專利名稱：針對腫瘤壞死因子-α的單結構域抗體及其用途的制作方法
技術領域：
本發明提供了多肽，其含有針對腫瘤壞死因子α (TNF-α)的一個或多個單結構域抗體。本發明還涉及它們用于診斷和治療的用途。這些抗體可以具有與人框架序列高度同源的框架序列。描述了僅含有腫瘤壞死因子a (TNF-a)抗體或者其與其他藥物聯合的組合物。
背景技術：
認為腫瘤壞死因子a (TNF-a)在各種疾病，例如，在炎性疾病如類風濕性關節炎、局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎和多發性硬化中起重要作用。已經很詳細地研究了 TNF-a 和受體(⑶120a，⑶120b)。生物活性形式的TNF-α是三聚體并且通過鄰近亞單位形成的溝對于細胞因子-受體相互作用是重要的。已經開發了拮抗細胞因子的作用的一些策略并且這些策略當前被用于治療各種疾病狀態。對TNF- a具有足夠特異性和選擇性的TNF- a抑制劑可以是有效的預防或治療性藥物化合物，其用于預防或治療某些疾病，其中TNF-a被暗示作為病因。已經描述了通過針對TNF-a的抗體治療毒性休克(EP 486526)、腫瘤退化、細胞毒性抑制(US 6448380，US 6451983，US 6498237)、自身免疫疾病如 RA 和局限性回腸炎(EP 663836，US 5672347，US 5656272)、移植排斥宿主反應(US 5672347)、細菌性腦膜炎(EP 585705)的方法。然而當前可利用的藥物沒有一種可以完全有效治療自身免疫病，并且多數受到嚴重毒性的限制。此外，開發對這種靶序列具有足夠潛能和選擇性的新的化學實體(NCE)是極端困難和漫長的過程。另一方面基于抗體的治療劑具有作為藥物的重要潛力，因為對它們的靶標具有異常的特異性和低的內在毒性。此外，當與開發新的化學實體(NCE)相比時， 開發時間可以顯著縮短。然而，當配體的受體-結合結構域嵌入在溝中時(TNF-a就是這樣)，難以針對多聚體蛋白產生常規抗體。本發明中描述的重鏈抗體來自駱駝科，公知該這些抗體具有腔結合傾向(W0 97/49805 ;Lauwereys等人EMBO J. 17，5312，1998))。因此，這種重鏈抗體內在地適于結合諸如TNF的配體的受體結合結構域。此外，公知這種抗體長期保持穩定，因此，增加了它們的保存期限(Perez等人，Biochemistry,40, 74, 2001)。此外， 使用與哺乳動物細胞培養發酵相比廉價的表達系統，如酵母或其他微生物在發酵罐中“一起”產生這種重鏈抗體片段(EP 0698097)。使用來自諸如小鼠、綿羊、山羊、兔等等來源的抗體和其人源化衍生物治療需要調節炎癥的病癥由于幾個原因存在問題，。常規抗體在室溫下不穩定，并且必須冷凍制備和保存，需要必要的冷凍實驗室設備、保存和運輸，這消耗了時間和費用。冷凍有時在發展中國家中是不可行的。此外，所述抗體的生產或者小規模產生是昂貴的，因為表達完整和由活性的抗體所需的哺乳動物細胞系統需要時間和設備的高水平支持，并且產率非常低。此外，常規抗體的大尺寸將限制，例如，發炎組織部位的組織滲透。此外，常規抗體的結合活性依賴于PH，并因此不適于用于通常生理pH范圍之外的環境中諸如，例如，治療胃出血、胃手術。而且，常規抗體在低或高pH下不穩定并因此不適于經口施用。然而，已經闡明駱駝科抗體抗嚴酷的條件，如極端pH、變性試劑和高溫(Dumoulin等人,Protein Sciencell, 500, 2002)，因此使得它們適于通過經口施用遞送。此外，常規抗體具有結合活性，其取決于溫度，因此不適于用于在生物活性溫度范圍(例如，37±20°C)之外的溫度下實施的測定或試劑盒。多肽治療劑，尤其基于抗體的治療劑具有作為藥物的重要潛力，因為它們具有對它們的靶標的異常特異性和低的內在毒性。然而，技術人員公知已得到的針對治療上有用的靶標的抗體需要額外的修飾以準備將其用于人的治療，從而避免當施用于人時在人個體中發生的不想要的免疫學反應。該修飾過程通常被稱為“人源化”。技術人員公知在不同于人的物種產生的抗體需要人源化以便使得該抗體可用于人的抗體治療((I)CDR嫁接Protein Design Labs US 6180370，US 5693761 ；Genentech US6054297 ；Celltech 460167，EP 626390，US 5859205 ； (2)貼面(veneering) :Xoma :US 5869619，US 5766886， US 5821123)。需要一種產生抗體的方法，該方法避免了對實質人源化的需要，或者完全不需要人源化。需要一類新的抗體，這些抗體具有明確的框架區或者氨基酸殘基并且可被施用于人受試者而不需要實質人源化，或者根本不需要人源化。常規抗體的另一個重要的缺陷是它們是復雜的大分子并且因此相對不穩定，并且它們對蛋白酶降解敏感。這意味著常規抗體藥物不能經口、舌下、局部、鼻、陰道、直腸或者吸入施用，因為它們不能抵抗這些部位的低pH、這些部位和血液中蛋白酶的作用和/或因為它們的大尺寸。它們必須通過注射(靜脈內、皮下，等)施用以克服這些問題的若干問題。 通過注射施用需要專家訓練以便正確和安全地使用皮下注射器或針。還需要無菌設備、治療性多肽的液體制劑、所述多肽無菌和穩定形式的小瓶包裝，和對于受試者，需要針進入的適合部位。此外，在接受注射前和注射時受試者通常經歷生理和心理上的壓力。因此，需要一種遞送治療多肽的方法，該方法避免了對注射的需要，該方法不僅節省費用/時間，而且對受試者更方便和更舒適。基于單結構域的抗體治療具有作為藥物的重要潛力，因為它們具有對它們的靶標的異常特異性和低的內在毒性。然而，進一步提高它們的內在和功能親合力導致對患者的許多益處，如更小的治療劑量、更快的治療，和更小的副作用。發明目的本發明的目的是提供包含結合TNF-α的一個或多個單結構域抗體的多肽、所述多肽的同系物、所述多肽的同系物的功能部分。所述多肽結合TNF-a時改變TNF-a的生物學活性。所述多肽可以結合到TNF-a的受體-結合溝，或者可以不結合到受體結合溝中。 這種多肽是單結構域抗體。本發明的另一個目的是提供單結構域抗體，其可以是本領域中任一種單結構域抗體或者任一將來的單結構域抗體。實例包括，但不限于，重鏈抗體、天然沒有輕鏈的抗體、從常規4-鏈抗體衍生的單結構域抗體、工程化抗體和單結構域支架，其不同于從抗體衍生的那些支架。根據本發明的一個方面，如此處所用的單結構域抗體是天然存在的單結構域抗體，其已知為缺少輕鏈的重鏈抗體(W0 9404678)。為了闡明，從缺少輕鏈的重鏈抗體衍生的該可變結構域被稱為VHH或者nanobody以將其與四鏈免疫球蛋白的常規VH區別。這種 VHH分子可以來自在駱駝科(Camelidae)物種，例如在駱駝、美洲駝、單峰駱駝、羊駝和馱馬中產生的抗體。本發明的另一目的是提供靜脈內、皮下、經口、舌下、局部、經鼻、陰道、直腸或通過吸入施用抗-TNF-α多肽的方法。本發明的另一目的是增強單價單結構域抗體的結合親合力。發明概述本發明的一個實施方案是含有至少一種抗-TNF-a單結構域抗體的抗TNF-a多肽。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽，其中單結構域抗體相應于 SEQ ID NOs 1到16和79到84任一個代表的序列。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽，其還含有針對血清蛋白至少一種單結構域抗體。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽，其中所述血清蛋白是血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結合蛋白、運鐵蛋白、或血纖蛋白原之一。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽，其中單結構域抗血清蛋白單結構域抗體相應于SEQ ID NOs 26到29和85到97任一個代表的序列。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽，其相應于SEQID NOs 30到 43之一代表的序列。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽，其還含有選自抗-IFN-Y單結構域抗體、抗-TNF-a受體單結構域抗體和抗-IFN-Y受體單結構域抗體的至少一種單結構域抗體。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽，其中針對TNF-a的單結構域抗體的數目為至少2個。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽，其相應于SEQID NOs 73到 76之一代表的序列。本發明的另一個實施方案是如上所述的抗TNF-a多肽，其中至少一個單結構域抗體是人源化的駱駝科VHH。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽，其中人源化駱駝科VHH相應于SEQ ID NOs 17到19和21到24之一代表的序列。本發明的另一實施方案是組合物，其含有如上描述的抗TNF-a多肽和來自抗-IFN-Y單結構域抗體、抗-TNF-a受體單結構域抗體和抗-IFN-Y受體單結構域抗體的至少一種單結構域抗體，用于同時、分開或順序地施用于受試者。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽，或者如上述的組合物，其中至少一種抗-IFN- Y單結構域抗體相應于SEQ ID NOs 44到72之一代表的序列。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽，或者如上述的組合物，其中所述單結構域抗體是全長單結構域抗體的同源序列、功能部分或者同源序列的功能部分。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽，或者如上述的組合物，其中抗TNF-a多肽是全長抗TNF-a多肽的同源序列、功能部分或者同源序列的功能部分。
本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-α多肽，或者如上述的組合物，其中至少一種單結構域抗體是駱駝科VHH。本發明的另一實施方案是編碼如上述抗TNF-a多肽的核酸。本發明的另一實施方案是鑒定一種試劑的方法，該試劑調節如上描述的抗TNF-a 多肽與腫瘤壞死因子_a的結合，該方法包括步驟(a)將如上描述的抗TNF-a多肽與靶標腫瘤壞死因子- a在存在和不存在候選調節劑時，在允許所述多肽和靶標結合的條件下接觸，和(b)測量步驟(a)的多肽和靶標之間的結合，其中相對于不存在所述候選調節劑時的結合，在所述候選調節劑的存在下結合降低，將所述候選調節劑鑒定為一種試劑，該試劑調節如上描述的抗TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-a的結合。本發明的另一實施方案是鑒定一種試劑的方法，該試劑通過如上描述的抗TNF-a 多肽與腫瘤壞死因子-a的結合調節腫瘤壞死因子-a介導的疾病，該方法包括(a)將如上描述的抗TNF-α多肽與靶標腫瘤壞死因子-a在存在和不存在候選調節劑時，在允許所述多肽和靶標結合的條件下接觸，和(b)測量步驟(a)的多肽和靶標之間的結合，其中相對于不存在所述調節劑時的結合，在所述候選調節劑的存在下結合降低，將所述候選調節劑鑒定為一種試劑，該試劑調節腫瘤壞死因子-α介導的疾病。本發明的另一實施方案是鑒定一種試劑的方法，該試劑通過如上描述的抗TNF-a 多肽與腫瘤壞死因子-a的結合調節腫瘤壞死因子-a與其受體的結合，該方法包括(a) 將如上描述的抗TNF-α多肽與靶標腫瘤壞死因子-a在存在和不存在候選調節劑時，在允許所述多肽和靶標結合的條件下接觸，和(b)測量步驟(a)的多肽和靶標之間的結合，其中相對于不存在所述候選調節劑時，在所述候選調節劑的存在下結合降低，將所述候選調節劑鑒定為一種試劑，該試劑調節腫瘤壞死因子-α與其受體的結合。本發明的另一實施方案是篩選調節腫瘤壞死因子-α介導的疾病的試劑的試劑盒，該試劑盒含有如上描述的抗TNF- α多肽與腫瘤壞死因子-α。本發明的另一實施方案是通過根據上述方法鑒定的一種未知試劑，該試劑調節如上描述的抗TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-a的結合。本發明的另一實施方案是通過根據上述方法鑒定的一種未知試劑，該試劑調節腫瘤壞死因子-a介導的疾病。本發明的另一實施方案是如上描述的一種未知試劑，其中所述疾病是炎癥、類風濕性關節炎、局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸綜合征和多發性硬化的一種或多種。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽、或者如上描述的核酸、或者如上描述的組合物，或者如上描述的試劑，它們用于治療和/或預防和/或減輕與炎癥過程有關的疾病。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽或者如上描述的核酸、或者如上描述的組合物，或者如上描述的試劑的用途，用于制備治療和/或預防和/或減輕與炎癥反應有關的疾病的藥物。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽或者如上描述的組合物，用于治療和/或預防和/或減輕易受TNF- a調節物質調節的疾病，該物質能夠穿過胃環境而該物質不被失活。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽或者如上描述的組合物的用途，用于制備治療，預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病癥狀的藥物，該物質能夠穿過胃環境而該物質不被失活。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-α多肽或者如上描述的組合物，用于治療和/或預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病，該TNF- α調節物質被遞送到陰道和/或直腸道。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽或者如上描述的組合物的用途，用于制備治療、預防和/或減輕易受TNF-a調節物質調節的疾病的癥狀的藥物，該 TNF-a調節物質被遞送到陰道和/或直腸道。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽或者如上描述的組合物，用于治療和/或預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病，該TNF- α調節物質被遞送到鼻、上呼吸道和/或肺。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽或者如上描述的組合物的用途，用于制備治療、預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病癥狀的藥物，該TNF- a 調節物質被遞送到鼻、上呼吸道和/或肺。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽或者如上描述的組合物，用于治療和/或預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病，該TNF- α調節物質被遞送到腸粘膜，其中所述疾病增加了腸粘膜的滲透性。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽或者如上描述的組合物的用途，用于制備治療、預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病癥狀的藥物，該TNF- a 調節物質被遞送到腸粘膜，其中所述疾病增加了腸粘膜的滲透性。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽或者如上描述的組合物，用于治療和/或預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病，該TNF- α調節物質能夠有效穿過舌下的組織。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽或者如上描述的組合物的用途，用于制備治療、預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病癥狀的藥物，該TNF- a 調節物質能夠有效穿過舌下的組織。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽或者如上描述的組合物，用于治療和/或預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病，該TNF- α調節物質能夠有效穿過皮膚。本發明的另一實施方案是如上描述的抗TNF-a多肽或者如上描述的組合物的用途，用于制備治療、預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病癥狀的藥物，該TNF- a 調節物質能夠有效穿過皮膚。本發明的另一實施方案是如上描述的方法、如上描述的試劑盒、如上描述的核酸或試劑、如上描述的核酸或試劑的用途、如上描述的組合物、如上描述的組合物的用途、如上描述的抗-TNF-α多肽、如上描述的抗-TNF-α多肽的用途，其中所述疾病是炎癥、類風濕性關節炎、局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸綜合征、多發性硬化、阿狄森氏病、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、I型糖尿病、附睪炎、腎小球性腎炎、突眼性甲狀腺腫、急性熱病性多神經炎、淋巴瘤性甲狀腺腫、溶血性貧血、系統性紅斑狼瘡、男性不育癥、多發性硬化、 重癥肌無力、天皰瘡、牛皮癬、風濕熱、類風濕性關節炎、肉樣瘤病、硬皮病、斯耶格倫綜合征、脊柱關節病(spondyloarthropathies)、甲狀腺炎,和脈管炎之一。本發明的另一實施方案是組合物，其含有如上描述的核酸或試劑、如上描述的抗-TNF-α多肽、或者如上描述的組合物，和適宜的藥物載體。本發明的另一實施方案是特征為腫瘤壞死因子-α的機能障礙的疾病的診斷方法，該方法包括(a)將樣品與如上描述的抗-TNF-α多肽接觸，(b)檢測所述多肽與所述樣品的結合，和(C)將步驟(b)中所檢測到的結合與標準比較，其中相對于所述樣品的結合中的差異可以診斷特征為腫瘤壞死因子-α的機能障礙的疾病。本發明的另一實施方案是使用如上描述的方法篩選如上引用的疾病的試劑盒。本發明的另一實施方案是篩選如上引用的疾病的試劑盒，該試劑盒含有分離的如上描述的抗-TNF-α多肽。本發明的另一實施方案是如上描述的抗-TNF-a多肽的用途，用于純化所述腫瘤壞死因子-α。本發明的另一實施方案是如上描述的抗-TNF-a多肽的用途，用于抑制腫瘤壞死因子-α和一種或多種腫瘤壞死因子-α受體之間的相互作用。本發明的另一實施方案是產生如上描述的抗-TNF-a多肽的方法，該方法包括步驟(a)得到編碼針對腫瘤壞死因子-α的駱駝科VHH的雙鏈DNA，(b)克隆和表達步驟(b) 中所選的DNA。本發明的另一實施方案是產生如上描述的抗-TNF-α多肽的方法，該方法包括步驟(a)在允許該多肽表達的條件下培養含有能夠編碼如上描述的抗-TNF-α多肽的核酸的宿主細胞，和(b)從培養物回收所產生的多肽。本發明的另一實施方案是如上描述的方法，其中所述宿主細胞是細菌或酵母。本發明的另一實施方案是含有如上描述的抗-TNF-a多肽的試劑盒，該試劑盒用于篩選炎癥、類風濕性關節炎、局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸綜合征或多發性硬化的任一種。附圖和附表簡述圖I如實施例I中描述的抗人TNF VHH的對比。圖2根據實施例I的ELISA中檢驗的抗人TNF- a VHH的稀釋系列。圖3使用根據實施例I的人細胞系KYM在細胞毒性測定中測量的VHH的拮抗作用。圖4野生型VHH#12B和突變體A74S+Y76N+K83R+P84A的體外受體結合測定。圖5野生型VHH#12B和突變體1E+Q5LA74S+Y76N+K83R+P84A的體外受體結合測定。圖6野生型VHH#3E和突變體VHH的ELISA中的結合。圖7野生型VHH#3E和突變體VHH的體外受體結合測定。圖8如實施例3中描述的拮抗性抗小鼠TNF的對比。圖9使用根據實施例3的鼠細胞系L929在細胞毒性測定中測量的抗小鼠TNF VHH 的拮抗作用。

圖10用于產生二價或雙特異VHH的載體pAXll (pUC119主鏈)的EcoRI-HindIII 插入片段。圖IlIMAC純化的單價_(泳道8)、二價_(泳道I)、三價_(泳道2、3、和5)和四價(泳道4、6和7)抗-TNF a VHH的考馬斯染色的PAGE (15% )。圖12通過單價_、二價_、三價和四價VHH在Superdex 75HR上的凝膠過濾分析的
層析圖。圖13抗人TNF VHH的單價-、二價_、三價和四價形式與臨床使用的產品英夫利昔單抗(Remicade)和依那西普(Enbrel)的拮抗特征的比較。圖14針對小鼠TNF α的單價-和二價VHH的拮抗行為。圖15來自實施例4中描述的人IgGl的VHH-Fc-融合物的考馬斯染色的PAGE。圖16在生物測定中確定的與VHH#3E的二價形式相比VHH#3E衍生的VHH-Fc融合物的拮抗效能。圖17參比和胃蛋白酶處理的TNF3E在pH 2. 2、pH 3. 2和pH 4· 2下的ELISA(100% 是在1/100稀釋下測量的信號)。圖18實驗設置表I針對TNF-α的本發明各方面的肽的氨基酸序列。表2用于VHH#12B的誘變的誘變反應、誘變引物和模板的列表。表3用于VHH#3E的誘變的誘變反應、誘變引物和模板的列表。表4人源化和野生型VHH的概況。表5抗小鼠血清清蛋白/抗TNF- α。表6針對人IFN-Y的VHH的氨基酸序列表。表7 針對 TNF-α 的二價(BIV 3E，BIV#m3F)、三價(TRI3E)或四價(TETRA 3E) VHH 的序列。表8本發明的抗小鼠血清清蛋白VHH的氨基酸序列之間的部分同源性。表9本發明的抗-TNF- a VHH間的部分同源性。表10本發明的抗-IFN-YVHH的之間的百分比同源性。表11治療程序表詳述本發明涉及抗腫瘤壞死因子-a (TNF-a)多肽，其含有針對TNF-α的一個或多個單結構域抗體。本發明還涉及能夠編碼所述多肽的核酸。單結構域抗體是這樣的抗體，它們的互補決定區是單結構域多肽的部分。實例包括，但不限于，重鏈抗體、天然沒有輕鏈的抗體、從常規4-鏈抗體衍生的單結構域抗體、工程化抗體和單結構域支架，其不同于從抗體衍生的那些支架。單結構域抗體可以是本領域中任一種單結構域抗體或者任一將來的單結構域抗體。單結構域抗體可以來自任何物種， 包括，但不限于，小鼠、人、駱騎、美洲騎、山羊、兔、牛。根據本發明的一個方面，此處所用的單結構域抗體是稱作無輕鏈的重鏈抗體的天然存在的單結構域抗體。這種單結構域抗體在例如WO 94/04678中描述。為了闡明，從天然缺少輕鏈的重鏈抗體衍生的該可變結構域被稱為VHH或者nanobody，以將其與四鏈免疫球蛋白的常規VH區別。這種VHH分子可以來自在駱駝科物種，例如在駱駝、單峰駱駝、美洲駝、羊駝和馱馬中產生的抗體。除了駱駝科之外的其他物種可以產生天然缺少輕鏈的重鏈抗體；這種VHHs在本發明的范圍內。根據本發明并且技術人員公知的VHHs是從天然缺少輕鏈的免疫球蛋白衍生的重鏈可變結構域，如WO 94/04678中描述的從駱駝科衍生的那些(此后稱作VHH結構域或nanobodies)。VHH分子小于IgG分子約10倍。它們是單一多肽并且非常穩定,抗極端pH和溫度條件。此外，它們抗蛋白酶的作用，而常規抗體卻不能抗蛋白酶作用。此外，VHHs的體外表達產生高產率的、正確折疊的功能VHHs。此外，在Camelids中產生的抗體將識別某些表位，這些表位不同于通過使用抗體文庫在體外產生的抗體或者通過免疫不同于Camel ids 的哺乳動物產生的抗體所識別的表位(W0 9749805)。同樣，抗-TNF-a VHH可以比常規抗體更有效地與TNF-α相互作用，從而更有效地阻斷其與TNF-a受體的相互作用。根據本發明，TNF-a來自任何物種。與本發明相關的物種的實例包括兔、山羊、小鼠、大鼠、奶牛、小牛、駱駝、美洲駝、猴子、驢、豚鼠、豬、雞、綿羊、狗、貓、馬，和優選地人。TNF-Q也是TNF-α的片段，其能夠引起免疫應答。TNF-α也是TNF-α的片段， 其能夠結合針對全長TNF- α產生的單結構域抗體。針對TNF- α的單結構域抗體指單結構域抗體，其能夠以好于10_6M的親合力結合 TNF- α。本發明的一個實施方案是抗-TNF多肽，其中單結構域抗體含有針對TNF-a的駱駝科VHH。針對TNF-a的抗TNF多肽的一個或多個單結構域抗體可以是相同的序列。備選地，它們可以并非全部具有相同的序列。在本發明的范圍內，抗-TNF多肽含有抗-TNF- a 單結構域抗體，這些抗體不都具有相同的序列，但是它們針對相同的靶標、其一種或多種抗原。本發明的另一實施方案是抗-TNF-a多肽，其中單結構域抗體相應于如表I中所示的SEQ ID NOs 1到16和79到84之一代表的序列。所述序列來自駱駝科重鏈抗體 (VHHs)，這些抗體針對TNF- α。本發明還涉及抗-TNF-a多肽，其中所述單結構域抗體是針對TNF-α的VHH，其中 VHH屬于具有類似人序列的類別。該類別的特征在于VHHs在45位攜帶選自甘氨酸、丙氨酸、 纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、 天冬酰胺或谷氨酰胺的一個氨基酸，如，例如，L45，并且在103位的攜帶色氨酸(根據Kabat 編號)。本發明中描述的駱駝科單結構域抗體的新類別(表1，實施例I)由VHH#2B(SEQ ID NO 3)和VHH#12B(SEQ ID No. 14)代表，它們在FR2中含有疏水殘基并且在103位為疏水殘基色氨酸。在WO 03035694 中已描述了由序列 VHH#1A(SEQ ID NO. I), VHH#4B (SEQ ID NO. 12)、VHH#8-29 (SEQ ID NO. 81)、VHH#8-41 (SEQID NO. 82)、VHH#8-42 (SEQ ID NO. 83)和 VHH#8-44(SEQ ID NO. 84)(表1，實施例I)代表的駱駝科單結構域抗體的另一個類似人的類別，并且這些抗體含有通常在人來源或者來自其他物種的常規抗體中發現的疏水FR2殘基，但是通過103位上的帶電精氨酸彌補了親水性的損失，該精氨酸殘基置換了來自雙鏈抗體的VH中存在的保守色氨酸殘基。同樣，屬于這兩類的肽顯示出與人VH框架區的高度氨基酸序列同源性，并且所述肽可以被直接施用于人而不會預期出現不想要的免疫應答， 并且沒有進一步人源化的負擔。本發明還涉及能夠編碼所述多肽的核酸。因此，本發明的一方面允許對需要其的患者直接施用抗-TNF-α多肽，其中單結構域抗體屬于VHH的人源化類別，并且含有由SEQ ID NO :1、3、12、14、81、82、83、和84之一代表的序列。
本發明所用的VHHs的任一種可以是常規類別或者類似人的駱駝科抗體類別。所述抗體可以針對完整TNF-α或者其片段，或者其同源序列的片段。這些多肽包括全長駱駝科抗體，即Fe和VHH結構域，重鏈駱駝科抗體與人Fe結構域的嵌合形式或者VHH自身或者衍生的片段。抗血清清蛋白VHH可以以比常規抗體更有效的方式與血清清蛋白相互作用，公知血清清蛋白是載體蛋白。作為載體蛋白，血清清蛋白的一些表位不能被結合的蛋白、肽和小分子化合物接近。因為公知VHH結合到“不尋常的”或者非常規表位如腔(W0 97/49805) 中，所以這種VHH與循環的清蛋白的親合力可以被增加。本發明還涉及如下發現如此處描述的抗-TNF多肽還含有針對受試者的一種或多種血清蛋白的一個或多個單結構域抗體，與不是所述構建體的部分的抗TNF-a單結構域抗體的半壽期相比，該抗-TNF多肽在所述受試者中循環半壽期令人驚奇地顯著延長。這些多肽的實例在表5中通過SEQ ID NOs 30到43代表。此外，發現所述多肽顯示出單結構域抗體的相同的有利性質，諸如在小鼠中保持完整的高穩定性、極端PH抗性、高溫穩定性和高靶標親合力。本發明的另一實施方案是還含有針對一種或多種血清蛋白的一個或多個單結構域抗體的抗-TFN- α多肽，所述抗-TFN- α多肽含有由SEQ IDNOs 30到43 (表5)任一個代表的序列。本發明的另一實施方案是抗-TFN-α多肽，其中抗血清蛋白單結構域抗體相應于如表5中SEQ ID NOs 26到29和85到97之一代表的序列。血清蛋白可以是受試者血清中發現的任一適宜的蛋白。在本發明的一方面，血清蛋白是血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結合蛋白、運鐵蛋白、或血纖蛋白原。根據所計劃的用途，如有效治療所要求的半壽期和/或靶抗原的區室化，VHH-配偶體可以針對上面的血清蛋白之一。本發明的另一方面是如此處公開的抗-TFN-a多肽，其還含有至少一個多肽，所述多肽選自抗-IFN-Y多肽、抗-TNF-α受體多肽和抗-IFN-Y受體多肽。本發明的一個實施方案是針對IFN-Y的單結構域抗體相應于如表6中所示的SEQ ID NOs 44到72任一個代表的序列。根據本發明的一方面，單結構域抗體針對TNF-α受體。所述單結構域抗體可以是駱駝科VHH。根據本發明的一方面，單結構域抗體是針對IFN-Y受體。所述單結構域可以是駱駝科VHH。本發明的另一方面是治療如此處引用的自身免疫疾病或病癥的方法，該方法包括對患者施用有效量的抗-TNF-α多肽，該多肽還含有選自抗-IFN-Y多肽、抗-TNF-α受體多肽和抗-IFN- Y受體多肽的至少一種多肽，這些多肽如下面描述相互連接。這種多特異性構建體可以比單特異性構建體具有作為炎癥治療化合物的更大的潛能。本發明的一方面是組合物，該組合物含有如此處公開的抗-TNF-a多肽和選自抗-IFN-Y多肽、抗-TNF-α受體多肽和抗-IFN-Y受體多肽的至少一種多肽，用于同時、 分開或順序施用于受試者。
本發明的一方面是治療自身免疫疾病的方法，該方法包括對個體同時、分開或順序地施用有效量的抗-TNF-α多肽和選自抗-IFN-Y多肽、抗_TNF_a受體多肽和抗-IFN- Y受體多肽的至少一種多肽。本發明的另一方面是試劑盒，其含有用于同時、分開或順序施用于受試者的抗-TNF-α多肽和選自抗-IFN-Y多肽、抗-TNF-α受體多肽和抗-IFN-Y受體多肽的至少一種多肽。本發明的一個方面是可以根據本發明使用的試劑盒。本發明的一方面是試劑盒可用于治療此處引用的疾病。同時施用指多肽同時施用于受試者。例如，作為多肽混合物或者包含所述多肽的組合物。實例包括，但不限于靜脈內施用的溶液、片劑、液體、局部霜劑，等等，其中每種制劑都含有目標多肽。分開施用指多肽在同時或者基本上相同的時間被施用于受試者。這些多肽作為單獨的、未混合的制劑存在于試劑盒中。例如，不同的多肽可作為單獨的片劑存在于試劑盒中。通過同時或者一個片劑接一個地吞咽將片劑施用于受試者。順序施用指多肽被順序施用于受試者。多肽作為單獨的、未混合的制劑存在于試劑盒中。制劑之間存在時間間隔。例如，一種多肽可以在另一組分施用后長達336、312、288、 264、240、216、192、168、144、120、96、72、48、24、20、16、12、8、4、2、1、或 O. 5 小時時被施用。在順序施用中，一種多肽可以在另一多肽施用之前和/或之后施用一次，或者任一次數并且以各種劑量施用。順序施用可以與同時或順序施用聯合。下述抗-TNF-α多肽的醫學應用還應用于含有如此處公開的抗_TNF_ α多肽和選自抗-IFN-Y多肽、抗-TNF-α受體多肽和抗-IFN-Y受體多肽的至少一種多肽的組合物， 用于同時、分開或順序施用于如上文中公開的受試者。根據本發明的一方面,抗IFN- Y多肽抗TNF- α單結構域抗體針對IFN- Y。所述單結構域抗體可以是駱駝科VHH。本發明的一個實施方案是針對IFN-Y的單結構域抗體相應于如表6中所示的SEQ ID NOs 44到72之一代表的序列。根據本發明的一方面，抗TNF-a單結構域抗體針對TNF-α受體。所述單結構域抗體可以是駱駝科VHH。根據本發明的一方面，抗IFN- Y受體多肽抗TNF- α單結構域抗體針對IFN- Y受體。所述單結構域抗體可以是駱駝科VHH。本發明的另一實施方案是如此處公開的抗TNF-a多肽，其中針對TNF-α的單結構域抗體的數目是兩個或更多。這種多價抗TNF-a多肽與它們的單價對應物相比具有對靶標的不尋常的高功能親合力、顯示出比預期的抑制性質更高的抑制性質的優點。多價抗-TNF-α多肽的功能親合力比單價親本抗_TNF_ α多肽高幾個數量級。本發明人已經發現這些多價多肽的功能親合力比現有技術中關于二價和多價抗體所報導的親合力高得多。令人驚奇地，本發明的抗-TNF-α多肽直接相互連接(SEQ ID No. 77和78) 或者通過短接頭序列連接，這些多肽顯示出對多價常規四鏈抗體理論上預測的高功能親合力。本發明人已經發現優選用由多結構域和多聚體蛋白組成的抗原，在直接結合測定或者功能測定，例如細胞毒性測定中可以檢測這種顯著增強的功能活性。
本發明的另一實施方案是如此處公開的抗-TNF-α多肽，其中針對TNF α的單結構域抗體的數目為兩個或多個，所述抗-TNF-α多肽含有相應于SEQ ID N0s:73到76任一個所代表的序列。利用本領域中公知的方法或者任何將來的方法可以將單結構域抗體連接起來形成此處公開的任一多肽，該多肽含有一個以上的單結構域抗體。例如，通過化學交聯將氨基酸殘基與Blattler等人，Biochemistry24,1517-1524 ；EP 294703所描述的有機衍生試劑反應可以將這些單結構域抗體融合。備選地，可以在DNA水平上基因融合單結構域抗體， 即，形成多核苷酸構建體，其編碼含有一個或多個抗靶標單結構域抗體和一個或多個抗血清蛋白單結構域抗體的完整多肽構建體。產生二價或多價VHH多肽構建體的方法在PCT專利中請WO 96/34103中公開。連接多個單結構域抗體的一種方法是通過基因途徑將單結構域抗體編碼序列直接連接或者通過肽接頭連接。例如，第一個單結構域抗體的C-末端可以連接到下一個單結構域抗體的N-末端。可以將該連接模式擴展以便連接額外的單結構域抗體以構建和產生三功能構建體、四功能構建體，等等。根據本發明的一個方面，單結構域抗體被直接相互連接，沒有使用接頭。與連接大體積的常規抗體(其中需要接頭序列以保持兩個亞單位中的結合活性)相反，本發明的多肽可以直接連接(SEQ ID No. 77和78)，從而避免了接頭序列的潛在問題，諸如施用于人類受試者時的抗原性、接頭序列的不穩定導致亞單位解離。根據本發明的另一方面，單結構域抗體通過肽接頭序列相互連接。這種接頭序列可以是天然存在的序列或者非天然存在的序列。預期接頭序列在該抗-TNF-α多肽所施用的受試者中是非免疫原性的。接頭序列可以對多價抗-TNF-α多肽提供足夠的柔性，同時可以抗蛋白水解降解。接頭序列的一個非限制性實例是可以衍生自WO 96/34103中描述的 VHHs的鉸鏈區的接頭序列。根據本發明的另一方面，含有兩個以上單結構域抗體的多價單結構域抗體可以直接或者通過接頭序列相互連接。用常規抗體難以產生這種構建體并且由于大體積亞單位的空間位阻，功能性將喪失或者極大地減小，而不是與單價構建體相比用本發明的VHH所看到的功能性顯著增加(對于這種多價VHH構建體的凝膠過濾分析，見圖12)。技術人員根據本領域中公知的方法或者任一種將來的方法可以制備此處公開的多肽構建體。例如，用本領域中公知的方法，如通過免疫駱駝和從駱駝得到雜交瘤，或者利用本領域中公知的分子生物學技術克隆單結構域抗體的文庫并隨后通過噬菌體展示選擇可以得到VHH。根據本發明的一方面，抗-TNF-a多肽可以是全長抗_TNF_ α多肽的同源序列。根據本發明的另一方面，抗-TNF-a多肽可以是全長抗-TNF-α多肽功能部分。根據本發明的另一方面，抗-TNF-a多肽可以是全長抗-TNF-α多肽的同源序列。根據本發明的另一方面，抗-TNF-a多肽可以是全長抗-TNF-a多肽的同源序列的功能部分。根據本發明的一方面，抗-TNF-a多肽可以含有抗-TNF-a多肽的序列。根據本發明的一方面，用于形成抗-TNF-a多肽的單結構域抗體可以是完整單結構域抗體(例如，VHH)或者其同源序列。根據本發明的另一方面，用于形成多肽構建體的單結構域抗體可以是完整單結構域抗體的功能部分。根據本發明的另一方面，用于形成多肽構建體的單結構域抗體可以是完整單結構域抗體的同源序列。根據本發明的另一方面，用于形成多肽構建體的單結構域抗體可以是完整單結構域抗體的同源序列的功能部分。如文中所用的，本發明的同源序列可以含有一個或多個氨基酸的加入、缺失或置換，這些加入、缺失或置換不實質性地改變本發明多肽的功能特征。氨基酸缺失或置換的數目優選多達 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69 或 70 個氨基酸。根據本發明的同源序列可以是通過氨基酸的加入、缺失或置換修飾的多肽，所述修飾與未修飾的多肽相比不實質上改變功能特征。根據本發明的同源序列可以是通過氨基酸的加入、缺失或置換修飾的多肽，所述修飾與未修飾的多肽相比不實質上改變功能特征。根據本發明的同源序列可以是存在于其他駱駝科物種如，例如，駱駝、單峰駱駝、 美洲駝、羊駝、馱馬等中的序列。當同源序列指出序列同一性時，其表示一個序列與親本序列具有高度序列同一性 (多于70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%序列同一性)并且優選特征為與親本序列具有相似的性質，即親合力，所述同一性為利用公知的方法計算得到。備選地，同源序列還可以是根據下式從親本序列的任何數目的位置上允許的置換得到的任一氨基酸序列
Ser 被 Ser、Thr、Gly>^P Asn 置換；
Arg 被 Arg、His、Gin、Lys、和 Glu 之一置換；
Leu 被 Leu> lie、Phe> Tyr> Met、和 Val 之一置換；
Pro 被 Pro、Gly、Ala、和 Thr 之一置換；
Thr 被 Thr、Pro、Ser> Ala、Gly、His、和 Gln 之一置換；
Ala 被 Ala、Gly、Thr、和 Pro 之一置換；
Val 被 Val、Met、Tyr> Phe> lie、和 Leu 之一置換；
Gly 被 Gly、Ala、Thr、Pro、和 Ser 之一置換；
Ile 被 lie、Met、Tyr> Phe> Val、和 Leu 之一置換；
Phe 被 Phe> Trp> Met> Tyr> lie、Val、和 Leu 之一置換；
Tyr 被 Tyr> Trp> Met> Phe> lie、Val、和 Leu 之一置換；
His 被 His、Glu、Lys、Gin、Thr、和 Arg 之一置換；
Gln 被 Gin、Glu、Lys、Asn、His、Thr、和 Arg 之一置換；
Asn 被 Asn、Glu、Asp、Gin、和 Ser 之一置換；
Lys 被 Lys、Glu、Gin、His、和 Arg 之一置換；
Asp 被 Asp、Glu、和 Asn 之一置換；
Glu 被 Glu、Asp、Lys、Asn、Gin、His、和 Arg 之一置換；
Met 被 Met、Phe> lie、Val、Leu、和 Tyr 之一置換。
根據本發明的同源核苷酸序列可以指50、100、200、300、400、500、600、800或1000
個核苷酸以上的核苷酸序列，其在嚴格雜交條件(如Sambrook等人，Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory 出版社，New York 中描述的雜交條件)下能夠與能夠編碼親本序列的核苷酸序列的反向互補序列雜交。
如文中所用的，功能部分指單結構域抗體的序列，該序列具有足夠大小從而目標相互作用保持在親合力為1X10_6M或更好。備選地，功能部分含有完整氨基酸序列的部分缺失并且仍然保持結合靶標并與其相互作用所需的結合部位和蛋白質結構域。如文中所用的，功能部分指完整序列的100以下(例如，99%、90*%、80*%、70*%、 60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%，等)，但是含有5個或更多的氨基酸或者15個
或更多核苷酸。本文中所提到的靶標諸如TNF-α、TNF-α受體、血清蛋白(例如血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結合蛋白、運鐵蛋白、血纖蛋白原)和IFN-Y、IFN-Y受體可以是所述靶標的片段。從而靶標也是所述靶標的片段，其能夠引起免疫應答。靶標還是所述靶標的片段，其能夠與針對全長靶標產生的單結構域抗體結合。如本文中所用的片段指序列的100%以下(例如，99%、90%、80%、70%、60%、 50%、40%、30%、20%、10%等)，但是含有 5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25或更多氨基酸。片段足夠長從而目標相互作用保持在親合力為1X10_6M或更好。如本文所用的片段也指一個或多個氨基酸的任選插入、缺失和置換，這些插入、缺失和置換不實質性地改變靶標與針對野生型靶標產生的單結構域抗體結合的能力。氨基酸插入缺失或置換的數目優選多達 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69 或 70個氨基酸。本發明的同源序列可以包括已經被人源化的抗-TNF-a多肽。VHH的新類別的抗體的人源化將使施用時在人類個體中的不需要的免疫反應性的可能性進一步降低。本發明的一個實施方案涉及制備基于美洲駝抗體的修飾的多肽的方法，通過確定抗體可變結構域(VHH)的氨基酸殘基，可以修飾抗體可變結構域而不減小該結構域對抗原的天然親合力，而減小其關于異源物種的免疫原性可以實現該方法；還涉及用于施用于異源物種的在所鑒定的殘基處具有修飾的VHHs的用途，還涉及如此修飾的VHH。更具體地，本發明涉及修飾的VHHs的制備，為了施用于人而修飾該VHHs，還涉及所得VHH自身，和這種“人源化” VHHs在治療人類的疾病的用途。人源化意味著突變，使得當施用于人類患者時免疫原性很小或者不存在。根據本發明，將多肽人源化包括將一個或多個駱駝科氨基酸用在人共有序列中發現的它們的人對應物置換，而該多肽不喪失其典型特征，即，該人源化不顯著影響所得多肽的抗原結合能力。這種方法是技術人員公知的。駱駝科單結構域抗體的人源化需要在單個多肽鏈中導入和誘變有限量的氨基酸。 這與scFv、Fab、(Fab) 2和IgG的人源化相反，scFv、Fab、(Fab) 2和IgG的人源化需要在兩條鏈一輕鏈和重鏈中導入氨基酸，還需要保留兩條鏈的裝配。作為非限制性實例。將在FR2中包含類人殘基的VHH#12B的多肽人源化。人源化需要誘變FRl中I和5位上的殘基，其通過用于所有組成成分克隆的引物導入并且在美洲駝序列中不天然地存在。那些殘基中的誘變不導致結合和/或抑制活性的損失。人源化還需要在FR3中74、76、83、84、93位上殘基的誘變。那些殘基中的誘變不導致結合和/或抑制活性的顯著損失(見圖4)。因此聯合FRl和FR3的突變不影響結合和/或抑制活性 (圖5)。人源化還需要在FR4中108位上的誘變。Q108L的誘變導致在大腸桿菌中生產水平降低。108位在camelid VHH中暴露于溶劑，而在人抗體中，該位置被埋藏在VH-VL界面 (Spinelli，1996 ;Nieba, 1997)。在分離的VHs中，108位暴露于溶劑。導入非極性疏水Leu 而不是極性未帶電的Gln可以對該分子的內在折疊/穩定性具有顯著影響。作為非限制性實例，將VHH#3E中所代表的多肽人源化，VHH#3E中所代表的多肽在 37、44、45和47位上含有camelid標志性殘基，它們具有親水特征。在44和45位通過人疏水殘基置換親水殘基(E44G和R45L)對結合和/或抑制沒有影響。然而，當導入F37V和 F47W時，觀察到結合和/或抑制活性的損失。建模數據證明殘基37對于保持CDR3環構象的完整性從而對于活性的保持是關鍵的(見圖6)(所有編號都根據Kabat)。SEQ ID NO :3和14顯示出與人VH框架區的90%以上的氨基酸序列同源性并且因此所述VHH可以直接施用于患者而不預期從中產生免疫應答，并且沒有額外的人源化負擔。因此，本發明的一方面允許對需要該治療的患者直接施用含有SEQ ID N0:3和14的多肽、其同源序列，或者其同源序列的功能部分。本發明的一個實施方案是人源化VHH的方法，該方法包括單獨或聯合置換下面的
殘基之一FRl 位置 I、5、28 和 30，FR2中44和45位標志氨基酸，FR3 殘基 74、75、76、83、84、93 和 94，和FR4 中 103、104、108 和 111 位；根據Kabat編號方法編號。本發明的一個實施方案是抗-TNF-α多肽，或者能夠編碼所述多肽的核酸，它們用于治療、預防和/或減輕與炎癥過程有關的疾病的癥狀。TNF-a與炎癥過程有關，并且 TNF- α作用的阻斷具有抗炎癥作用，該抗炎癥作用在某些疾病狀態諸如，例如，局限性回腸炎中是非常理想的。我們的實施例闡明了根據本發明的VHHs，它們結合TNF-a并且阻斷其與TNF-α受體的結合。本發明的抗TNF-a多肽可應用于自身免疫病，如阿狄森氏病(腎上腺)、耳朵的自身免疫疾病(耳朵)、眼睛的自身免疫疾病(眼睛)、自身免疫肝炎(肝)、自身免疫腮腺炎 (腮腺)、局限性回腸炎(腸)、1型糖尿病(胰腺)、附睪炎(附睪)、腎小球性腎炎(腎)、 突眼性甲狀腺腫(甲狀腺)、急性熱病性多神經炎(神經細胞)、淋巴瘤性甲狀腺腫(甲狀腺)、溶血性貧血(紅細胞)、系統性紅斑狼瘡(多種組織)、男性不育癥(精液)、多發性硬化(神經細胞)、重癥肌無力(神經肌肉接點)、天皰瘡(主要是皮膚)、牛皮癬(皮膚)、風濕熱(心臟和關節)、類風濕性關節炎(關節襯里)、肉樣瘤病(許多組織和器官)、硬皮病 (皮膚和結締組織)、斯耶格倫綜合征(外分泌腺、及其他組織)、脊柱關節病(中軸骨骼、及其他組織)、甲狀腺炎(甲狀腺)、脈管炎(血管)。括號內是受疾病影響的組織。該自身免疫疾病列表是代表性而非包括的。本發明的抗-TNF-a多肽適用的自身免疫病癥包括，例如，AIDS、特異反應性過敏、支氣管氣喘、濕疹、麻風、精神分裂癥、遺傳性抑郁癥、組織和器官的移植、慢性疲勞綜合征、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、心肌梗死、中風、孤獨癥、癲癇、阿圖斯現象、過敏反應，和酒精和藥癮。上面鑒定的自身免疫病癥中，受影響的組織是主要靶標，在其它情況下，該組織是次要靶標。這些病癥部分或主要是自身免疫綜合征。因此，在治療它們時，可以使用本文公開的相同方法，或者該相同方法的方面，有時與其他方法聯合。本發明的另一實施方案是根據本發明的抗-TNF-α多肽、或者編碼所述多肽的核酸的用途，用于制備治療與炎癥過程有關的疾病的藥物。疾病的實例包括類風濕性關節炎、 局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸綜合征和多發性硬化。通過常規途徑，如靜脈內途徑可以對受試者施用根據本發明的多肽和核酸。然而， 本發明的抗-TNF- α多肽的一個特別的性質是它們穿透諸如組織膜和/或腫瘤的屏障并且局部作用于它們，并且這些多肽足夠穩定而可以抵抗諸如胃中的極端環境。因此，本發明的另一方面涉及抗-TNF-α多肽的遞送。根據本發明的受試者可以是易受治療多肽的治療影響的任何哺乳動物。本發明的抗-TNF-a多肽的經口遞送導致在結腸中受疾病影響的局部部位中提供活性形式的這種分子。這些部位可以高度發炎并且含有產生TNF-a的細胞。本發明的抗-TNF-a多肽結合TNF-a，可以局部中和TNF_a，避免了在全身的分布，從而限制了不利的副作用。遺傳修飾的微生物如乳酸微球菌(Micrococcus Iactis)可以分泌抗體或者其功能部分。這種修飾的微生物可用作載體以在腸內局部產生和遞送抗體或者其功能部分。 通過使用產生抗-TNF-α多肽的株系，可以治療炎性腸綜合征。本發明的另一方面包括使用諸如WO 00/23471中描述的載體通過非侵染性細菌， 如革蘭氏陽性宿主生物，如乳球菌屬物種(Lactococcus spec.)的表面表達或者分泌遞送抗-TNF多肽。本發明的一個實施方案是如本文中公開的抗-TNF-α多肽，其用于治療、預防和/ 或減輕疾病的癥狀，這些疾病易受TNF-α調節物質的調節，該TNF-α調節物質能夠穿過胃環境而不被失活。疾病的實例是導致炎癥的任一疾病，包括，但不限于類風濕性關節炎、局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸綜合征和多發性硬化。如本領域中技術人員公知的，一旦擁有所述多肽構建體，就可以應用配制技術在正確位置(胃中、結腸中，等等)釋放大量多肽。該遞送方法對于治療、預防和/或減輕疾病的癥狀是重要的，其中這些疾病的靶標位于內臟系統中。本發明的一方面是通過對受試者經口施用如本文中公開的抗-TNF-α多肽，治療、預防和/或減輕易受TNF-α調節物質調節的疾病的癥狀，該TNF-α調節物質能夠穿過胃環境而不被失活。本發明的另一個實施方案是如本文中公開的抗-TNF-a多肽的用途，用于制備治療、預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病的癥狀的藥物，該TNF- α調節物質能夠穿過胃環境而不被失活。本發明的一方面是通過對受試者經口施用如本文中公開的抗-TNF-a多肽向內臟系統遞送TNF- α調節物質并且所述物質不被失活的方法。本發明的一方面是通過對受試者經口施用如本文中公開的抗-TNF-a多肽向受試者的血流遞送TNF- α調節物質并且所述物質不被失活的方法。本發明的另一個實施方案是如本文中公開的抗-TNF-a多肽，其用于治療、預防和/或減輕易受TNF-α調節物質調節的疾病的癥狀，該TNF-α調節物質被遞送到陰道和
/或直腸道。疾病的實例是導致炎癥的任一疾病，包括，但不限于，類風濕性關節炎、局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸綜合征和多發性硬化。在非限制性實例中，根據本發明的制劑含有本文中公開的抗-TNF-a多肽，該制劑為凝膠、霜劑、栓劑、膜劑的形式或者為海綿或者陰道環的形式，該制劑隨時間緩慢釋放活性成分(這些制劑在EP 707473,EP 684814,US 5629001中描述)。本發明的一方面是通過將本文中公開的抗-TNF-a多肽經陰道和/或直腸施用于受試者以治療、預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病的癥狀的方法，該TNF- a 調節物質被遞送到陰道和/或直腸道。本發明的另一實施方案是本文中公開的抗-TNF-a多肽的用途，用于制備治療、 預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病的癥狀的藥物，該TNF- α調節物質被遞送到陰道和/或直腸道。本發明的一方面是通過將本文中公開的抗-TNF-a多肽經陰道和/或直腸道施用于受試者以將TNF- α調節物質遞送到陰道和/或直腸道并且所述物質不被失活的方法。本發明的一方面是通過將本文中公開的抗-TNF-a多肽經陰道和/或直腸道施用于受試者以將TNF-a調節物質遞送所述受試者的血流并且所述物質不被失活的方法。本發明的另一實施方案是本文中公開的抗-TNF-a多肽，其用于治療、預防和/或減輕易受TNF-α調節物質調節的疾病的癥狀，該TNF-α調節物質被遞送到鼻、上呼吸道和 /或肺。疾病的實例是導致炎癥的任一疾病，包括，但不限于，類風濕性關節炎、局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸綜合征和多發性硬化。在非限制性實例中，根據本發明的制劑含有本文中公開的抗-TNF-a多肽，該制劑為鼻噴霧劑(例如，氣溶膠)或者吸入器的形式。因為該多肽構建體小，所以其可以比治療性IgG分子更有效地到達其靶標。本發明的一方面是通過嘴或鼻吸入將本文中公開的抗-TNF-a多肽施用于受試者以治療、預防和/或減輕易受TNF-α調節物質調節的疾病的癥狀，該TNF-α調節物質被遞送到上呼吸道和肺。本發明的另一實施方案是本文中公開的抗-TNF-a多肽的用途，用于制備治療、 預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病的癥狀的藥物，該TNF- α調節物質被遞送到鼻、上呼吸道和/或肺，并且所述多肽未被失活。本發明的一方面是通過將本文中公開的抗-TNF-a多肽施用于受試者的鼻、上呼吸道和/或肺，將TNF-a調節物質遞送到鼻、上呼吸道和肺而不失活的方法。本發明的一方面是通過將本文中公開的抗-TNF-a多肽施用于受試者的鼻、上呼吸道和/或肺，將TNF-a調節物質遞送到受試者的血流而不失活的方法。本發明的一個實施方案是本文中公開的抗-TNF-a多肽，其用于治療、預防和/或減輕易受TNF-α調節物質調節的疾病的癥狀，該TNF-α調節物質被遞送到腸粘膜，其中所述疾病增加腸粘膜的透性。文中公開的抗-TNF-α多肽因為它們的小尺寸，所以可以穿過腸粘膜并更有效地到達患有疾病的受試者的血流，所述疾病導致腸粘膜的透性增加，該疾病為例如，局限性回腸炎。
本發明的一方面是通過對受試者經口施用本文中公開的抗-TNF-α多肽治療、預防和/或減輕疾病的癥狀的方法，所述疾病易受被遞送到腸粘膜的TNF-a調節物質調節， 其中所述疾病增加了腸粘膜的透性。該方法甚至可以被本發明的額外方面一使用主動運輸載體一進一步增強。在本發明的該方面，VHH與載體融合，該載體增強了穿過腸壁進入血流的傳遞。在非限制性實例中，該“載體”是另一 VHH，其融合到治療VHH。利用本領域中公知的方法制備這種融合構建體。該“載體” VHH特異結合到腸壁上的受體，該結合誘導穿過腸壁的主動傳遞。本發明的另一實施方案是使用本文中公開的抗-TNF-a多肽制備用于治療、預防和/或減輕疾病的癥狀的藥物，該疾病易受遞送到腸粘膜的TNF-a調節物質調節，其中所述疾病增加了腸粘膜的通透性。本發明的一方面是通過對受試者經口施用本文中公開的抗-TNF-a多肽將 TNF-a調節物質遞送到腸粘膜而不失活的方法。本發明的一方面是通過對受試者經口施用本發明的抗-TNF-a多肽將TNF_a調節物質遞送到受試者的血流而不失活的方法。該方法甚至可以被本發明的額外方面一使用主動運輸載體一進一步增強。在本發明的該方面，本文中公開的抗-TNF-a多肽與載體融合，該載體增強了穿過腸壁進入血流的傳遞。在非限制性實例中，該“載體”是與所述多肽融合的VHH。利用本領域中公知的方法制備這種融合構建體。該“載體” VHH特異結合到腸壁上的受體，該結合誘導穿過腸壁的主動傳遞。本發明的一個實施方案是本文中公開的抗-TNF-a多肽，其用于治療、預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病的癥狀，該TNF- α調節物質能夠有效穿過舌下的組織。疾病的實例是導致炎癥的任一疾病，包括，但不限于，類風濕性關節炎、局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸綜合征和多發性硬化。本文中公開的所述多肽構建體的制劑， 例如，片劑、噴霧劑、滴劑被置于舌下并通過粘膜吸收到舌下的毛細管網絡中。本發明的一方面是通過將本文中公開的抗-TNF-a多肽舌下施用于受試者，治療、預防和/或減輕易受TNF-α調節物質調節的疾病的癥狀的方法，該TNF-α調節物質能夠有效穿過舌下的組織。本發明的另一個實施方案是本文中公開的抗-TNF-a多肽的用途，用于制備治療、預防和/或減輕易受TNF-α調節物質調節的疾病的癥狀的藥物，該TNF-α調節物質能夠穿過舌下的組織。本發明的一方面是通過將本文中公開的抗-TNF-a多肽舌下施用于受試者將 TNF- α調節物質遞送到舌下的組織而不失活的方法。本發明的一方面是通過將本文中公開的抗-TNF-a多肽經口施用于受試者而將 TNF- α調節物質遞送到受試者的血流而不失活的方法。本發明的另一個實施方案是本文中公開的抗-TNF-a多肽在治療、預防和/或減輕易受TNF-α調節物質調節的疾病的癥狀中的應用，該TNF-α調節物質能夠有效穿過皮膚。疾病的實例是導致炎癥的任一疾病，包括，但不限于，類風濕性關節炎、局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸綜合征和多發性硬化。所述多肽構建體的制劑，例如，霜劑、膜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑被置于皮膚上并穿過皮膚。本發明的一方面是通過將本文中公開的抗-TNF-α多肽局部施用于受試者，治療、預防和/或減輕易受TNF-α調節物質調節的疾病的癥狀的方法，該TNF-α調節物質能夠有效穿過皮膚。本發明的另一個實施方案是本文中公開的抗-TNF-a多肽的用途，用于制備治療、預防和/或減輕易受TNF-α調節物質調節的疾病的癥狀的藥物，該TNF-α調節物質能夠有效穿過皮膚。本發明的一方面是通過將本文中公開的抗-TNF-a多肽局部施用于受試者將 TNF-a調節物質遞送到皮膚而不失活的方法。本發明的一方面是通過將本文中公開的抗-TNF-a多肽局部施用于受試者而將 TNF-a調節物質遞送到受試者的血流的方法。在本發明的另一方面，抗-TNF-α多肽還含有載體單結構域抗體(例如，VHH，其作為主動運輸載體將所述抗-TNF- α多肽從肺腔運輸到血液中。還含有載體的抗-TNF- α多肽特異結合粘膜表面(支氣管上皮細胞)上的受體， 導致該多肽從肺腔向血液的主動運輸。該載體單結構域抗體可以融合到多肽構建體。這種融合構建體可以利用本領域中公知的方法制備并且在本文中描述。“載體”單結構域抗體特異結合粘膜表面上的受體，該結合誘導穿過該表面的主動傳遞。本發明的另一方面是確定當經鼻施用時那些單結構域抗體(例如VHHs)被主動運輸到血流中的方法。類似地，可以將首次用于實驗的或者免疫VHH噬菌體文庫經鼻施用， 并且施用后不同的時間點后，可以分離血液或器官以拯救已經被主動運輸到血流中的噬菌體。從肺腔向血流的主動運輸的受體的一個非限制性實例是Fe受體N(FcRn)。本發明的一方面包括通過該方法鑒定的VHH分子。然后這種VHH可以作為載體VHH在經鼻施用時將治療VHH遞送到血流中的相應祀標中。在本發明的一方面中，可以使用本文中公開的抗-TNF-a多肽，以便篩選調節該多肽與TNF-α結合的試劑。當在測量結合或者僅所述多肽置換的測定中鑒定時，試劑將必須進行功能試驗以確定它們是否在體內調節抗原的作用。下面主要關于SEQ ID N0:3給出了篩選測定的實例，然而本文中公開的任一種抗TNF-a多肽都是適宜的。在置換實驗的一個實例中，在漸增濃度的候選調節劑的存在或不存在時，將表達 TNF-a或者其片段的噬菌體或者細胞與例如，SEQ ID NO :3所代表的已經被標記的多肽在結合緩沖液中孵育。為了驗證和校準該測定，可以實施對照競爭反應，該反應使用漸增濃度的所述多肽并且該多肽未被標記。孵育后，充分洗滌細胞，用對于給定標記適宜的方法(例如，閃爍計數、熒光，等)測量結合的標記多肽。候選調節劑存在下結合的所標記的多肽的量下降至少10%表明結合被候選調節劑置換。如果候選調節劑在I μ M或更小的濃度下置換50%被標記的多肽(亞飽和多肽劑量)，那么認為該候選調節劑在本文中描述的該測定或者其他測定中特異結合。備選地，通過表面胞質團共振(SPR)可以監視結合或者結合的置換。表面胞質團共振測定可用作定量方法以測量兩個分子之間的結合，該測量是通過例如來自水相的SEQ ID NO :3代表的多肽與傳感器上膜中固定的TNF-a之間的結合或者結合的喪失導致該被固定的傳感器附近質量的改變實現的。該質量的改變被測量為注射或除去所述多肽或者候選結合劑后相對于時間的共振單位并且使用Biacore生物傳感器(Biacore AB)測量。根據 Salamon 等人(Salamon 等人，1996, Biophys J. 71 :283-294 ;Salamon 等人，2001, Biophys. J. 80 :1557-1567 ；Salamon 等人，1999，Trends Biochem. Sci. 24 :213_219，每一篇都被并入本文作為參考。)描述的方法，可以將TNF-α例如固定在薄膜液體膜中的傳感器芯片(例如，研究級CM5芯片，Biacore AB)上。Sarrio等人闡明SPR可用于檢測配體與固定在芯片上的液體層中的GPCR A(I)腺苷受體的結合(Sarrio等人，2000，Mol. Cell. Biol. 20 5164-5174，被并入本文作為參考)。本領域技術人員使用Sarrio等人報導的條件作為起點可以微調SPR測定中SEQ ID NO 3與TNF-α結合的條件。SPR可以以至少兩種方法測定結合調節劑。首先，SEQ ID NO :3所代表的多肽例如，可以預先結合到被固定的TNF-a，然后注射濃度為O. InM到I μ M的候選調節劑。可以定量所結合的多肽的置換，從而可以檢測調節劑結合。備選地，膜-結合的TNF-α可以與候選調節劑預孵育并用例如，SEQ ID NO :3所代表的多肽刺激。所述多肽和與調節劑預孵育的TNF-a之間的結合親合力與沒有調節劑時所述多肽和TNF-α之間的結合相比的差異將表明在調節劑的存在下所述多肽的結合或置換。在任一測定中，相對于不存在候選調節劑時結合的所述多肽的量，存在候選調節劑時結合的所述多肽的量降低10%或以上表明該候選調節劑抑制TNF-a和所述多肽之間的相互作用。檢測例如SEQ ID NO :3所代表的多肽與TNF-α之間的結合的抑制的另一種方法使用熒光共振能量轉移(FRET)。FRET是一種量子力學現象，如果熒光供體(D)的發射光譜與熒光受體㈧的激發光譜重疊，在相互非常接近的熒光供體⑶和熒光受體㈧(通常相隔<100人)間發生FRET。所試驗的分子，例如，SEQ ID NO :3所代表的多肽和TNF-α被供體和受體熒光團的互補對標記。盡管被TNF-a :多肽相互作用緊密結合，但是當所述多肽和TNF-a不結合時，供體熒光團的激發所發出的熒光將與應答該激發波長所發生的熒光具有不同的波長，從而通過測量每個波長下發射強度就可以定量結合的和未結合的分子。 用于標記TNF-a的供體熒光團是本領域中熟知的。特別感興趣的是A. Victoria GFP的變體，它們已知為Cyan FP (CFP，供體(D))和Yellow FP(YFP，受體(A))。作為實例，可以將 YFP變體與TNF-α制成融合蛋白。用于表達GFP變體為融合物的載體(Clontech)以及熒光團標記的試劑(Molecular Probes)是本領域中公知的。將候選調節劑加入突光-標記的多肽和YFP-TNF-α的混合物將導致能量轉移的抑制，這可以通過例如，相對于沒有候選調節劑的樣品YFP熒光的降低來證明。在使用FRET檢測TNF- α :多肽相互作用的測定中， 相對于沒有候選調節劑的樣品，含有候選調節劑的樣品中受體波長下的熒光發射強度降低 10%或更大，表明該候選調節劑抑制TNF-α :多肽相互作用。此處所用的樣品可以是含有TNF-α的任一生物樣品,諸如臨床樣品(例如，細胞級分、全血、血漿、血清、組織、細胞，等)、來自臨床的樣品、農業樣品、法醫樣品、研究樣品或者其他可能的樣品。臨床樣品可來自人或動物來源。所分析的樣品可以本質上是固體或液體。很明顯當使用固體材料時，首先將它們溶于適宜的溶液中。FRET的一種變通方案是使用熒光淬滅以監視分子相互作用。相互作用對中的一個分子可以被突光團標記，另一個分子被一種分子標記，當該突光團與該標記分子密切接合時淬滅該熒光團的熒光。激發時熒光的改變表明用熒光團淬滅劑配對所標記的分子的關聯的變化。通常，被標記的TNF-α的熒光的增加表明具有淬滅劑的抗-TNF-α多肽已經被置換。對于淬滅測定，相對于沒有候選調節劑的樣品，含有該候選調節劑的樣品中熒光發射強度增加10%或更大表明該候選調節劑抑制TNF-a :抗-TNF-α多肽相互作用。除了表面胞質團共振和FRET方法，還使用熒光偏振測定定量結合。熒光標記的分子的突光偏振值取決于轉動相關時間(rotational correlation time)或者翻轉速度 (tumbling rate)。復合物，諸如通過TNF-α與突光標記的抗-TNF-α多肽結合形成的復合物比未復合的、標記多肽具有更高的偏振值。TNF-α :抗-TNF-a多肽相互作用的候選抑制劑的包含導致相對于沒有候選抑制劑的混合物而言熒光偏振減小(如果候選抑制劑破壞或者抑制TNF-α與所述多肽的相互作用)。熒光偏振非常適于鑒定破壞TNF-a 抗-TNF-a多肽復合物形成的小分子。相對于沒有候選調節劑的樣品中熒光偏振，含有候選調節劑的樣品中熒光偏振減小10%或更多表明該候選調節劑抑制TNF-a :抗-TNF-α多肽相互作用。監視TNF-a :抗_TNF_a多肽相互作用的另一備選方案使用生物傳感器測定法。 在本領域中已經描述的ICS生物傳感器(Australian Membrane Biotechnology Research Institute ；CornelI B,Braach-Maksvytis V,King L,Osman P,Raguse B,Wieczorek L,和 Pace R. “A biosensor that uses ion-channel switches，，Nature 1997,387,580)。在該技術中，TNF-α和抗-TNF-α多肽的結合與懸浮的膜雙層中gramacidin-推動的離子通道的關閉偶聯并從而與生物傳感器的導納(admittance)(類似于impedence)的可測量的變化偶聯。該方法在導納變化的6個數量級內是線性的并且非常適于小分子組合文庫的大規模、高通量篩選。相對于沒有候選調節劑的樣品的導納，含有候選調節劑的樣品中導納的 10%或更大的變化(增加或減小)表明候選調節劑抑制TNF-α和所述多肽的相互作用。重要的是注意到在檢測TNF-α和抗-TNF-a多肽的相互作用的測定中，可能相互作用的調節劑不必一定直接與在生理上與所述多肽相互作用的蛋白質的結構域相互作用。還可能調節劑在從相互作用部位除去的位置相互作用并導致，例如，TNF-a中的構象變化。以該方式作用的調節劑(抑制劑或激動劑)仍然可以作為調節TNF-a與其受體結合的目標試劑。所描述的任一種結合測定法都可用于確定樣品(例如，組織樣品)中試劑的存在， 該試劑結合TNF-a或者影響例如，SEQ ID NO : 3所代表的多肽與TNF-α的結合。為此，在樣品的存在或缺乏時，將TNF-a與所述多肽反應，并且用對所使用的結合測定適宜的方法測量多肽結合。所述多肽的結合減小10%或者以上表明該樣品含有調節所述多肽與TNF-a 結合的試劑。當然，上面的一般化方法可容易地應用于篩選候選調節劑，該候選調節劑改變本發明的任何抗-TNF-α多肽、其同源序列、其功能部分或者其同源序列的功能部分與 TNF-a或者其片段之間的結合。本發明的一個實施方案是通過文中公開的方法鑒定的未知試劑。本發明的一個實施方案是通過文中公開的方法鑒定的未知試劑，該試劑用于治療、預防和/或減輕與炎癥過程有關的疾病的癥狀。本發明的另一個實施方案是通過文中公開的方法鑒定的未知試劑的用途，用于治療、預防和/或減輕與炎癥過程有關的疾病的癥狀。疾病的實例包括類風濕性關節炎、局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸綜合征和多發性硬化。
根據本發明使用的細胞優選選自細菌細胞如，例如，大腸桿菌、酵母細胞如，例如， 釀酒酵母(S. cerevisiae)、畢赤巴斯德酵母(P. pastors)、昆蟲細胞,或哺乳動物細胞。根據本發明使用的細胞可以是任一細胞，依照本發明編碼含有本發明的抗-TNF-α多肽、其同源序列、其功能部分或者其同源序列的功能部分的多肽的核酸序列可被導入該細胞，從而該多肽可以以如文中定義的天然水平或者高于天然水平表達。優選地，在細胞中表達的本發明的多肽顯示出如文中定義的正常的或者接近正常的藥理學。最優選地，在細胞中表達的本發明的多肽包括核苷酸序列，該核苷酸序列能夠編碼表I中給出的氨基酸序列的任一個或者能夠編碼與表I中給出的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列。根據本發明的優選實施方案，細胞選自C0S7-細胞、CHO細胞、LM(TK-)細胞、 NIH-3T3細胞、HEK-293細胞、K-562細胞或者1321N1星形細胞瘤細胞(astrocytoma cell) 以及其他可被轉染的細胞系。通常，“治療有效量”、“治療有效劑量”和“有效量”指實現所希望的一個或多個結果(調節TNF-α結合；治療或防止炎癥)所需的量。本領域技術人員將認識到潛能和因此 “有效量”將隨著用于本發明中調節TNF-a結合的多種化合物而變。本領域技術人員將容易評估該化合物的潛能。如文中所用的，術語“化合物”指本發明的抗-TNF-a多肽、組合物、或者能夠編碼所述多肽的核酸，或者根據文中描述的篩選方法鑒定的試劑或者含有一種或多種衍生氨基酸的所述多肽。“藥學上可接受的”指不是生物學上的材料或者不是不希望的材料，即，該材料可以與該化合物一起施用于個體而不導致任何不希望的生物學效應或不與藥物組合物中所含有的其他組分的任一種以有害的方式相互作用。如本文中公開的抗-TNF-a多肽用于治療或者預防受試者中的病癥并且包括施用藥物有效量的化合物或組合物。本發明的抗-TNF多肽用于治療或預防受試者中與類風濕性關節炎、局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸綜合征和多發性硬化有關的病癥并且包括施用藥物有效量的結合TNF-α的化合物或組合物。本文中公開的抗-TNF-a多肽用于治療或者預防受試者中的病癥并且包括聯合施用藥物有效量的化合物與另一種化合物如，例如，阿司匹林。本發明的抗-TNF多肽可用于治療或預防受試者中與類風濕性關節炎、局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸綜合征和多發性硬化有關的病癥并且包括聯合施用藥物有效量的化合物與另一種化合物如，例如，阿司匹林。本發明不限于施用含有本發明的單一化合物的制劑。在本發明范圍內提供聯合治療，其中對需要該治療的患者施用制劑，該制劑含有一種以上的本發明化合物。TNF-a介導的病癥包括，但不限于類風濕性關節炎、局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸綜合征和多發性硬化。用于本發明的化合物可配制成藥物組合物并且以適于所選施用途徑的各種形式施用于哺乳動物宿主，諸如人類患者或者家畜動物，該施用途徑即經口或腸胃外、通過鼻內或者吸入、靜脈內、肌內、局部或皮下途徑。
利用遞送的基因治療方法也可以施用本發明的化合物。見，例如，美國專利號 5，399，346，該專利被完整并入作為參考。使用遞送的基因治療方法，用本發明化合物的基因轉染的原代細胞還可以另外被組織特異的啟動子轉染以靶定特定器官、組織、移植物、腫瘤，或者細胞。因此，本發明化合物可以與藥學上可接受的載體，諸如惰性稀釋劑或者可同化的可食用載體組合全身施用，如經口施用。它們可以被封閉在硬或軟殼明膠膠囊中，可被壓縮成片劑，或者可以直接摻入患者膳食的食物中。對于經口治療施用，活性化合物可以與一種或多種賦形劑組合并且以可攝取的片劑、口含片劑、錠劑、膠囊劑、酏劑、懸浮劑、糖漿劑、糯米紙囊劑等的形式使用。這種組合物和制劑將含有至少O. I %活性化合物。當然，組合物和制劑的百分數可以改變并且可便利地為給定單位劑型重量的約2到約60%。這種治療上有用的組合物中活性化合物的量為將得到有效劑量水平的量。片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑等等還可以含有下面的結合劑，如黃蓍樹膠、阿拉伯樹膠、玉米淀粉或者明膠；賦形劑如磷酸二鈣；崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等等；潤滑劑如硬脂酸鎂；和甜味劑如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦或者增香劑如歐薄荷、冬青油，或者櫻桃香料。當單位劑型是膠囊劑時，其除了上面類型的物質，還可以含有液態載體，如植物油或者聚乙二醇。可以存在多種其他材料組為包衣或者另外改變固態單位劑型的物理形式。例如，用明膠、蠟、蟲膠或者糖等等可以將片劑、丸劑或者膠囊劑包衣。糖漿劑或者酏劑可以含有活性化合物、作為甜味劑的蔗糖或者果糖、作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、染料和香料如櫻桃或者桔子香料。當然，用制備任一單位劑型中的任一材料都應該是藥學上可接受的并且在用量內實質上無毒。此外，活性化合物可被摻入緩釋制劑和裝置。還可以通過灌注或注射，靜脈內或者腹膜內地施用活性化合物。可以在水中制備活性化合物或者其鹽的溶液，其任選與無毒表面活性劑混合。還可以在甘油、液態聚乙二醇、三醋精，和它們的混合物和油中制備分散劑。在保存和使用的通常條件下，這些制劑含有用于防止微生物生長的防腐劑。適于注射或灌注的藥學劑型可包括含有活性成分的無菌水性溶液或者分散劑或者無菌粉劑，其適于臨時制備無菌注射液或者灌注液或分散劑，任選封裝在脂質體中。在所有情況中，最終劑型在生產和保存條件下必須是無菌的、液態和穩定的。液態載體或賦形劑可以是溶劑或者液態分散介質，其含有，例如，水、乙醇、多元醇 (例如，甘油、丙二醇、液態聚乙二醇，等等)、植物油、無毒甘油酯，和它們的適宜的混合物。 通過例如，形成脂質體，對于分散劑的情況，通過保持所需要的顆粒大小或者通過使用表面活性劑可以保持適當流動性。通過多種抗細菌和抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞，等等可以防止微生物的作用。在許多情況中，優選包括等滲劑，例如，糖、緩沖劑或者氯化鈉。通過在組合物中使用延遲吸收的試劑，例如，單硬脂酸鋁和明膠可以延長可注射組合物的吸收。將適當溶劑中的所需要的量的活性化合物與上面列舉的多種其他成分(如果需要)合并，然后過濾除菌可以制備無菌注射液。對于用于制備無菌注射液的無菌粉劑的情況，優選制備方法是真空干燥和冰凍干燥技術，這些技術產生前面無菌過濾溶液中存在的活性成分加上額外的所希望的成分的粉末。
對于局部施用，本化合物可以以純的形式應用(即，當它們是液體時)。然而，通常希望將它們作為組合物或者制劑，聯合皮膚病學上可接受的載體施用于皮膚，這些載體可以是固體或考液體。可用的固態載體包括細分的固體，如滑石、粘土、微晶纖維素、硅土、礬土，等等。可用的液態載體包括水、羥烷基或二元醇或者水-乙醇/ 二元醇摻合物，其中本化合物可以任選通過無毒表面活性劑的幫助以有效水平溶解或者分散。可以加入佐劑諸如芳香劑或者抗微生物劑以優化給定用途的性質。所得液態組合物可以從吸收墊應用，用于浸潰繃帶或者其他包扎用品，或者使用泵型或者氣溶膠噴霧器噴到受侵襲的區域。增稠劑如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽和酯、脂肪醇、改性纖維素或者改性礦物材料可以與液態載體一起使用以形成可涂抹的膏劑、凝膠劑、軟膏劑、皂劑，等等，以直接應用于使用者的皮膚。可用于將該化合物遞送到皮膚的有用的皮膚病學組合物的實例是本領域中公知的；例如，見Jacquet等人(美國專利號4，608，392)、Geria (美國專利號4，992，478)、Smith 等人(美國專利號4，559，157)和Wortzman(美國專利號4，820，508)。通過比較化合物的體外活性和動物模型中的體內活性可以確定該化合物的有用劑量。將小鼠，和其他動物中的有效劑量外推到人的方法是本領域中公知的；例如，見美國專利號 4，938，949。通常，液態組合物如洗劑中化合物的濃度將為約O. l-25wt- %，優選約 O. 5-10wt-%。半固態或者固態組合物如凝膠劑或者粉劑中的濃度將為約O. l-5wt-%,優選約 O. 5-2. 5wt-%。用于治療所需的化合物，或者其活性鹽或者衍生物的量將不僅隨著所選的具體鹽而且隨著施用途徑、被治療的病癥的性質和患者的年齡和狀況而變，并且將最終由主治醫生或者臨床醫生的判斷決定。而且該化合物的劑量將根據靶細胞、腫瘤、組織、移植物，或者器官而變。所希望的劑量可便利地作為單劑給出或者作為分開的劑量給出，該分開的劑量以適宜的間隔施用，例如，作為每天2、3、4或多個亞劑量。該亞劑量本身還可以被分成例如， 許多離散的松散隔開的施用；諸如吹入器的多次吸入或者通過應用于眼睛的多次滴劑。施用方案可以包括長期的、每日治療。“長期”指至少兩周，優選數周、數月或者數年持續時間。本領域普通技術人員僅使用此處教導中的常規實驗法就可以確定該劑量范圍中必要的修飾。見 Remington' s Pharmaceutical Sciences (Martin,E. W.,第四版)，Mack Publishing Co. , Easton, PA。如果發生任何并發癥,個別醫生還可以調節劑量。本發明提供了試劑，該試劑是TNF- a /TNF- α -受體相互作用的調節劑。候選試劑可以是合成試劑，或者試劑的混合物，或者可以是天然產物(例如，植物提取物或者培養上清液)。根據本發明的候選試劑包括可以合成的小分子、天然提取物、肽、 蛋白質、糖類、脂質等。可以從合成的或天然試劑的大文庫中篩選候選調節劑。當前利用多種方法隨機和定向合成糖、肽、和基于核酸的試劑。可以通過商業途徑從許多公司得到合成試劑文庫，這些公司包括 Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK)、Comgenex (Princeton, NJ)、Brandon Associates(Merrimack, NH)、和 Microsource(New Milford, CT)。 從Aldrich (Milwaukee, WI)可以得到稀有化學物文庫。可以得到并且可以制備組合文庫。備選地，細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然試劑的文庫可以從例如，Pan Laboratories (Bothell, WA)或MycoSearch (NC)得到,或者通過本領域中熟知的方法容易地制備。此外， 通過常規化學、物理和生物化學方法容易修飾天然的和合成產生的文庫和試劑。在多種化學品類別中可以發現有用的試劑。有用的試劑可以是有機試劑，或者小分子試劑。小分子試劑的分子量大于50但是小于約2，500道爾頓，優選小于約750，更優選小于約350道爾頓。代表性類別包括雜環類、肽、糖、類固醇，等等。可以修飾這些試劑以增強效能、穩定性、藥物相容性，等等。試劑的結構鑒定可用于鑒定、產生或者篩選額外試劑。 例如，當鑒定了肽試劑時，可將它們以各種方法修飾以增強它們的穩定性，諸如使用非天然氨基酸，如D-氨基酸，尤其D-丙氨酸，通過功能化氨基或者羧基末端，例如，對于氨基，酰化或者烷基化，對于羧基，酯化或者酰胺化，等等。對于初步篩選，根據本發明的候選試劑的有用濃度為約IOmM到約100 μ M或以上 (即，ImMUOmM、IOOmMUM等)。初步篩選濃度將用作上限，以及9種額外的濃度，其中通過將初步篩選濃度以半對數間隔(例如，對于9種額外的濃度)減小用于二次篩選或者用于產生濃度曲線來確定額外的濃度。高通量篩選試劑盒根據本發明的高通量篩選試劑盒含有實施試劑的檢測所有必要的方法和介質，該試劑在優選I μ M到ImM濃度的多肽存在下通過與TNF- α相互作用調節TNF- a /TNF- α受體相互作用。該試劑盒含有下面的本發明的重組細胞，其含有并表達編碼TNF-α的核苷酸序列，根據本領域技術人員中公知的方法，特別是WO 00/02045中描述的方法，該重組細胞根據試劑盒生長在固體支持體，諸如微量滴定板，更優選地96孔微量滴定板上，備選地，本領域技術人員以純化的形式提供TNF-α，其被固定在例如96孔微量滴定板上。備選地，在試劑盒中提供TNF-a，其被預先固定在例如，96孔微量滴定板上。TNF-α可以是完整TNF-a 或者其片段。濃度為約I μ M到ImM或以止的根據本發明的調節劑被加到限定的孔中，孔中存在適當濃度的抗-TNF-a多肽、其同源序列、其功能序列或者其同源序列的功能部分，所述多肽的所述濃度優選為I μ M到ImM。試劑盒可以含有一種或多種抗-TNF- α多肽(例如，SEQ ID NOs :1到15之一代表的一種或多種多肽或其他抗-TNF-a多肽、其同源序列、其功能序列或者其同源序列的功能部分)。根據文中已經公開的方法實施結合測定并將結果與基線水平比較，基線水平為例如，不存在所加入的調節劑時TNF-α結合抗-TNF-α多肽、其同源序列、其功能部分或者其同源序列的功能部分的水平。與不存在調節劑時活性水平相比，TNF-a-多肽結合(例如) 增加或減少至少2倍、優選5倍，更優選10倍，最優選100倍或以上的孔被選擇用于進一步分析。根據本發明使用的其他試劑盒本發明提供了用于篩選TNF-a /TNF-a受體結合的調節劑的試劑盒，以及用于診斷特征為TNF-a機能障礙的疾病的試劑盒。本發明還提供了用于篩選疾病的調節劑的試劑盒以及它們的診斷試劑盒，所述疾病的特征是與TNF-α有關的一種或多種過程。根據本發明使用的試劑盒可包括分離的TNF- α。備選地，或者額外地，試劑盒可以含有被轉化而表達TNF-α的細胞。在另一實施方案中，根據本發明的試劑盒可以含有編碼TNF-a的多核苷酸。在另一實施方案中，根據本發明的試劑盒可以含有用于擴增TNF-a的特異引物。根據本發明使用的試劑盒可以含有分離的TNF-a多肽、其同源物，或者其功能部分。根據本發明的試劑盒可以含有被轉化而表達所述多肽的細胞。試劑盒可以含有一種以上的多肽。 在另一實施方案中，根據本發明的試劑盒可以含有編碼TNF-α的多核苷酸。在另一實施方案中，根據本發明的試劑盒可以含有用于擴增大分子如，例如，TNF-a的特異引物。根據本發明的所有試劑盒將含有所陳述的物品或者物品的組合和包裝材料。試劑盒將還包括使用說明書。
實施例通過下面的非限制性實施例闡明本發明。實施例I :針對人腫瘤壞死因子a )的駱駝科抗體的實施例I)免疫和文庫構建用人TNF-a免疫美洲駝(Llama glama)。為了免疫，用適宜的動物友好佐劑 (SpecolI,CEDI Diagnostics B. V.)將細胞因子配制成乳劑。通過頸部肌內雙地點注射使用該抗原混合物。動物以每周的間隔接受6次乳劑注射，該乳劑含有IOOyg TNF-α。在免疫期間的不同時間點，從動物收集IOml血樣并制備血清。使用血清樣品在ELISA實驗中用TNF驗證抗原特異的體液免疫應答的誘導(數據未顯示)。最后免疫后5天，收集150ml 血樣。從該樣品分級分離(Lauwereys等人，1998)常規抗體和重鏈抗體(HcAbs)并用于 ELISA中，ELISA揭示HcAbs負責抗原特異的體液免疫應答(數據末顯示)。使用菲可帕克梯度(Amersham Biosciences)從150ml血樣分離作為美洲§它重鏈免疫球蛋白(HcAbs)的遺傳來源的外周血淋巴細胞(PBLs)，得到5 X IO8個PBLs。預期抗體的最大多樣性等于采樣的B-淋巴細胞的數目，該數目為PBLs數目的約10% (5xl07)。美洲騎中重鏈抗體的級分高達B淋巴細胞數目的20%。因此，150ml血樣中HcAbs的最大多樣性被計算為IO7種不同的分子。使用酸性硫氰酸胍提取(Chomczynski和Sacchi, 1987)從這些細胞分離總RNA(約 400 μ g)。利用以前描述的(de Haard等人，1999)用M-MLV逆轉錄酶(Gibco BRL)和寡聚-dT-引物或者六核苷酸隨機引物(Amersham Biosciences)從100 μ g總RNA制備cDNA。 用苯酚/氯仿萃取聯合乙醇沉淀純化cDNA并將其隨后用作模板以特異擴增VHH所有組成成分。使用寡聚dT引發的cDNA作為模板用單簡并框架I(FRl)引物 ABLO13 (5; -GAGGTBCAR CTGCAG GASTCYGG-3' ) (SEQ ID NO :98)導入 PstI 限制位點 (粗體)，聯合EP 01205100. 9中描述的寡聚dT引物擴增VHH所有組成成分。該擴增產生了 1650bp和1300bp的兩個片段，后一片段是從CHl-缺失的HcAb基因得到的產物。較小的PCR產物被凝膠純化并隨后用PstI和BstEII消化。BstEII位點通常在重鏈來源的VHH 編碼DNA片段的FR4中存在。備選地，用依賴鉸鏈的方法使用兩種IgG特異的寡核苷酸引物擴增VHH-所有組成成分。在一次PCR反應中，公知對HcAbs特異的短(5 ' -AACAGTTAAGCTTCCGCTT GCGGCCGC GGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3 ') (SEQ ID NO 99)或長(5 ' -AACAGTTAAGCTTCCGCTT GCGGCCGC TGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT-3' ) (SEQ ID NO :100)鉸鏈引物與 FRl-引物 ABL013 (見上面)聯合。PstI和NotI (粗體下劃線)限制位點分別被導入FRl和鉸鏈引物內以允許克隆。隨后，將DNA片段連接到用PstI-BstEII或PstI-NotI消化的噬菌粒載體pAX004中， 該載體與pHENl (Hoogenboom等人，1991)相同但是編碼分別用于純化和檢測的羧基末端 (His)6-和c-myc-標簽。連接混合物在Microcon濾器(YM_50,Millipore)脫鹽并電穿孔到大腸桿菌TGl細胞以得到含有I. 8 X IO7個克隆的文庫。被轉化的細胞在裝有含有100 μ g/ ml氨芐西林和2%葡萄糖的LB的一個20 X 20cm盤上37°C下過夜生長。用2 X TY培養基從盤子刮除菌落并在20%甘油中-80°C保存。作為質量對照，通過PCR使用基于載體的引物的組合對每種文庫的24個克隆驗證含有插入片段的克隆的百分數。該分析揭示95%的克隆含有編碼VHH的插入片段。通過這 24個克隆的擴增的VHH片段的HinfI指紋分析檢查變異性，從而表明所有克隆實際上是不同的(數據未顯示)。2)選擇拮抗的抗-TNF VHH’ s從兩種文庫制備噬菌體。為了挽救多克隆噬菌體所有組成成分，將文庫在37°C下含有IOOy g/ml氨芐西林和2%葡萄糖的2XTY中生長到對數期(0D600 = O. 5)，并隨后用 M13K07輔助噬菌體在37°C超感染30分鐘。將被感染的細胞以4000rpm離心5分鐘并重懸在含有ΙΟΟμ g/ml氨芐西林和25μ g/ml卡那霉素的2XTY中。通過在37°C和250rpm過夜生長增殖噬菌體。將過夜培養物以4500rpm離心15分鐘并用1/5體積[20%聚乙二醇 6000，I. 5M NaCl]溶液在冰上孵育30分鐘沉淀噬菌體。以4000Xg在4°C離心15分鐘沉淀噬菌體。噬菌體重懸在PBS中后，通過以在微量離心管中以最大速度(15000Xg)離心I 分鐘沉淀細胞碎片。將含有噬菌體顆粒的上清液轉移到新管中并如上描述的再次沉淀噬菌體。噬菌體溶于PBS中并且如上面提到的從剩余的細胞碎片分離。通過感染對數TGl細胞后在選擇培養基上涂平板確定噬菌體的效價。用體外生物素化TNF-α選擇文庫。如Magni等人(Anal Biochem2001, 298, 181-188)所描述的實施生物素化。通過SDS-PAGE分析和用Extravidin-堿性磷酸酶綴合物(Sigma)檢測評估TNF中生物素的摻入。通過修飾蛋白結合固相包被的重組p75受體的能力來評價該修飾蛋白的功能性。通過在鏈霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板(用100 μ I 10 μ g/ml鏈霉抗生物素蛋白，4°C包被16小時)上捕獲生物素化TNF-α (室溫下2小時，每孔10到400ng)選擇VHH。 通過用過量受體-細胞外配體結合結構域或者表達該受體的細胞洗脫得到拮抗的VHH。噬菌體與被捕獲的細胞因子孵育2小時后，洗除非特異噬菌體，而將展示拮抗VHH的特定噬菌體用受體(CD120b或者p75的胞外結構域，10 μ Μ)或者用展示受體的細胞(> IO5個KYM細胞/孔)洗脫30分鐘。高富集，即用受體洗脫的噬菌體數目與用血清清蛋白(50yg/孔) 洗脫的噬菌體數目的比例大于20表明成功地選擇了 TNF-a特異克隆。備選地，不是用受體洗脫，而是應用標準方法，其中低pH導致VHH和/或抗原的變性(O. IM甘氨酸緩沖液，pH 2. 5)。將對數期生長的大腸桿菌細胞用洗脫并被中和的噬菌體感染并鋪在選擇培養基上。 挑選單個克隆并在微量滴定板上生長以在培養上清液中產生VHH。用捕獲在Extravidin包被的平板上的TNF-α實施ELISA篩選揭示約50%陽性克隆。HinfI-指紋分析表明選擇了 13個不同的克隆，這些克隆以50ml規模被生長和誘導。所述克隆的序列在表I中顯示。更詳細地表征了具有不同序列(圖I)的5個克隆，它們的代號為VHH#1A、#2B、 #3E、#3G、#7B和#12B。VHH#3E、#3G、和#7B是單結構域抗體片段，它們在FR2中的45位攜帶典型的親水殘基(精氨酸)并且在47位具有苯丙氨酸向色氨酸的置換，從而在溶解性方面賦予了有利特征。VHH#1A含有疏水FR2殘基，其通常在人來源或者其他物種的雙鏈抗體中發現，但是通過103位上的帶電精氨酸殘基彌補了親水性的損失，該殘基置換了來自雙鏈抗體的VH中存在的保守色氨酸殘基(PCT/EP02/07804)。本發明中描述的人源化駱駝科單結構域抗體的一個新的類別由VHH#2B和VHH#12B代表，其含有FR2中的疏水殘基以及 103位的疏水殘基色氨酸。通過以50ml規模培養表達更大量的抗體片段并通過IMAC使用 TALON樹脂(Clontech)純化。對PBS透析除去洗脫液咪唑后通過0D280確定VHH的量；從每個克隆得到約300 μ g VHH。該材料用于確定ELISA中(生物素化)TNF檢測的靈敏性。為此，將鏈霉抗生物素蛋白(lOyg/ml)包被的微量滴定板用于捕獲生物素化TNF(1 μ g/ml)， 將VHH在O. 2%酪蛋白/PBS中稀釋并在室溫孵育2小時。用抗-MYC mAB9E10 (O. 5 μ g/ml) 和抗小鼠AP綴合物(1000倍稀釋，Sigma)檢測結合的VHH。結果在圖2中顯示。3)用KYM細胞系在細胞毒性測定中確定拮抗作用通過Vandenabeele 和同事(Vandenabeele, P. , Declercq, ff. , Vercammen, D. , Van de Craen, Μ. ,Grooten,J. ,Loetscher, H. ,Brockhaus, Μ. ,Lesslauer, ff. , Fiers, W. (1992) Functional characterization of the human tumor necrosis factor receptor p75in a trasfected rat/moust T cell hybridoma. J. Exp. Med. 176，1015-1024)描述的比色MTT 測定法確定TNF-α誘導的白細胞郁積/細胞毒性。MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2， 5-二苯基四唑溴化物)是一種灰黃色底物，其被活細胞切割而產生暗藍色甲臘產物。該過程需要活性線粒體，甚至剛死亡的細胞也不能切割大量MTT。將KYM細胞(Sekiguchi M, Shiroko Y, Suzuki T, Imada, Miyahara M, Fujii G. (1985), Characterization of a human rhabdomyosarcoma cell strain in tissue culture. Biomed. Pharmacother.39, 372-380.)接種子96孔微量滴定板中并在TNF- α (O. 216ng/ml或者約5pM三聚體)的存在或不存在下培養。除了 TNF，培養期間還包括不同量的抗體(VHH或者英夫利昔單抗)。對于該測定，將MTT加入培養基，其終濃度為500μ g/ml，將平板在37°C孵育以實現線粒體酶對MTT的切割。加入酸性異丙醇(40nM HCl溶于異丙醇中)或者DMSO溶解所形成的甲臘產物，該產物在孔的底部呈現黑色的、似絨毛的晶體。在570nm處測量吸收。MTT測定(圖3)表明VffiWlA(其在103位為精氨酸結合FR2中類似人的疏水殘基)具有中等拮抗效果(IC5tl IOOnM)。在FR2中具有特征型親水殘基的VHH#7B盡管在 ELISA中靈敏檢測細胞因子(曲線為顯示)但是不能防止TNF-α與其配體的結合。相反， 具有親水FR2標志性殘基的VHH#3E和#3G是非常強的拮抗性VHH’s (IC50為20nM)。VHH#3E 和#3G具有高度同源性并且在克隆上相關(Harmsen等人，Mo I. Immunol. 37，579-590)，但是 VHH#3E比VHH#3G更強(圖2)，這可能是由于VHH#3E具有更高的親合力。(嵌合的)單克隆抗體英夫利昔單抗非常有效(IC5tl為80pM)，但是其衍生的Fab片段喪失了該效能的大部分(IC5tl為3nM，為完整mAB的30分之一)。這清楚地表明抗體和細胞因子之間相互作用的親合力效果具有兩個結合位點的mAB通過協作結合更有效地與三聚體TNF分子相互作用。VHH片段是嚴格的單價，因此推測通過遺傳融合VHH基因增加親合力可以增加它們的拮抗效能(見實施例4)。這些實驗表明類似人的VHH的一個新的類別具有真實的結合和功能特征，從而使得它們可用于治療目的。實施例2 :通過定點誘變人源化VHH#12B和VHH#3E1)VHH#3E/VHH#12B和人種系重鏈V-區DP-47之間的同源性VHH#12B和人VH3種系序列(DP-47)的比對揭示了高度同源性· FRl中1、5、28和30位上4個氨基酸的改變· FR3中74、76、83、84和93位上5個氨基酸的改變· FR4中108位上I個氨基酸改變如在下面的序列比對中代表DP-47 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMSffVRQAPGKGLEffVS AISGSGGSTYYVHH# I 2B q VQL q ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF e F e NHffMY ffVRQAPGKGLEffVSTVNTNGLITRYDP-47 ADSVKG RFTISRDN rKtj TLYLQMNSL pa EDTAVYC a K (SEQ ID N° 101)VHH#12B ADSVKG RFTISRDNAK Y TLYLQMNSL Ks EDTAVYYC T K VLPPYSDDSRTNADffGQGT o VTVSS(SEQ ID N° 102 ；因此，與人種系基因DP-47具有高度同源性的TNF- α細胞因子的特異抑制劑是進一步人源化和評價ELISA中誘變對抑制能力的影響的理想候選者。 VHH#3E和人VH3種系(DP-47)的比對揭示與DP-47中疏水殘基相比VHH#3E的FR2
中存在親水氨基酸殘基。DP-47 E VoL χ, ESGGGLVQPGGSLRLSCAASG F TFS SYAMS-----ff v RQAPGK glewvs
AISGSGGSTYYVHH#3E q VQL q ESGGGLVQPGGSLRLSCAASG R TFS DHSGYTYTIG ff F RQAPGX EEEfva RIYffSSGNTYYDP-47 ADSVKG RF T ISRD NS KNT L q MN slra EDTAVYYCA k-------------VHH#3E ADSVKG RF A ISRD IA KNTV D L T. MN nlep EDTAVYYCA A RDGIPTSRSVESYNY WGQGTqVTVSS通過人VH中存在的疏水殘基評價取代親水殘基的效果是重要的，因為camelid VHH序列的大部分含有親水殘基。2)VHH#12B 的誘變通過Chen和Ruffner描述并且被Stratagene (Quickchange定點誘變)商業化的基于非-PCR的定點誘變方法突變VHH#12B。質粒DNA被用作模板，并使用2種誘變引物導入所希望的突變。這兩種引物每一種都與模板質粒DNA的相反鏈互補。在使用PfuDNA聚合酶的聚合酶反應中，在使用有限數目的循環的循環程序期間，每條鏈從引物序列延伸。這導致野生型和突變鏈的混合物。用DpnI消化可以選擇突變的體外合成的DNA鏈，因為僅模板鏈對于消化是敏感的。將DNA沉淀并轉化到大腸桿菌中并通過序列分析分析所希望的突變。所產生的突變VHH’ s和誘變引物在表2中列出。從突變克隆制備質粒并將其轉化到 WK6電感受態細胞。單個菌落被用于在含有2%葡萄糖和100 μ g/ml氨芐西林的LB中過夜培養。該過夜培養物在含有100 μ g/ml氨芐西林的300ml TB培養基中稀釋100倍，并在 37°C孵育直到0D600nm = 2，當加入ImMIPTG和5mM MgSO4 (終濃度)時并將培養物在37°C 再孵育3小時。將培養物在4°C以4，500rpm離心20分鐘。沉淀過夜冰凍或者_20°C I小時。接著，在室溫下解凍沉淀40分鐘，將其重懸在20ml PBS/lmMEDTA/IM NaCl中并在冰上搖動 I小時。通過在4°C以4，500rpm離心20分鐘分離周質級分。將含有VHH的上清液裝入 TALON(ClonTech)并純化到同質。用計算的消光系數確定VHH的產率。所表達的所有突變 VHH’ s與野生型相當。在體外受體結合測定中分析突變體的抑制能力。用PBS中的2 μ g/ml依那西普(Wyeth)在4°C過夜包被微量滴定板。將該板用 PBS-吐溫洗滌5次并用含有I %酪蛋白的PBS在室溫封閉I小時。用PBS-吐溫洗滌微量滴定板5次。將生物素化人TNF- α (80 μ g/ml)與突變的或者野生型VHH#12B的稀釋系列在室溫下預孵育I小時并將混合物在室溫下在微量滴定板的孔中孵育I小時。用PBS-吐溫洗漆板5次。用Extravidin-AP (1/1，000稀釋)和對硝基苯酹磷酸(pNPP)檢測結合的人TNF- α。405nm 30分鐘后測量信號。結果在圖4和5中給出。IC50從66nM(野生型) 到200nM(突變的Q1E+Q5L+A74S+Y76N+K83R+P84A)增加了 3倍。位置T93A突變導致抑制喪失(數據未顯示)。仍然需要人源化的位置是E28、E30和Q108。然而，E28和E30是Hl 正則結構的部分從而是根據Chothia編號系統的CDRl的部分。突變VHHs的氨基酸序列在表4中SEQ ID NOs 17到19中給出。3) VHH#3E 的誘變使用上面描述的基于非PCR的定點誘變方法突變VHH#3E。所得突變的VHH’ s和誘變引物在表3中列出。所有突變VHH的表達與野生型相當。在ELISA中分析純化的突變VHH的結合并且在與上面描述的方法相同的受體結合測定中分析VHH的抑制能力。ELISA的結果在圖6中顯示，受體結合測定的結果在圖7中顯示。突變VHHs的氨基酸序列在表4中SEQ ID NOs 21到24給出。實施例3 :針對小鼠TNF- α的拮抗VHH的分離I)選擇抗小鼠 TNF- a VHH為了在IBD或局限性回腸炎小鼠模型中實施效能研究，選擇小鼠TNF特異的VHH。 因此，如實施例I中描述的用小鼠TNF-α免疫美洲騎。從最后免疫后第4和10天采樣的PBL以及第四天后從淋巴結的活組織檢查提取RNA。將總RNA轉化成隨機引發的或者寡聚-dT引發的cDNA并用作VHH編碼基因節段的擴增模板，該擴增使用Ig來源的引物或者寡聚-dT引物和單一 Ig引物的混合物(見實施例I)。使用Ig引物從第一個PBL’s產生了含有8. 5 X IO7個克隆的文庫的文庫，從第二個PBL樣品產生了 7 X IO6個克隆的文庫，從淋巴結產生了 5. 8X IO8個克隆的文庫。使用寡聚-dT引物和Ig引物的混合物從第一個PBL樣品得到了含有I. 2X IO8個克隆的文庫，從第二個PBL樣品得到了 5. 7X IO7個克隆的文庫， 并且淋巴結來源的文庫含有2X IO8個克隆。根據所用的引物的組合合并文庫并將所得兩個文庫培養以增殖噬菌體，如前面描述的。通過被捕獲在包被的鏈霉抗生物素蛋白上的生物素化小鼠TNF- α實施選擇，結合的噬菌體通過與人受體ρ75競爭而被洗脫，公知ρ75與小鼠TNF-α交叉反應。從用Ig衍生的引物擴增得到的文庫選擇兩種不同的小鼠TNF-a特異VHH(VHH#m3F和VHH#m9E)，而從通過PCR用寡聚-dT引物和Ig-引物構建的文庫得到兩種密切相關的VHH(圖8)。2)用L929細胞系在細胞毒性測定中確定拮抗功效如實施例I中描述的應用相同類型的測定，但是使用鼠細胞系L929。證明VHH#m3F 和(圖9)比另外兩種VHH更有效10倍。實施例4 :通過使用多價駱駝科抗體增加親合力而增強拮抗功效I)針對人和小鼠TNF- a的二價、三價和四價VHH的拮抗功效設計了大腸桿菌生產載體pAXll (圖10)，該載體允許兩步克隆二價或雙特異的 VHH。首先用PstI和BstEII克隆羧基末端VHH，而在第二步中，通過SfiI和NotI插入另一 VHH7SfiI和NotI不在第一個基因片段內切割。該方法避免了通過擴增產生新的位點從而避免了產生PCR錯誤的危險。使用該載體產生了拮抗性抗-人TNF- a VHH#3E的二價衍生物。編碼該二價VHH的質粒載體被用于產生三聚體和四聚體衍生物，這通過用BstEII部分消化該質粒完成，該消化在兩個VHH基因片段中都發生。將線性化載體從凝膠純化，隨后去磷酸化并用作克隆約 350bp的BstEII片段的受體，BstEII片段通過完全消化相同質粒得到。僅將BstEII片段連接后加入載體增強了多聚體VHH編碼基因片段的插入。在大腸桿菌TGl中轉化后，通過 PCR，用M13Rev和M13Fwd引物篩選所得克隆；因為BstEII是不對成切割酶(5nt突出端)， 所以僅得到正確方向的插入片段，這通過僅用PstI消化(350bp)或者用EcoRI和HindIII 雙消化(對于二價(BIV 3E, SEQ ID NO 73)得到 lOOObp，對于三價(TRI 3E, SEQ ID NO 74)得到1350bp，對于四價(TETRA 3E，SEQ ID NO :75)得到1700bp)，數據未顯示)質粒來證實。序列在表7中列出。以50ml規模生長和誘導克隆，制備周質級分并用于使用TALON樹脂實施的IMAC 純化。用考馬斯染色的PAGE分析純化產物揭示了完整多價VHH的良好的生產水平(每升細胞培養物2到IOmg)(見圖11)。通過Superdex 75HR柱上凝膠過濾確定IMAC純化的VHH 的分子外觀并且如所預期的，具有更高親合力的分子更早地從柱子出來(見圖12)。用基于細胞的測定法使用KYM細胞分析拮抗功效。細胞被接種于微量滴定板中并在TNF-a (I. 29ng/ml或者約25pM三聚體)存在或不存在時培養。該測定(圖13)揭示用于該研究中的單價分子具有最弱的拮抗特征。通過它們的IC5tl值所反映的來自嵌合抗體英夫利昔單抗的Fab的IC5tl為2nM，對于VHH#3E，IC50為12nM(也見圖3)。所用分子的親合力對拮抗功效具有顯著的影響，這通過使用二價IgG分子英夫利昔單抗觀察到，該分子比Fab的有效性強40倍(IC5(l50pM)。TNF-α是三聚體分子，其與二聚體受體相互作用并且因此可以預期IgG的親合力允許與該細胞因子上的兩個表位相互結合并形成在前描述的(Santora等人，Anal. Biochem. 299,119-129)大復合物。令人驚奇地，VHH從單體向二聚體的親合力的增加比用英夫利昔單抗所觀察到的具有大得多的顯著效果，因為二聚體的IC50(30pM)比單體的低400倍。增加親合力甚至更導致更好的拮抗行為三聚體VHH的 IC50為20pM，四價形式為6pM。VHH的所有更高親合力形式都比英夫利昔單抗更有效，而四價形式比依那西普更強，其中依那西普由受體p75的胞外結構域與IgG的Fe融合組成，因此其是二價結合模式。用針對小鼠TNF產生的VHH觀察到親合力對拮抗行為的同樣出乎意料的影響(圖 14)。用MTT作為底物和小鼠TNF-a (65pg/ml或者I. 3pM)實施相同類型的細胞毒性測定， 但是使用鼠細胞系L929，該細胞系表達小鼠特異受體。鑒定了三種不同的拮抗(單價)VHH， 它們的代碼為9E和3F，其中前兩種的IC50為25nM，后一種的IC50為2nM (也見實施例3)。 3F轉化成二價形式(BIV#m3F, SEQ ID NO :76)導致IC50增加1000倍(2pM)，從而再一次表明該抗體的增加的親合力導致拮抗特征的出乎意料的改善。2)與VHH-Fc融合的比較VHH#3E針對人TNF，通過PstI和BstEII將VHH#3E克隆到來自pCDNA3的改良載體，從而產生與人IgGl的CHl缺失的Fe部分的遺傳融合。通過測序證實后，將該質粒構建體轉染到骨髓瘤細胞系NSO中。培養所得細胞系并且VHH-Fc融合體被分泌到培養上清液中。用抗-人Fe VHH樹脂純化產物并在考馬斯染色的凝膠上分析(圖15)。在DTT存在下， 觀察到融合體為45kDa蛋白，不存在DTT時，可以觀察到二價分子的分子量為90kDa。該二價產物由兩條鏈通過兩個二硫鍵連接產生，這兩個二硫鍵來自位于鉸鏈區中的半胱氨酸殘基。在生物測定中使用人細胞系KYM試驗了 VHH融合體并且結果比二價VHH功效少5倍， 盡管這兩種分子具有相同的親合力并且它們都來自VHH#3E (圖16)。可能是大體積的Fe尾的空間位阻導致該差異。實施例5 :計算本發明的抗-靶標-單結構域抗體間的同源性使用Bioedit Sequence Alignment Editor計算本發明的抗-祀標單結構域抗體之間的氨基酸序列同源性程度。通過ClustalW. (Thompson, J. D. ,Higgins,D. G.和Gibson, T. J. (1994)CLUSTAL W :通過序列加權、位置特異的缺口罰分和權重矩陣選擇提高漸進性多序列比對的靈敏度.Nucleic Acids Research, 1994年6月提交)比對序列，計算所有序列之間的相同殘基的比例。表8指出了本發明的抗-血清清蛋白VHHs之間的部分同源性。表 9指出了本發明的抗-TNF- a VHH間的部分同源性。表10指出了本發明的抗-IFN- y VHH間的百分數同源性。實施例6 VHH#3E的VHH-CDR3片段的表達使用位于框架4 區(正向CCCCTGGCCCCAGTAGTTATACG) (SEQ ID NO :103)中的正義引物和位于框架3區(反向TGTGCAGCAAGAGACGG) (SEQ ID NO :104)的反義引物擴增 VHH#3E的⑶R3區域。為了克隆ρΑΧΙΟ中的⑶R-3片段，用下面的引物實施第二輪PCR擴增，導入所需的限制位點反向引物Sfil:GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCTGTGCAGCAAGAGACGG(SEQ ID NO :105)正向引物Not I:GTCCTCGCAACTGCGCGGCCGCCCCCTGGCCCCAGTAGTTATACG(SEQ ID NO :106)在50ml反應體積中使用50pmol每種引物實施PCR反應。初次PCR的反應條件為 940C 11分鐘，然后30個循環的94/55/721下30/60/120秒，和7215分鐘。用2. 5mM MgCl2, 200mM dNTP 和 I. 25U AmpliTaq GodDNA 聚合酶(Roche Diagnostics, Brussels, Belgium) 實施所有反應。用Sfil和Notl切割后將PCR產物克隆到ρΑΧΙΟ。
實施例7 :對人TNF α特異的抗體片段的穩定性試驗經口施用的蛋白質受到胃中酸性pH的變性以及胃蛋白酶的分解。我們已選擇了研究VHH#3E對胃蛋白酶的抗性研究條件，假定這些條件模擬胃環境。在大腸桿菌中作為重組蛋白產生了對人TNFa特異一種VHH :VHH#3E，將該蛋白通過IMAC和凝膠過濾層析純化至同質。用280nm處的計算的摩爾消光系數通過分光光度法確定純化后的蛋白質濃度。在分別為 pH 2、pH 3 和 4 的 McIIvaine 緩沖液(J. Biol. Chem. 49，1921，183)中制備 100 微克/ml的稀釋液。然后將這些溶液在37°C孵育15分鐘，之后以l/30w/w比例加入豬胃粘膜胃蛋白。加入該蛋白酶60分鐘后，收集樣品并立即在含有0.1%酪蛋白的pH 7.4的PBS 中稀釋100倍使胃蛋白酶失活。從該樣品制備7份額外的3倍稀釋液以通過ELISA評估功能抗體片段的存在。從收集的等分試樣制備相同稀釋液，之后加入該蛋白酶作為參比。在 ELISA測定中，在包被neutravidin的微量滴定板的孔中捕獲生物素化TNFa。對于胃蛋白酶處理的樣品和參比樣品，制備樣品的類似的連續稀釋液并向孔中加入100微升那些稀釋液。孵育I小時后洗滌微量滴定板。為了檢測VHH與被捕獲的TNFa的結合，使用多克隆兔抗-VHH抗血清(R42)和抗兔IgG堿性磷酸酶綴合物。洗滌后，用對硝基苯酚磷酸使板顯色。在圖17中繪制的數據對暴露于消化條件的所有樣品以及參比樣品顯示出相似的曲線。 這表明VHH#3E在所有選擇的條件下基本上保留其功能活性。實施例8 :小鼠中抗-人TNF a特異VHH的經口施用制備含有抗-人TNF a特異的VHH#3E (100微克/微升，在PBS中稀釋100倍)的抗體溶液。三只小鼠首先被12小時不許引水，然后在后兩個小時內允許自由接近抗體溶液。之后，處死小鼠并解剖它們的胃。立即通過含有I % BSA的500微升PBS沖洗胃以得到胃的內容物。該沖洗的物質被隨后用于制備連續三倍稀釋液，以未稀釋的物質的1/5稀釋開始。將100微升這些樣品轉移到用人TNF a包被的微量滴定板的各個孔中。孵育I小時并充分洗滌后，用多克隆兔抗-VHH抗血清(R42)接著用抗兔堿性磷酸酶綴合物孵育來評估免疫活性物質的存在。用對硝基苯基乙酸使ELISA顯色。10分鐘后所得ELISA信號清楚地表明在這些小鼠的胃沖洗物中存在功能性VHH#3E。通過與標準曲線比較，我們確定對于所試驗的三只小鼠，胃沖洗液中功能性抗體片段的濃度分別為I. 5、12. 6和8. 6微克/ml。實施例9 IBD動物模型中的效能I)慢性結腸炎的動物模型在DSS(葡聚糖硫酸鈉)誘導BALB/c小鼠中慢性結腸炎模型中評估通過各種施用途徑應用的二價VHH構建體的效能。該模型最初由Okayasu等人[Okayasu等人 Gastroenterology 1990 ；98 :694-702]中描述并由 Kojouharoff 等人[G. Kojouharoff 等人 Clin. Exp. Immunol. 1997 ； 107 :353-8]改進。動物從德國的 Charles River Laboratories得到，11周齡,并且保持在動物設施中直到它們的體重達到21到22g。通過四個DSS處理周期在動物中誘導慢性結腸炎。每個周期由DSS處理間隔(7天)組成，其中在飲用水中提供濃度為5% (w/v)的DSS，在恢復間隔(12天)中的飲用水中不存在DSS。 最后的恢復周期從12天延長到21天以提供炎癥狀態，在治療時該炎癥狀態代表慢性而不是急性炎癥。最后恢復間隔之后，小鼠被隨機分配到8只小鼠的組中并開始用VHH-構建體治療。治療間隔為2周。治療間隔后一周處死動物，將腸解剖并實施組織學檢查。實驗設置在圖18中示意性地顯示。
2) VHH治療方案在VHH治療期間，通過胃內或者靜脈內應用100 μ g 二價VHH3F對小鼠(每組8只) 用二價VHH#3F(VHH#m3F-VHH#m3F ；SEQ ID No. 76)每天治療，連續治療 14天。用二價VHH#3F 直腸地每隔一天治療額外的動物組，持續治療14天。在所有治療組中，以緩沖液中的Img/ ml濃度應用二價VHH#3F的100 μ g劑量。陰性對照組在另外相同條件下接受100 μ I PBS。 治療方案在表11中顯不。3)結果處死小鼠后，確定體重并解剖結腸。確定解剖的結腸長度并通過蘇木精-伊紅 (HE)染色(標準條件)評估結腸的組織學。與陰性對照(PBS處理)相比，用二價nanobody 3F治療的組顯示出更長的(prorogued)結腸長度以及更高的組織學得分[G. Kojouharoff 等人，Clin. Exp. Immunol. 1997 ；107 :353-8]，從而表明治療的功效。
權利要求
1.抗-TNF-α多肽，其含有至少兩個抗-TNF-α單結構域抗體。
2.根據權利要求I的抗-TNF-α多肽，其還含有針對血清蛋白的至少一個單結構域抗體。
3.根據權利要求2的抗-TNF-α多肽，其中所述血清蛋白是血清清蛋白，血清免疫球蛋白，甲狀腺素-結合蛋白，運鐵蛋白或者血纖蛋白原的任何一種。
4.根據權利要求2或3的抗-TNF-α多肽，其中針對血清蛋白的至少一個單結構域抗體含有SEQ ID NO :26-29和85-97任一個代表的序列。
5.根據權利要求2-4任一項的抗-TNF-α多肽，其含有SEQID NO 30-43 [MSA+ a TNF α ]任一個代表的序列。
6.根據權利要求1-5任一項的抗-TNF-α多肽，其中至少一個抗-TNF- α單結構域抗體含有(a)SEQ ID NO :1-16和79-84任一個代表的序列；(b)與SEQID NO :1-16和79-84任一個代表的親本序列顯示多于70%序列同一性的同源序列；或(c)(a)或(b)的功能部分，所述功能部分能夠以1χ10_6或更好的親和力結合TNF-α。
7.根據權利要求1-5任一項的抗-TNF-α多肽，其中至少兩個抗-TNF-α單結構域抗體含有(a)SEQ ID NO :1-16和79-84任一個代表的序列；(b)與SEQID NO :1-16和79-84任一個代表的親本序列顯示多于70%序列同一性的同源序列；或(c)(a)或(b)的功能部分，所述功能部分能夠以1χ10_6或更好的親和力結合TNF-α。
8.根據權利要求6或7的抗-TNF-α多肽，其含有SEQ ID NO :73-76 [表7]任一個代表的序列。
9.根據權利要求1-8任一項的抗-TNF-α多肽，其中至少一個單結構域抗體是人源化的駱駝科VHH。
10.根據權利要求9的抗-TNF-α多肽，其中至少一個人源化的駱駝科VHH含有SEQID NO 17-19和21-24任一個代表的序列。
11.根據權利要求1-10任一項的抗-TNF-α多肽，其還含有至少一個單結構域抗體，所述單結構域抗體選自由抗-IFN-Y單結構域抗體、抗-TNF-α受體單結構域抗體和抗-IFN- Y受體單結構域抗體組成的組。
12.根據權利要求11的抗-TNF-α多肽，其中至少一個抗-IFN-Y單結構域抗體含有 SEQ ID NO :44-72任一個代表的序列。
13.—種組合物，其含有根據權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽和藥用載體。
14.核酸，其編碼根據權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽。
15.—種鑒定試劑的方法，所述試劑調節權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-α的結合，該方法包括步驟(a)在存在和不存在候選調節劑時，在允許所述多肽和靶標結合的條件下，將權利要求 1-12任一項的抗-TNF-α多肽與祀標腫瘤壞死因子-α接觸,和(b)測量步驟(a)的多肽和靶標之間的結合，其中相對于不存在所述候選調節劑時的結合，在所述候選調節劑的存在下結合的降低將所述候選調節劑鑒定為一種試劑，該試劑調節權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-α的結合。
16.一種通過權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-α的結合鑒定試劑的方法，所述試劑調節腫瘤壞死因子-α介導的疾病，該方法包括a)在存在和不存在候選調節劑時，在允許所述多肽和靶標結合的條件下，將權利要求 1-12任一項的抗-TNF-α多肽與祀標腫瘤壞死因子-α接觸,和b)測量步驟(a)的多肽和靶標之間的結合，其中相對于不存在所述候選調節劑時的結合，在所述候選調節劑的存在下結合的降低將所述候選調節劑鑒定為一種試劑，該試劑調節腫瘤壞死因子-α介導的疾病。
17.一種通過權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽與腫瘤壞死因子-α的結合鑒定試劑的方法，所述試劑調節腫瘤壞死因子-α與其受體的結合，該方法包括(a)在存在和不存在候選調節劑時，在允許所述多肽和靶標結合的條件下，將權利要求 1-12任一項的抗-TNF-α多肽與祀標腫瘤壞死因子-α接觸,和(b)測量步驟(a)的多肽和靶標之間的結合，其中相對于不存在所述候選調節劑時的結合，在所述候選調節劑的存在下結合的降低將所述候選調節劑鑒定為一種試劑，該試劑調節腫瘤壞死因子-α與其受體的結合。
18.—種篩選調節腫瘤壞死因子-α介導的疾病的試劑的試劑盒，該試劑盒含有權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽，腫瘤壞死因子-α，及其包裝材料和使用說明書。
19.權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽，適合用于治療和/或預防和/或減輕與炎癥過程有關的疾病。
20.根據權利要求14的核酸，適合用于治療和/或預防和/或減輕與炎癥過程有關的疾病。
21.根據權利要求13的組合物，適合用于治療和/或預防和/或減輕與炎癥過程有關的疾病。
22.權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽，或根據權利要求13的組合物，適合用于治療和/或預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病，所述TNF- α調節物質能夠穿過胃環境而該物質不被滅活。
23.權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽，或根據權利要求13的組合物，適合用于治療和/或預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病，所述TNF- α調節物質被遞送到陰道和/或直腸道。
24.權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽，或根據權利要求13的組合物，適合用于治療和/或預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病，所述TNF- α調節物質被遞送到鼻、上呼吸道和/或肺。
25.權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽，或根據權利要求13的組合物，適合用于治療和/或預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病，所述TNF- α調節物質被遞送到腸粘膜，其中所述疾病增加了腸粘膜的通透性。
26.權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽，或根據權利要求13的組合物，適合用于治療和/或預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病，所述TNF- α調節物質能夠有效穿過舌下的組織。
27.權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽，或根據權利要求13的組合物，適合用于治療和/或預防和/或減輕易受TNF- α調節物質調節的疾病，所述TNF- α調節物質能夠有效穿過皮膚。
28.根據權利要求16的方法，根據權利要求18的試劑盒，或根據權利要求19-25任一項的抗-TNF-α多肽、核酸或組合物，其中所述疾病是炎癥、類風濕性關節炎、局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸綜合征、多發性硬化、艾迪生病、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、 I型糖尿病、附睪炎、腎小球腎炎、突眼性甲狀腺腫、急性熱病性多神經炎、淋巴瘤性甲狀腺腫、溶血性貧血、系統性紅斑狼瘡、男性不育癥、多發性硬化、重癥肌無力、天皰瘡、牛皮癬、 風濕熱、類風濕性關節炎、肉樣瘤病、硬皮病、斯耶格倫綜合征、脊柱關節病、甲狀腺炎，和脈管炎的任一種。
29.—種組合物,其含有根據權利要求14的核酸,權利要求1-12任一項的抗-TNF- α 多肽，或根據權利要求13的組合物，和適宜的藥物載體。
30.權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽在制備用于診斷特征為腫瘤壞死因子-α 機能障礙的疾病的試劑盒中的用途，所述診斷包括a)將樣品與權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽接觸，b)檢測所述多肽與所述樣品的結合，和c)將步驟(b)中所檢測到的結合與標準比較，其中相對于所述樣品的結合中的差異診斷特征為腫瘤壞死因子-α的機能障礙的疾病。
31.一種篩選疾病的試劑盒，其中所述疾病是炎癥、類風濕性關節炎、局限性回腸炎、潰瘍性結腸炎、炎性腸綜合征、多發性硬化、艾迪生病、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、I型糖尿病、附睪炎、腎小球腎炎、突眼性甲狀腺腫、急性熱病性多神經炎、淋巴瘤性甲狀腺腫、 溶血性貧血、系統性紅斑狼瘡、男性不育癥、多發性硬化、重癥肌無力、天皰瘡、牛皮癬、風濕熱、類風濕性關節炎、肉樣瘤病、硬皮病、斯耶格倫綜合征、脊柱關節病、甲狀腺炎，和脈管炎的任一種，該試劑盒含有權利要求1-12任一項的分離的抗-TNF- α多肽，其包裝材料及使用說明書。
32.一種產生權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽的方法，該方法包括步驟a)得到編碼針對腫瘤壞死因子-α的駱駝科VHH的DNA，b)克隆和表達步驟(a)中所得到的DNA。
33.一種產生權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽的方法,該方法包括a)在允許表達所述多肽的條件下，培養含有編碼權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽的核酸的宿主細胞，和b)從培養物回收所產生的多肽。
34.根據權利要求33的方法，其中所述宿主細胞是細菌或酵母。
35.權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽，根據權利要求14的核酸，或根據權利要求13的組合物在制備用于治療和/或預防和/或減輕與炎癥反應有關的疾病的藥物中的用途。
36.權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽或根據權利要求13的組合物在制備用于治療、預防和/或減輕易受TNF-α調節物質調節的疾病的癥狀的藥物中的用途，所述 TNF-α調節物質能夠穿過胃環境而該物質不被滅活。
37.權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽或根據權利要求13的組合物在制備用于治療、預防和/或減輕易受TNF-α調節物質調節的疾病的癥狀的藥物中的用途，所述 TNF-α調節物質被遞送到陰道和/或直腸道。
38.權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽或根據權利要求13的組合物在制備用于治療、預防和/或減輕易受TNF-α調節物質調節的疾病的癥狀的藥物中的用途，所述 TNF-α調節物質被遞送到鼻、上呼吸道和/或肺。
39.權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽或根據權利要求13的組合物在制備用于治療、預防和/或減輕易受TNF-α調節物質調節的疾病的癥狀的藥物中的用途，所述 TNF-α調節物質被遞送到腸粘膜，其中所述疾病增加了腸粘膜的通透性。
40.權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽或根據權利要求13的組合物在制備用于治療、預防和/或減輕易受TNF-α調節物質調節的疾病的癥狀的藥物中的用途，所述 TNF-α調節物質能夠有效穿過舌下的組織。
41.權利要求1-12任一項的抗-TNF-α多肽或根據權利要求13的組合物在制備用于治療、預防和/或減輕易受TNF-α調節物質調節的疾病的癥狀的藥物中的用途，所述 TNF-α調節物質能夠有效穿過皮膚。
全文摘要
本發明涉及從針對腫瘤壞死因子-α的單結構域重鏈抗體衍生的多肽。本發明還涉及單結構域抗體，這些抗體為駱駝科VHHs。還涉及施用所述多肽的方法。還涉及篩選調節TNF-α受體的試劑的方案，和從所述篩選得到的試劑。
文檔編號C07K16/42GK102584997SQ20121000744
公開日2012年7月18日 申請日期2003年11月7日 優先權日2002年11月8日
發明者卡倫·西萊恩克, 漢斯·德哈德, 馬克·勞韋里斯 申請人:埃博靈克斯股份有限公司