶性分子連接，所述位置包括(但不限于)以下位置123、1對、125、1沈、127、1觀、 129 和 130。在一些實施例中，fEPO多肽包含增加fEPO多肽對促紅細胞生成素受體的親和力的取代、添加或缺失。在一些實施例中，fEPO多肽包含增加fEPO多肽的穩定性的取代、添加或缺失。在一些實施例中，fEPO多肽包含增加fEPO多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些實施例中，fEPO多肽包含增加宿主細胞中產生的fEPO多肽的溶解性的取代、添加或缺失。在一些實施例中，fEPO多肽包含SEQ ID NO :2中選自由以下(但不限于)各氨基酸組成的群組的氨基酸取代N24、N36、N38、Q58、Q65、N83、Q86、G113、Q115和S126，及其組合。 在一些實施例中，fEPO多肽包含SEQ ID NO :4中選自由以下(但不限于)各氨基酸組成的群組的氨基酸取代:N24、N36、N38、Q58、Q65、N83、Q86、G113、Q115 和 S126，及其組合。在一些實施例中，可以用天然存在或非天然存在的氨基酸取代fEPO多肽中的氨基酸，只要至少一個取代是用非天然編碼氨基酸進行即可。在一些實施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、胼基、酰胼基、氨基脲基、疊氮基或炔基。在一些實施例中，非天然編碼氨基酸包含羰基。在一些實施例中，非天然編碼的氨基酸具有以下結構
(CH2)nR1COR2 RaHN ^COR4 其中η為0到10 為烷基、芳基、經取代烷基或經取代芳基；R2為H、烷基、芳基、
經取代烷基和經取代芳基；且民為H、氨基酸、多肽，或氨基末端修飾基團；且R4為H、氨基酸、多肽，或羧基末端修飾基團。 在一些實施例中，非天然編碼氨基酸包含氨氧基。在一些實施例中，非天然編碼氨基酸包含酰胼基。在一些實施例中，非天然編碼氨基酸包含胼基。在一些實施例中，非天然編碼氨基酸殘基包含氨基脲基。 在一些實施例中，非天然編碼氨基酸殘基包含疊氮基。在一些實施例中，非天然編碼氨基酸具有以下結構
權利要求
1.一種貓促紅細胞生成素(fEPO)多肽，其特征在于，包含非天然編碼氨基酸。
2.根據權利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述fEPO多肽與至少一另一fEPO 多肽連接。
3.根據權利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。
4.根據權利要求3所述的fEPO多肽，其特征在于，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇) 部分。
5.根據權利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分子是雙官能聚合物。
6.根據權利要求5所述的fEPO多肽，其特征在于，所述雙官能聚合物與第二多肽連接。
7.根據權利要求6所述的fEPO多肽，其特征在于，所述第二多肽為非fEPO多肽。
8.根據權利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，包含至少兩個氨基酸連接到包含聚 (乙二醇)部分的水溶性聚合物。
9.根據權利要求8所述的fEPO多肽，其特征在于，至少一個與所述水溶性聚合物連接的氨基酸為非天然編碼氨基酸。
10.根據權利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸在SEQID NO 2中選自由殘基1-7、27-54、84-89、114-137、162-166組成的群組的位置進行取代。
11.根據權利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸在SEQID NO :2中選自由以下組成的群組的位置進行取代殘基1、2、3、4、5、6、8、9、17、21、 24、25、26、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、45、47、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、65、68、72、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、107、110、111、 113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、 132、133、134、136、154、157、158、159、160、162、163、164、165 和 166。
12.根據權利要求11所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸在SEQID NO 2中選自由以下組成的群組的位置進行取代殘基2、4、17、21、24、27、28、30、31、32、34、 36、37、38、40、50、53、55、58、65、68、72、76、80、82、83、85、86、87、89、113、115、116、119、120、 121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、134、136 和 162，以及其組合。
13.根據權利要求11所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸在SEQ ID NO 2中選自由以下組成的群組的位置進行取代殘基21、對、28、30、31、36、37、38、55、72、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、130 和 162，以及其組合。
14.根據權利要求11所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸在SEQID NO 2中選自由以下組成的群組的位置進行取代殘基21、對、38、83、85、86、89、116、119、 121、124、125、126、127 和 128，以及其組合。
15.根據權利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸在SEQID NO 2中選自由以下組成的群組的位置進行取代:24、36、38、58、65、83、86、113、115、126和其組合。
16.根據權利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述fEPO多肽包含增加所述fEPO多肽對促紅細胞生成素受體的親和力的取代、添加或缺失。
17.根據權利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述fEPO多肽包含增加所述fEPO 多肽的穩定性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
18.根據權利要求16所述的fEPO多肽，其特征在于，包含在SEQID NO 2中選自由但不限于以下組成的群組的氨基酸取代S9A、F48S、Y49S、A50S、Q59A、A73G、G101A、T106A、 L108A、T132A、R139A、K140A、R143A、S146A、N147A、R150A 和 K154A,以及其組合。
19.根據權利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸對水溶性聚合物具反應性，而所述水溶性聚合物另外對20種常見氨基酸中的任一種無反應性。
20.根據權利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸包含羰基、 乙?；?、氨氧基、胼基、酰胼基、氨基脲基、疊氮基或炔基。
21.根據權利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸包含羰基。
22.根據權利要求21所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸具有以下結構(CH2)nR1COR2 R3HN COR4其中η為0-10 為烷基、芳基、經取代烷基或經取代芳基；R2為H、烷基、 芳基、經取代烷基和經取代芳基；且民為H、氨基酸、多肽，或氨基末端修飾基團； 且R4為H、氨基酸、多肽，或羧基末端修飾基團。
23.根據權利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸包含氨氧基。
24.根據權利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸包含酰胼基。
25.根據權利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸包含胼基。
26.根據權利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸殘基包含氨基脲基。
27.根據權利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸殘基包含疊氮基。
28.根據權利要求27所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸具有以下結構(CH2)nR1X(CH2)mN3 R2H N xx^COR3其中η為0-10 為烷基、芳基、經取代烷基、經取代芳基或不存在；X為0、N、S或不存在；m為0-10 ;R2為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團；且民為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團。
29.根據權利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸包含炔基。
30.根據權利要求四所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸具有以下結構(CH2)nR1X(CH2)mCCH RzHN'^'^CORa其中η為0-10 為烷基、芳基、經取代烷基或經取代芳基；X為0、N、S或不存在m為 0-10出2為H、氨基酸、多肽或氨基末端修飾基團；且民為H、氨基酸、多肽或羧基末端修飾基團。
31.根據權利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分子的分子量介于約IkDa與約IOOkDa之間。
32.根據權利要求31所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分子的分子量介于IkDa與50kDa之間。
33.根據權利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，是通過使包含含羰基氨基酸的 fEPO多肽與包含氨氧基、羥胺基、胼基、酰胼基或氨基脲基的聚(乙二醇)分子反應而制成。
34.根據權利要求33所述的fEPO多肽，其特征在于，所述氨氧基、羥胺基、胼基、酰胼基或氨基脲基經由酰胺鍵與所述聚(乙二醇)分子連接。
35.根據權利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，是通過使包含羰基的聚(乙二醇) 分子與包含非天然編碼氨基酸的多肽反應而制成，所述非天然編碼氨基酸包含氨氧基、羥胺基、酰胼基或氨基脲基。
36.根據權利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，是通過使包含含炔氨基酸的fEPO 多肽與包含疊氮部分的聚(乙二醇)分子反應而制成。
37.根據權利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，是通過使包含含疊氮基氨基酸的 fEPO多肽與包含炔部分的聚(乙二醇)分子反應而制成。
38.根據權利要求36或37所述的fEPO多肽，其特征在于，所述疊氮基或炔基是經由酰胺鍵與所述聚(乙二醇)分子連接。
39.根據權利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分子是分支或多臂聚合物。
40.根據權利要求39所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分支聚合物各分支的分子量介于5kDa與30kDa之間。
41.根據權利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述多肽是促紅細胞生成素拮抗劑。
42.根據權利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸在SEQID NO :2中選自由以下組成的群組的位置進行取代殘基包括但不限于VII、R14、Y15、D96、 K97、S100、R103、S104、T107、L108 和 R110,以及其組合。
43.根據權利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。
44.根據權利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
45.根據權利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，連接到水溶性聚合物的所述非天然編碼氨基酸是存在于所述fEPO多肽的位點II區內。
46.根據權利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，連接到水溶性聚合物的所述非天然編碼氨基酸通過防止所述fEPO拮抗劑結合于第二個fEPO受體，來防止所述fEPO受體二聚化。
47.根據權利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，除亮氨酸外的氨基酸取代SEQID NO 2 中的 L108。
48.根據權利要求47所述的fEPO多肽，其特征在于，精氨酸取代SEQID NO :2中的 L108。
49.根據權利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸包含糖部分。
50.根據權利要求3所述的fEPO多肽，其特征在于，所述水溶性聚合物經由糖部分與所述多肽連接。
51.一種分離的核酸，其特征在于，包含在嚴格條件下與SEQ ID NO 24,SEQ ID NO :25、 SEQ ID NO J6或SEQ ID NO :27雜交的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含至少一個選擇密碼子。
52.根據權利要求51所述的分離的核酸，其特征在于，所述選擇密碼子選自由以下組成的群組琥珀密碼子、赭石密碼子、蛋白石密碼子、獨特密碼子、稀有密碼子和四堿基密碼子。
53.一種制備根據權利要求4所述的fEPO多肽的方法，其特征在于，所述方法包含使包含非天然編碼氨基酸的分離的fEPO多肽與水溶性聚合物接觸，所述水溶性聚合物包含與所述非天然編碼氨基酸反應的部分。
54.根據權利要求53所述的方法，其特征在于，所述水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。
55.根據權利要求53所述的方法，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸殘基包含羰基、 氨氧基、酰胼基、氨基脲基、疊氮基或炔基。
56.根據權利要求55所述的方法，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸殘基包含羰基部分，且所述水溶性聚合物包含氨氧基、羥胺部分、酰胼部分或氨基脲部分。
57.根據權利要求55所述的方法，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸殘基包含炔部分，且所述水溶性聚合物包含疊氮部分。
58.根據權利要求55所述的方法，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸殘基包含疊氮部分，且所述水溶性聚合物包含炔部分。
59.根據權利要求M所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇部分的平均分子量介于約IkDa與約IOOkDa之間。
60.根據權利要求58所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇部分為分支或多臂聚合物。
61.一種組合物，其特征在于，包含根據權利要求1所述的fEPO多肽和醫藥學上可接受的載劑。
62.根據權利要求61所述的組合物，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。
63.一種治療所患病癥受fEPO調節的患者的方法，其特征在于，包含對所述患者投予治療有效量的根據權利要求61所述的醫藥組合物。
64.一種細胞，其特征在于，包含根據權利要求51所述的核酸。
65.根據權利要求64所述的細胞，其特征在于，所述細胞包含正交tRNA合成酶和正交 tRNAo
66.一種制備包含非天然編碼氨基酸的fEPO多肽的方法，其特征在于，所述方法包含， 在允許表達所述包含非天然編碼氨基酸的fEPO多肽的條件下，培養包含一個或一個以上編碼fEPO多肽且包含選擇密碼子的多聚核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的細胞；以及從所述細胞中純化所述fEPO多肽。
67.一種增加fEPO的血清半衰期或循環時間的方法，其特征在于，所述方法包含用非天然編碼氨基酸取代天然存在fEPO中的任一個或多個氨基酸。
68.一種 fEPO 多肽，其特征在于，由具有 SEQ ID NO 24 ；SEQ ID NO 25 ；SEQ ID NO 26 或SEQ ID NO :27中所示序列的多聚核苷酸編碼，在所述fEPO多肽中，至少一個氨基酸經非天然編碼氨基酸取代。
69.根據權利要求68所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸與水溶性聚合物連接。
70.根據權利要求68所述的fEPO多肽，其特征在于，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
71.根據權利要求68所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸在SEQID NO 3中選自由以下組成的群組的位置進行取代殘基1、2、3、4、5、6、8、9、17、21、24、25、26、 27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、45、47、50、51、52、53、54、55、56、57、58、68、 72、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、107、110、111、113、114、115、 116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、 136、154、157、158、159、160、162、163、164、165 和 166。
72.根據權利要求68所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然編碼氨基酸包含羰基、 氨氧基、酰胼基、胼基、氨基脲基、疊氮基或炔基。
73.根據權利要求70所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)部分的分子量介于約IkDa與約IOOkDa之間。
74.根據權利要求70所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)部分的分子量介于5kDa與40kDa之間。
75.根據權利要求70所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚乙二醇部分為分支或多臂聚合物。
76.一種醫藥組合物，其特征在于，包含根據權利要求68所述的fEPO多肽和醫藥學上可接受的載劑。
77.一種非人促紅細胞生成素多肽，其特征在于，具有選自由SEQ ID NO 30 ；SEQ ID N0:31 ；SEQ ID NO 32和SEQ ID NO :33組成的群組的氨基酸序列，其中所述非人促紅細胞生成素多肽包含非天然編碼氨基酸取代或添加。
全文摘要
本發明提供經修飾的動物促紅細胞生成素多肽和其用途。
文檔編號C07K14/505GK102232085SQ200980147248
公開日2011年11月2日 申請日期2009年9月25日 優先權日2008年9月26日
發明者凱爾·阿特金森, 安娜-瑪莉亞·A.·海斯蒲楠, 彼德·C.·康寧, 德林·李, 斯蒂芬妮·周, 法蘭克·宋, 理查·S.·巴奈特, 田鋒, 約瑟夫·謝菲爾, 馬克·斯拉迪塔 申請人:Ambrx公司, 美國禮來公司