一種基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態吸附解析機制的乳鐵蛋白制備方法
【專利摘要】一種基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態吸附解析機制的乳鐵蛋白制備方法，步驟為：（1）對新鮮牛乳進行殺菌處理；（2）對殺菌后的新鮮牛乳進行脫脂處理，脫脂后即為脫脂乳產品；（3）對脫脂乳進行濃縮；（4）對微濾膜過濾截留液進行透析處理，以除去其它雜蛋白；（5）加入NaCl，間歇攪拌；（6）采用透析的方式將步驟（5）中的乳鐵蛋白進行回收；（7）對透析液進行超濾處理；（8）對超濾膜截留液進行透析處理，得到牛乳蛋白濃縮液；（9）對牛乳蛋白濃縮液進行干燥處理。本發明充分利用牛乳體系中酪蛋白與乳鐵蛋白的動態包裹解析機制，實現乳鐵蛋白最大程度的釋放，使得乳鐵蛋白制備得率與現有技術相比提高15-30%，實現技術的重大突破。
【專利說明】一種基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態吸附解析機制的乳鐵蛋白 制備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種乳鐵蛋白的制備方法，具體涉及一種基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態 吸附解析機制的乳鐵蛋白制備方法。

【背景技術】
[0002] 牛乳蛋白主要是酪蛋白和乳清蛋白，其中乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF)主要存在于 乳清蛋白中，在牛乳中的含量約為〇. 1-0. 4mg/mL。LF具有多種重要的生物學功能，例如抗 菌活性、很強的離子親和力、抵抗病毒對機體的入侵、提高機體的免疫調節能力、促進傷口 的愈合、增強機體對于病的抵抗能力、促進成骨細胞的增殖等等。廣泛應用于嬰幼兒配方奶 粉、食品、醫藥、保健等領域，具有非常廣泛的市場應用前景。
[0003] 從1960年開始，人們就開始從不同的原料乳如牛乳、牛初乳、人乳、山羊乳和駱駝 初乳等中，采用各種方法如超濾、鹽析、硫酸銨沉淀、離子交換色譜法、鹽析結合凝膠層析 法、超濾結合離子交換色譜法、親和色譜法、混合模式擴張床吸附法、固定化單克隆抗體等 方法。Groves采用了 DEAE陰離子交換層析成功地分離出了 LF，接著Foley又對Groves 的磷酸纖維素交換層析進行了改進，制備了純度達81%的LF，隨后人們又研究出更有效的 羧甲基陽離子交換層析法分離LF。目前，主要采用強陽離子交換層析梯度洗脫的方法，結合 超濾濃縮以及凝膠過濾層析相結合的方法分離高純度的乳鐵蛋白。如S Sepharose Fast Flow、SP Sepharose Big Beads等陽離子交換樹脂，通過陽離子交換樹脂方法最后獲得LF 純度>95%，與親和層析法相比成本較低且應用廣泛。而硫酸銨沉淀和超濾等方法則成本低 廉，易操作，但獲得的LF純度（〈50%)較低，所以該方法通常用于分離LF粗品及輔助陽離子 交換層析和親和層析等方法以獲取高純度LF。生產及實驗中通常采用陽離子交換層析和超 濾、凝膠層析等方法相結合以快速獲取高純度LF。
[0004] 盡管利用上述方法可以得到純度高達90%以上的乳鐵蛋白產品，但這些方法本身 也存在諸多技術局限性，如生產成本過高，生產步驟繁瑣，需要對層析材料進行洗脫等。固 定化單克隆抗體法分離效果好純度高，但制備工藝復雜、成本昂貴，難以工業化生產；而超 濾法操作簡便，費用相對低，易形成工業化規模，但超濾膜需經常處理，其產品純度不如層 析法高。此外，乳鐵蛋白本身在牛乳中的含量極低，而在酪蛋白膠體中的分布又使得存在于 乳清中的乳鐵蛋白（僅有30%到50%)更是少之又少，這無疑加大了處理液體的體積，增加 了提取難度。因此人們最終不得不考慮在工業生產中利用其他技術方法，對牛乳中的乳鐵 蛋白進行分離提取。近年來，膜過濾技術被廣泛應用。其2007年Jimenez-Lopez研究了微 膜過濾對牛乳中各成分的影響，從而可以通過膜過濾技術對乳鐵蛋白進行分離提取。
[0005] 有研究表明，在牛乳體系中乳鐵蛋白以兩種形式存在，一種是自由乳鐵蛋白，即自 由存在于牛乳乳清蛋白中；一種是與酪蛋白膠體（Casein micelles, CM)相互作用的固定 乳鐵蛋白，形成酪蛋白膠體與乳鐵蛋白復合物（LF-CM)。根據L. Phelebon的研究結果表 明，二者之間存在著一個可逆平衡。酪蛋白（Casein，CN)在牛乳條件下并不是以單分子形 式存在的，而是主要由4種不同類型的酪蛋白a si-、a S2-、β-、κ -CN相互結合形成酪蛋 白膠體復合物（Casein micelles, CM)。利用牛乳體系中酪蛋白與乳鐵蛋白的動態包裹解析 機制，可以在工業化生產中開發一種新型的乳鐵蛋白純化方法。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態吸附解析機制的乳鐵蛋白 制備方法，充分利用牛乳體系中酪蛋白與乳鐵蛋白的動態包裹解析機制，實現乳鐵蛋白最 大程度的釋放，使得乳鐵蛋白制備得率與現有技術相比提高15%_30%，實現技術的重大突 破。
[0007] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的： 一種基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態吸附解析機制的乳鐵蛋白制備方法，包括如下步驟： (1) 對新鮮牛乳進行殺菌處理； (2) 對殺菌后的新鮮牛乳進行脫脂處理，脫脂后即為脫脂乳產品； (3) 采用0. 1 μ m的微濾膜過濾方法對脫脂乳進行濃縮，溫度控制在35-55 °C，將濃縮倍 數控制在1-3倍； (4) 對微濾膜過濾截留液進行透析處理，透析膜規格為0. 1 μ m的微濾膜，溫度控制在 35-55°C，采用去離子水作為透析溶液，控制截留溶液中總蛋白濃度為20-50g/L ; (5) 向截留溶液中加入100-500 mmol/L的NaCl，并將pH值調為6. 0-7.0,溫度控制在 25-35°C ;經過調配后在4-6°C條件下間歇攪拌2-8h ; (6) 采用透析的方式將步驟（5)中的乳鐵蛋白進行回收，透析膜規格為0. 1 μ m的微濾 膜，溫度控制在35-55°C，采用去離子水作為透析溶液； (7) 采用截流分子量為5-10kDa的超濾膜對透析液進行超濾處理，達到固形物含量 15-50wt.%，溫度控制在 35-55°C ; (8) 對超濾膜截留液進行透析處理，得到牛乳蛋白濃縮液，透析膜規格為3500-1000Da， 采用去離子水作為透析溶液； (9) 對牛乳蛋白濃縮液進行干燥處理。
[0008] 本發明根據"一種是與酪蛋白膠體（Casein micelles, CM)相互作用的乳鐵蛋白， 形成酪蛋白膠體與乳鐵蛋白復合物（LF-CM)，兩者之間存在可逆的動態平衡"理論，通過調 控牛乳體系因素，如pH、離子強度和溫度等因素，實現了對CM與LF結合和釋放過程的控制； 通過工藝技術工藝參數優化，可將原本包裹在酪蛋白膠束中的乳鐵蛋白（占總乳鐵蛋白含 量的15%-30%)從LF-CM復合物中釋放出來，并進一步通過膜分離技術提取出來，從而使得 乳鐵蛋白的提取率較傳統技術提高15%_30% ;而且本發明的工藝技術中無需經過離子交換 等耗時環節，大大提商了生廣效率。因此，本發明對于科研和工作生廣中能商效提取制備LF 具有重要的科學意義和經濟效益。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1為乳鐵蛋白制備工藝流程圖。

【具體實施方式】
[0010]

【具體實施方式】一：如圖1所示，本實施方式提供了一種基于酪蛋白與乳鐵蛋白動 態吸附解析機制的乳鐵蛋白制備方法，具體步驟如下： 一、乳鐵蛋白的制備 (1)殺菌處理：新鮮牛乳經過低溫長時巴氏殺菌（62-65°C保持25-35min)、高溫短時巴 氏殺菌（72-75°C保持10-20S)，或者經過1. 4 μ m的微濾膜除菌，或者先經過巴式殺菌再經 過膜過濾除菌。
[0011] (2)牛乳樣品處理：殺菌后的新鮮牛乳于4-6°C條件下，5000-10000rpm離心15-30 min脫除脂肪，脫脂后即為脫脂乳產品。
[0012] (3)微濾膜過濾：采用0. 1 μ m的微濾膜進行過濾，溫度控制在35-55°C，酪蛋白和 乳鐵蛋白得到同樣程度的濃縮，將濃縮倍數控制在1-3倍，即膜過濾截留液中總蛋白質濃 度變為初始濃度的1-3倍。
[0013] (4)透析處理：對膜過濾截留液進行透析處理，以除去其它雜蛋白，保留乳鐵蛋白 和酪蛋白，透析膜規格為〇. 1 μ m的微濾膜，溫度控制在35_55°C，采用去離子水作為透析溶 液，使用量為脫脂后牛乳體積的4-6倍，并采用凱氏定氮法監測截留溶液中的總蛋白濃度， 控制截留溶液中總蛋白濃度為20-50g/L。
[0014] (5)釋放乳鐵蛋白：向截留溶液中加入100-500 mmol/L的NaCl，并將pH值調為 6. 0-7. 0,溫度控制在25-35°C ;經過調配后在4-6°C條件下間歇攪拌2-8h，得到乳鐵蛋白與 酪蛋白復合物。
[0015] (6)透析處理回收乳鐵蛋白：采用透析的方式將乳鐵蛋白進行回收，透析膜規格為 〇. 1 μ m的微濾膜，溫度控制在35_55°C，采用去離子水作為透析溶液，使用量為脫脂后牛乳 體積的3-6倍。
[0016] (7)超濾處理：采用截流分子量為5-10kDa的超濾膜對乳鐵蛋白進行超濾處理，一 方面脫出乳鐵蛋白中殘留的NaCl，另一方面使乳鐵蛋白溶液得到濃縮，達到固形物含量(即 質量濃度）為15-50%，溫度控制在35-55°C。
[0017] (8)透析處理：對超濾膜截留液進行透析處理以進一步除去鹽，實現保留乳鐵蛋白 和酪蛋白，透析膜規格為3500-1000Da，采用去離子水作為透析溶液，使用量為超濾膜截留 液體積的3-6倍，最終保持固形物含量為15-50wt. %。
[0018] (9)乳鐵蛋白干燥：采用噴霧干燥技術對牛乳蛋白濃縮液進行干燥，進口溫度 130-170°C，出口溫度60-90°C，進行噴霧干燥之前的濃縮液固形物含量在15-50%。
[0019] 也可以采用低溫噴霧干燥的方式進行干燥，進風溫度60-80°C，出風溫度30-45°C; 進行低溫噴霧干燥之前的濃縮液固形物含量要求15-50%。
[0020] 也可以采用真空冷凍干燥的方式，冷阱溫度-73~-40°C，真空度0. 01~0. 5mbar，時 間：T24h。
[0021] 干燥之后的產品水分含量控制在5%以內。
[0022] 二、主要相關測定方法 (1)蛋白質測定 采用自動凱氏定氮儀法進行測定。計算的時候氮的換算為蛋白質的系數為6. 38。以重 復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，蛋白質含量>1 g/l〇〇 g時，結 果保留三位有效數字。
[0023] (2)免疫擴散方法（IDR)測定乳鐵蛋白含量 IDR方法是利用乳鐵蛋白與對應抗體的免疫反應而對樣品中乳鐵蛋白定量的一種方 法。測量中所需的試劑盒和標準乳鐵蛋白購買自Sigma公司。乳鐵蛋白含量根據如下公式 進行計算： mLF =[LFtotal] XV樣品= [LFtotal] X (m樣品/p 樣品）。
[0024] 式中-總乳鐵蛋白質量（g) ;[LFtotal]-乳鐵蛋白總含量（g. I71); ￥樣品一樣品體積（L) ;m樣品一樣品質量（g) ;P樣品一樣品密度（g-Γ1)。 (3)反相高效液相色譜RP-HPLC測定蛋白質組成 最終樣品的蛋白質組成成分分析，采用反相高效液相色譜法HPLC-RP。在本課題研究 過程中，這種方法被運用于確定樣品中的不同種類的可溶性蛋白質含量。樣品首先進行超 速離心處理（100000Xg，l h)，取其離心液，為進一步去除其中的微量酪蛋白，加入三氟乙 酸（0. 2%體積質量）進行酸沉淀處理，進行第二次離心處理（13000 X g，5 min)，取最終離 心液進行分析。
[0025] 三、檢測結果 本發明中的工藝參數具有多種組合，相應的乳鐵蛋白產品的組成相差較大，乳鐵蛋白 的含量范圍為23?87. 3%，α-乳白蛋白3. 5?16%，β-乳球蛋白3. 2?15%，血清蛋白f 12%，免 疫球蛋白1?13%，β -酪蛋白(Γ17%，水分3%，灰分1%。
[0026]

【具體實施方式】二：本實施方式提供了一種基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態吸附解析 機制的乳鐵蛋白制備方法，具體步驟如下： (1)殺菌處理：新鮮牛乳經過低溫長時巴氏殺菌（62-65°C保持30min)。
[0027] (2)牛乳樣品處理：殺菌后的新鮮牛乳于4_6°C條件下，6000離心15 min脫除脂 肪，脫脂后即為脫脂乳產品。
[0028] (3)微濾膜過濾：采用0. 1 μ m的微濾膜進行過濾，溫度35°C，該過程的操作終點通 過"膜過濾截留液中總蛋白質濃度變為初始濃度的3倍"判斷。
[0029] (4)透析處理：對膜過濾截留液進行透析處理，透析膜規格為0. 1 μ m的微濾膜，溫 度控制在35°C，采用去離子水作為透析溶液，使用量為脫脂后牛乳體積的4倍。
[0030] (5)釋放乳鐵蛋白：控制截留溶液中總蛋白濃度為20g/L，加入200 mmol/L的 NaCl，并將pH值調為6. 4,溫度控制在25°C ;4°C條件下攪拌3h。
[0031] (6)透析處理回收乳鐵蛋白：透析膜規格為0. ιμπι的微濾膜，溫度35°C，采用去離 子水作為透析溶液，使用量為脫脂后牛乳體積的3倍。
[0032] (7)超濾處理：采用截流分子量為5kDa的超濾膜對乳鐵蛋白進行超濾處理，達到 固形物含量（即質量濃度）為20%，溫度控制在35°C。
[0033] (8)透析處理：對超濾膜截留液進行透析處理以進一步除去鹽，透析膜規格為 5000Da，采用去離子水作為透析溶液，使用量為超濾膜截留液體積的3倍。
[0034] (9)乳鐵蛋白干燥：采用噴霧干燥技術對牛乳蛋白濃縮液進行干燥，進口溫度 170°C，出口溫度70°C，進行噴霧干燥之前的濃縮液固形物含量在30%。
[0035] 經過上述工序操作，最終得到的乳鐵蛋白粉組成及成份含量如下：乳鐵蛋白的含 量為23%，α-乳白蛋白16%，β-乳球蛋白15%，血清蛋白12%，免疫球蛋白13%，β-酪蛋白 17%，水分3%，灰分1%。
[0036]

【具體實施方式】三：本實施方式提供了一種基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態吸附解析機 制的乳鐵蛋白制備方法，具體步驟如下： (1)殺菌處理：新鮮牛乳經高溫短時巴氏殺菌（72-75°C保持10-20S)再經過膜過濾除 菌。
[0037] (2)牛乳樣品處理：殺菌后的新鮮牛乳于4°C條件下，SOOOrpm離心20 min脫除脂 肪，脫脂后即為脫脂乳產品。
[0038] (3)微濾膜過濾：采用0. 1 μ m的微濾膜進行過濾，溫度控制在45°C，該過程的操作 終點通過"膜過濾截留液中總蛋白質濃度變為初始濃度的3倍"判斷。
[0039] (4)透析處理：對膜過濾截留液進行透析處理，透析膜規格為0. 1 μ m的微濾膜，溫 度控制在45°C，采用去離子水作為透析溶液，使用量為脫脂后牛乳體積的6倍，并采用凱氏 定氮法監測截留溶液中的總蛋白濃度。
[0040] (5)釋放乳鐵蛋白：控制截留溶液中總蛋白濃度為40g/L，加入300 mmol/L的 NaCl，并將pH值調為6. 6,溫度控制在35°C ;經過調配后在4°C條件下間歇攪拌8h。
[0041] (6)透析處理回收乳鐵蛋白：透析膜規格為0. Ιμπι的微濾膜，溫度控制在55°C，采 用去離子水作為透析溶液，使用量為脫脂后牛乳體積的4倍。
[0042] (7)超濾處理：采用截流分子量為10kDa的超濾膜對乳鐵蛋白進行超濾處理；對 截留液再用分子量為30kDa的超濾膜進行處理，使截留液中固形物含量（即質量濃度）達到 30%時終止，溫度控制在55 °C。
[0043] (8)透析處理：透析膜規格為5000Da，采用去離子水作為透析溶液，使用量為超濾 膜截留液體積的4倍。
[0044] (9)乳鐵蛋白干燥：采用低溫噴霧干燥的方式進行干燥，進風溫度80°C，出風溫度 45°C ;進行低溫噴霧干燥之前的濃縮液固形物含量要求50%。
[0045] 經過上述工序操作，最終得到的乳鐵蛋白粉組成及成份含量如下：乳鐵蛋白的含 量為87. 3%，α -乳白蛋白3. 4%，β -乳球蛋白3. 2%，血清蛋白1%，免疫球蛋白1%，水分3. 2%， 灰分0. 9%。
[0046]

【具體實施方式】四：本實施方式提供了一種基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態吸附解析機 制的乳鐵蛋白制備方法，具體步驟如下： (1)殺菌處理：新鮮牛乳經過低溫長時巴氏殺菌（62°C保持30min)、再經過1. 4 μπι的 微濾膜除菌。
[0047] (2)牛乳樣品處理：殺菌后的新鮮牛乳于4°C條件下，lOOOOrpm離心15 min脫除 脂肪，脫脂后即為脫脂乳產品。
[0048] (3)微濾膜過濾：采用0. 1 μ m的微濾膜進行過濾，溫度控制在55°C，將濃縮倍數控 制在3倍。
[0049] (4)透析處理：對膜過濾截留液進行透析處理，透析膜規格為0. 1 μ m的微濾膜，溫 度控制在55°C，采用去離子水作為透析溶液，使用量為脫脂后牛乳體積的5倍，并采用凱氏 定氮法監測截留溶液中的總蛋白濃度。
[0050] (5)釋放乳鐵蛋白：控制截留溶液中總蛋白濃度為30g/L，加入200 mmol/L的 NaCl，并將pH值調為6. 8,溫度控制在35°C ;經過調配后在4°C條件下間歇攪拌6h。
[0051] (6)透析處理回收乳鐵蛋白：透析膜規格為0. ιμπι的微濾膜，溫度控制在55°C，采 用去離子水作為透析溶液，使用量為脫脂后牛乳體積的5倍。
[0052] (7)超濾處理：采用截流分子量為5kDa的超濾膜對乳鐵蛋白進行超濾處理，達到 固形物含量（即質量濃度）為40%，溫度控制在50°C。
[0053] (8)透析處理：透析膜規格為3500Da，采用去離子水作為透析溶液，使用量為超濾 膜截留液體積的5倍。
[0054] (9)乳鐵蛋白干燥：采用真空冷凍干燥的方式，冷阱溫度_73°C，真空度0. Olmbar， 時間24h。
[0055] 經過上述工序操作，最終得到的乳鐵蛋白粉組成及成份含量如下：乳鐵蛋白的含 量為56%，α -乳白蛋白16%，β -乳球蛋白16%，血清蛋白4%，免疫球蛋白4%，水分3%，灰分 1%〇
【權利要求】
1. 一種基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態吸附解析機制的乳鐵蛋白制備方法，其特征在于所 述乳鐵蛋白制備方法為： (1) 對新鮮牛乳進行殺菌處理； (2) 對殺菌后的新鮮牛乳進行脫脂處理，脫脂后即為脫脂乳產品； (3) 采用0. 1 μ m的微濾膜過濾方法對脫脂乳進行濃縮，溫度控制在35-55 °C，將濃縮倍 數控制在1-3倍； (4) 對微濾膜過濾截留液進行透析處理，透析膜規格為0. 1 μ m的微濾膜，溫度控制在 35-55°C，采用去離子水作為透析溶液，控制截留溶液中總蛋白濃度為20-50g/L ; (5) 向截留溶液中加入100-500 mmol/L的NaCl，并將pH值調為6. 0-7.0,溫度控制在 25-35°C ;經過調配后在4-6°C條件下間歇攪拌2-8h ; (6) 采用透析的方式將步驟（5)中的乳鐵蛋白進行回收，透析膜規格為0. 1 μ m的微濾 膜，溫度控制在35-55°C，采用去離子水作為透析溶液； (7) 采用截流分子量為5-10kDa的超濾膜對透析液進行超濾處理，達到固形物含量 15-50wt.%，溫度控制在 35-55°C ; (8) 對超濾膜截留液進行透析處理，得到牛乳蛋白濃縮液，透析膜規格為3500-1000Da， 采用去離子水作為透析溶液； (9) 對牛乳蛋白濃縮液進行干燥處理。
2. 根據權利要求1所述的基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態吸附解析機制的乳鐵蛋白制備 方法，其特征在于所述步驟（1)中，殺菌處理方法為：巴氏殺菌或者經過1. 4 μ m的微濾膜 除菌或者先經過巴式殺菌再經過膜過濾除菌。
3. 根據權利要求2所述的基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態吸附解析機制的乳鐵蛋白制備 方法，其特征在于所述巴氏殺菌方法為：62-65°C低溫長時巴氏殺菌25-35min或72-75°C高 溫短時巴氏殺菌l〇-20s。
4. 根據權利要求1所述的基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態吸附解析機制的乳鐵蛋白制備 方法，其特征在于所述步驟（2 )中，脫脂方法為：于4-6 °C條件下，5000-1 OOOOrpm離心15-30 min脫除脂肪。
5. 根據權利要求1所述的基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態吸附解析機制的乳鐵蛋白制備 方法，其特征在于所述步驟（9)中，采用噴霧干燥技術對牛乳蛋白濃縮液進行干燥，進口溫 度 130-170°C，出 口溫度 60-90°C。
6. 根據權利要求5所述的基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態吸附解析機制的乳鐵蛋白制備 方法，其特征在于進行噴霧干燥之前，濃縮液固形物含量在15-50wt. %。
7. 根據權利要求1所述的基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態吸附解析機制的乳鐵蛋白制備 方法，其特征在于所述步驟（9)中，采用低溫噴霧干燥的方式進行干燥，進風溫度60-80°C， 出風溫度30-45 °C。
8. 根據權利要求1所述的基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態吸附解析機制的乳鐵蛋白制備 方法，其特征在于進行低溫噴霧干燥之前，濃縮液固形物含量要求15-50wt. %。
9. 根據權利要求1所述的基于酪蛋白與乳鐵蛋白動態吸附解析機制的乳鐵蛋白制備 方法，其特征在于所述步驟（9)中，采用真空冷凍干燥的方式，冷阱溫度-73~-40°C，真空度 0· 01 ?5mbar，時間：T24h。
【文檔編號】C07K14/79GK104151423SQ201410368631
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月30日 優先權日:2014年7月30日
【發明者】杜明, 張蘭威, 周英爽, 王聰, 劉猛, 樊鳳嬌, 貝君, 白成軍 申請人:哈爾濱工業大學