專利名稱：高純茶黃素復合物的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種高純茶黃素復合物的制備方法。
背景技術：
茶黃素是指紅茶中溶于乙酸乙酯呈橙黃色的物質，由茶多酚(主要是兒茶素類及其衍生物)在多酚氧化酶存在下氧化縮合而來。紅茶中茶黃素的含量約為O. 5% 2.0%， 但茶黃素不僅是紅茶的重要品質成分，而且具有多種與人體健康有關的潛在功效，如抗氧化、抗衰老、抗突變、抗癌防癌、降血糖、降血脂、防治心血管疾病等，在某些功能方面甚至優(yōu)于兒茶素。茶黃素是第一次從茶葉中找到具有確切藥理作用的化合物；經過臨床試驗，驗證了茶黃素具有調節(jié)血脂、預防心血管疾病的功效，而且無毒副作用。紅茶茶黃素類物質的研究與開發(fā)不僅具有重要的理論價值，而且在天然藥物、保健品、化妝品和日化用品等領域具有廣闊的產業(yè)化前景。但是，茶黃素的化學研究不能滿足醫(yī)藥領域研究的要求，如茶黃素的提純難度較大、性質欠穩(wěn)定等限制了藥用研究的深入。所以，到目前為止，茶黃素提制的產業(yè)化工藝技術尚不成熟，表現為產品純度低、成本高、產能低，嚴重阻礙了以茶黃素為原料的天然藥物及功能性食品的研究與開發(fā)。由于紅茶中茶黃素的含量低，依靠紅茶為原料來提制茶黃素成本過高，必須研究如何采用兒茶素為原料，篩選特異多酚氧化酶酶源，利用生物技術酶促氧化合成茶黃素，采用柱色譜制備高純茶黃素，具有重要的理論與實際意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供一種系統、安全、 低成本的高純茶黃素復合物的制備方法。為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案是一種高純茶黃素復合物的制備方法，該方法包括如下步驟A、按Ig綠茶兒茶素混合物加75 IOOml多酚氧化酶粗酶液的比例，將綠茶兒茶素混合物加入多酚氧化酶粗酶液中，通入氧氣，以氣泡不溢出反應容器為宜，攪拌，20 40°C恒溫水浴反應20 40min，立即用等體積的預冷至_18 _20°C的乙酸乙酯萃取，酯層在40 45°C真空濃縮，回收乙酸乙酯，干燥，得茶黃素粗品；B、按Ig茶黃素粗品加10 15ml 20%體積濃度的乙醇水溶液的比例，將上述茶黃素粗品用乙醇水溶液溶解，將溶解液以O. 6 O. 8BV/h的流速通過裝有吸附樹脂的層析柱至吸附飽和，先用2 3BV 20%體積濃度的乙醇水溶液以O. 8 I. OBV/h的流速洗脫，再用 2 3BV 60%體積濃度的丙酮或乙醇水溶液以O. 8 I. OBV/h的流速洗脫，收集60%體積濃度的丙酮或乙醇水溶液洗脫液，將洗脫液在40 45°C真空濃縮，回收丙酮或乙醇，冷凍干燥，得高純茶黃素復合物；上述提及的乙酸乙酯、乙醇和丙酮皆為分析純。上述綠茶兒茶素混合物為EGC和EC含量高的兒茶素混合物或小葉兒茶素混合物。 兒茶素混合物中EGC > 20%，EC > 9%，EGCG > 10% ;小葉兒茶素混合物中EGC > 10%,ECG > 9%, EGCG > 40%。上述多酚氧化酶粗酶液是取于-18 -20°C冷凍的梨果實去皮切碎，然后用預冷至-18 -20°C、pH 5. 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進行勻漿提取多酚氧化酶，過濾離心，上清液即為多酚氧化酶粗酶液；酶液置于O 4°C環(huán)境中待用，提取時，梨果實與磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的比例為Ig I 2ml。上述吸附樹脂為30 60目的聚酰胺粉或NKA大孔吸附樹脂。與現有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明方法工藝簡單、成本低，生產過程中避免使用有毒有害的有機試劑，保護環(huán)境；并且通過控制不同的反應條件可以獲得不同茶黃素組成的高純茶黃素復合物，產品得率高，含量高。


圖I是本發(fā)明實施例I的HPLC圖譜。其中峰I為茶黃素；峰2為茶黃素-3-沒食子酸脂；峰3為茶黃素-3’ -沒食子酸脂；峰4為茶黃素-3，3’ -沒食子酸脂。
具體實施例方式本發(fā)明中用到的儀器設備和參數高效液相色譜儀日本島津公司Shimadzu LC-1OATVP系統控制器，LC-1OATVP 二元泵，SPD-M20A 二極管陣列檢測器以及Shimadzu LC-Solution色譜工作站；色譜分析時的參數色譜柱為0DSC18(4. 6mm i. d. X 150mm，5 μ m)，流動相A為2% 醋酸，流動相B為乙腈-乙酸乙酯(體積比21 3)，梯度洗脫，流動相B在30min內從18% 線性梯度變化到30%，流速O. 9mL/min ;柱溫40°C ;檢測波長280nm ;進樣量10 μ I。旋轉蒸發(fā)儀瑞士步琪公司Buchi R200 ；冷凍干燥機德國Christ公司Gammal_2 ；玻璃層析柱<J>3cmX60cm。采用本發(fā)明所確定的技術參數應用于高純茶黃素復合物的制備研究中。制備多酚氧化酶粗酶液取于-18 -20°C冷凍的梨果實去皮切碎，然后用預冷至-18 -20°C、pH 5. 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進行勻漿提取多酚氧化酶，過濾離心，上清液即為多酚氧化酶粗酶液；酶液置于O 4°C環(huán)境中待用，提取時，梨果實與磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的比例為Ig Iml0實施例I :將4.OOg兒茶素混合物(EGC >20%，EC >9%，EGCG >10%)溶解于400ml 多酚氧化酶粗酶液(該多酚氧化酶粗酶液中加入有100ml pH 5. 5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液) 中，通入氧氣，以氣泡不溢出反應容器為宜，攪拌，恒溫水浴30°C反應30min，立即用與兒茶素混合物溶解液等體積的預冷至-18 -20°C的乙酸乙酯萃取，酯層在40°C真空濃縮，回收乙酸乙酯，干燥得茶黃素粗品I. 70g ;將該茶黃素粗品用20ml 20%體積濃度的乙醇水溶液溶解后，溶解液以O. 6 O. 8BV/h的流速通過裝有聚酰胺粉的層析柱((j5 3CmX60Cm，30 60目，按照柱層析用聚酰胺處理通用方法進行預處理)至吸附飽和，依次用2. 5BV 20%體積濃度的乙醇水溶液和3BV 60%體積濃度的丙酮水溶液洗脫，洗脫液流速為O. 8 I. OBV/h,收集體積濃度60%的丙酮水溶液洗脫液，洗脫液在40°C真空濃縮，回收丙酮，冷凍干燥得I. 12g高純茶黃素復合物，經高效液相色譜檢測，茶黃素總量大于80%，見圖1，其中茶黃素(TF)含量為55. 34%，茶黃素-3-沒食子酸脂(TF-3-G)含量為18. 28%，茶黃素-3’-沒食子酸脂(TF-3，-G)含量為7. 36%，茶黃素_3，3’-沒食子酸脂(TFDG)含量為I. 99%，茶黃素總量為82. 97%，制率為28. 00%。實施例2 將8. OOg 小葉兒茶素混合物(EGC > 10%,ECG> 9%, EGCG > 40% )溶解于 800ml 多酚氧化酶粗酶液中，通入氧氣，以氣泡不溢出反應容器為宜，攪拌，恒溫水浴20°C反應 40min，立即用與兒茶素混合物溶解液等體積的預冷至-18 -20°C的乙酸乙酯萃取，酯層在45°C真空濃縮，回收乙酸乙酯，干燥得茶黃素粗品3. 76g。將該茶黃素粗品用40ml 20% 體積濃度的乙醇水溶液溶解，將溶解液以O. 6 O. 8BV/h的流速通過裝有NKA大孔吸附樹脂的層析柱(Φ3(πιΧ 60cm，按照柱層析用大孔吸附樹脂處理通用方法進行預處理)至吸附飽和，再依次用3BV 20 %體積濃度的乙醇水溶液和2BV 60 %體積濃度的乙醇水溶液洗脫， 洗脫液流速為O. 8 I. OBV/h,收集體積濃度為60%的乙醇水溶液洗脫液，洗脫液在45°C 真空濃縮，回收乙醇，冷凍干燥得2. 44g高純茶黃素復合物，經高效液相色譜檢測，茶黃素總量大于80%，其中茶黃素(TF)含量為16. 13%，茶黃素-3-沒食子酸脂(TF-3-G)含量為 33. 00%，茶黃素-3’ -沒食子酸脂(TF-3’ -G)含量為5. 64%，茶黃素_3，3’ -沒食子酸脂 (TFDG)含量為31.07%,茶黃素總量為85. 84%，制率為30. 50%。實施例3 將8. OOg 兒茶素混合物(EGC > 20%，EC > 9%，EGCG > 10% )溶解于 800ml 多酚氧化酶粗酶液中，通入氧氣，以氣泡不溢出反應容器為宜，攪拌，恒溫水浴40°C反應20min， 立即用與兒茶素混合物溶解液等體積的預冷至-18 -20°C的乙酸乙酯萃取，酯層在42°C 下真空濃縮，回收乙酸乙酯，干燥得茶黃素粗品3. 60g。將該茶黃素粗品用50ml 20%體積濃度的乙醇水溶液溶解，將溶解液以O. 6 O. 8BV/h的流速通過裝有聚酰胺粉的層析柱 (ct3CmX60Cm，30 60目，按照柱層析用聚酰胺處理通用方法進行預處理)至吸附飽和， 依次用2BV體積濃度為20%的乙醇水溶液和2. 5BV體積濃度為60%的丙酮水溶液洗脫，洗脫液流速為O. 8 I. OBV/h，收集體積濃度為60%的丙酮水溶液洗脫液，洗脫液在42°C真空濃縮，冷凍干燥得2. 40g高純茶黃素復合物，經高效液相色譜檢測，茶黃素總量大于80%， 其中茶黃素(TF)含量為48. 89%，茶黃素-3-沒食子酸脂(TF-3-G)含量為17. 56%，茶黃素-3’ -沒食子酸脂(TF-3’ -G)含量為11. 18%，茶黃素_3，3’ -沒食子酸脂(TFDG)含量為3. 59%，茶黃素總量為81. 21%，制率為30. 00%。
權利要求
1.一種高純茶黃素復合物的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟A、按Ig綠茶兒茶素混合物加75 IOOml多酚氧化酶粗酶液的比例，將綠茶兒茶素混合物加入多酚氧化酶粗酶液中，通入氧氣，以氣泡不溢出反應容器為宜，攪拌，20 40°C恒溫水浴反應20 40min,立即用等體積的預冷至-18 -20O的乙酸乙酯萃取,酯層在40 45°C真空濃縮，回收乙酸乙酯，干燥，得茶黃素粗品；B、按Ig茶黃素粗品加10 15ml20%體積濃度的乙醇水溶液的比例，將上述茶黃素粗品用乙醇水溶液溶解，將溶解液以O. 6 O. 8BV/h的流速通過裝有吸附樹脂的層析柱至吸附飽和，先用2 3BV 20%體積濃度的乙醇水溶液以O. 8 I. OBV/h的流速洗脫，再用2 3BV 60%體積濃度的丙酮或乙醇水溶液以O. 8 I. OBV/h的流速洗脫，收集60%體積濃度的丙酮或乙醇水溶液洗脫液，將洗脫液在40 45°C真空濃縮，回收丙酮或乙醇，冷凍干燥， 得高純茶黃素復合物；上述乙酸乙酯、乙醇和丙酮皆為分析純。
2.如權利要求I所述的高純茶黃素復合物的制備方法，其特征在于所述綠茶兒茶素混合物為EGC和EC含量高的兒茶素混合物或小葉兒茶素混合物。
3.如權利要求I所述的高純茶黃素復合物的制備方法，其特征在于所述多酚氧化酶粗酶液是取于-18 _20°C冷凍的梨果實去皮切碎，然后用預冷至-18 -20°C、pH 5. 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進行勻漿提取多酚氧化酶，過濾離心，上清液即為多酚氧化酶粗酶液；酶液置于O 4°C環(huán)境中待用，提取時，梨果實與磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的比例為Ig : I 2ml。
4.如權利要求I所述的高純茶黃素復合物的制備方法，其特征在于所述吸附樹脂為 30 60目的聚酰胺粉或NKA大孔吸附樹脂。
全文摘要
一種高純茶黃素復合物的制備方法，包括先將綠茶兒茶素混合物加入多酚氧化酶粗酶液中進行體外氧化，然后以乙酸乙酯萃取，真空濃縮，干燥得茶黃素粗品；再用20％體積濃度的乙醇水溶液溶解后通過裝有吸附樹脂的層析柱至吸附飽和，先用20％體積濃度的乙醇水溶液洗脫，再用60％體積濃度的丙酮或乙醇水溶液洗脫，將收集的60％體積濃度的丙酮或乙醇水溶液洗脫液真空濃縮，冷凍干燥得高純茶黃素復合物；本發(fā)明方法工藝簡單、成本低，生產過程中避免使用有毒有害的有機試劑，保護環(huán)境；并且通過控制不同的反應條件可以獲得不同茶黃素組成的高純茶黃素復合物，產品得率高，含量高。
文檔編號C07D311/62GK102605016SQ201210007418
公開日2012年7月25日 申請日期2012年1月12日 優(yōu)先權日2012年1月12日
發(fā)明者劉仲華, 劉芳, 王坤波, 黃建安, 龔雨順 申請人:湖南農業(yè)大學