本申請要求2014年3月20日提交的美國臨時申請No.61/955,975和2014年11月25日提交的美國臨時申請No.62/084,270的權益，其內容通過提述明確并入本文。

背景

Adnectin是一類來源于人纖連蛋白III型第十結構域(¹⁰Fn3)的具有高親和力和特異性靶結合特性的治療蛋白。然而，盡管野生型¹⁰Fn3是極其穩定和易溶的，在野生型序列的基礎上含有大約4-31個突變的¹⁰Fn3的靶結合變體在穩定性和溶解度方面變化很大。換言之，任何基于野生型¹⁰Fn3序列的突變，即使是靶結合所必需的，也存在著降低蛋白質穩定性的風險。因此，希望鑒定出可以對野生型¹⁰Fn3序列實施的使其穩定的修飾，最好與介導Adnectin與其治療靶標結合的殘基的身份無關。

概述

本文中提供了穩定化的基于纖連蛋白的支架(FBS)蛋白，例如Fn3，如¹⁰Fn3分子(例如，人¹⁰Fn3分子)，所述分子的C端連接于由氨基酸序列PmXn組成的部分，其中P是脯氨酸，X是任何氨基酸，m是至少為1的整數，并且n是0或至少為1的整數，并且其中PmXn部分增強FBS蛋白的至少一種特征，例如，熱穩定性。

附圖簡述

圖1：人¹⁰Fn3結構域(PDB ID:1FNA)的晶體結構、以及在該結構中可見的多肽的蛋白質序列的表示。在該結構中限定的最后兩個殘基，在該感興趣序列中的“EI”，顯示為緊接在C端β鏈G的下游的黑色球體。

發明詳述

定義

“氨基酸殘基”是在肽鍵形成中已經失去一個水分子(來自含氮側的H+和來自羧基側的OH-)之后的剩余氨基酸部分。

如本文中使用的，“¹⁰Fn3結構域”或“¹⁰Fn3部分”或“¹⁰Fn3分子”是指野生型¹⁰Fn3及其生物活性變體，例如與靶標(如靶蛋白)特異性地結合的生物活性變體。野生型人¹⁰Fn3結構域可包含SEQ ID NO:1-8所示的氨基酸序列之一。野生型人¹⁰Fn3結構域的生物活性變體包括這樣的¹⁰Fn3結構域，相對于包含SEQ ID NO:1-8中的任一者的¹⁰Fn3結構域，其包含至少、包含至多、或包含大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40或45個氨基酸改變(即，取代、添加或缺失)。相對于包含SEQ ID NO:1-8中任一者的¹⁰Fn3結構域，野生型¹⁰Fn3結構域的生物活性變體還可包含、或包含至多1-3、1-5、1-10、1-15、1-10、1-25、1-30、1-35、1-40或1-45個氨基酸改變。在某些實施方案中，相對于包含SEQ ID NO:1-8中任一者的¹⁰Fn3結構域，野生型人¹⁰Fn3結構域的生物活性變體不包含多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40或45個氨基酸改變(即，取代、添加或缺失)。氨基酸改變可以在環區、鏈、或N端、或C端區中。允許環區中氨基酸改變的簡并¹⁰Fn3氨基酸序列的例子在本文中提供為SEQ ID NO:9-16。

“多肽”是指具有兩個或更多個氨基酸的任何序列，而不論長度、翻譯后修飾、或功能。多肽可包括如在美國專利號6,559,126中描述的那些天然氨基酸和非天然氨基酸，通過提述將該專利并入本文。也可以多種標準化學方法中的任何方法修飾多肽(例如，可用保護基修飾氨基酸；可將羧基端氨基酸變成末端酰胺基團；可用基團修飾氨基端殘基，例如，以增強親油性；或者，可以化學方式將多肽糖基化或以別的方式修飾，以增加穩定性或體內半衰期)。多肽修飾可包括另一種結構如環狀化合物或其他分子與多肽的附接，并且還可包括含有處于改變構型的一個或多個氨基酸(即，R或S；或者，L或D)的多肽。

如本文中使用的¹⁰Fn3結構域(或部分或分子)的“區域”是指環(AB、BC、CD、DE、EF和FG)、β鏈(A、B、C、D、E、F和G)、N端(相應于SEQ ID NO:1的氨基酸殘基1-7)、或C端(相應于SEQ ID NO:1的氨基酸殘基93-94)。

¹⁰Fn3結構域(或部分)的“北極環”是指¹⁰Fn3結構域的BC、DE和FG環中任一者。

¹⁰Fn3結構域(或部分)的“南極環”是指¹⁰Fn3結構域的AB、CD和EF環中任一者。

“支架區”是指人¹⁰Fn3結構域的任何非環區。支架區包括A、B、C、D、E、F和Gβ鏈以及N端區(相應于SEQ ID NO:1的殘基1-7的氨基酸)和C端區(相應于SEQ ID NO:1的殘基93-94的氨基酸)。

本文中的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定義為在序列比對和引入空位(如果需要的話，達到最大序列同一性百分比，并且不將任何保守取代看作序列同一性的一部分)之后，候選序列中與選定序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。用于確定氨基酸序列同一性百分比之目的的比對可以通過本領域技術人員熟知的各種方法來實現，例如，利用可公開獲得的計算機軟件，如BLAST^SM、BLAST^SM-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign軟件。本領域技術人員可確定測量比對的適當參數，包括在所比較的序列的全長上實現最大比對所需要的任何算法。

為本文的目的，如下計算給定氨基酸序列A相對于(與、或針對)給定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者可表述為給定氨基酸序列A相對于(與、或針對)給定氨基酸序列B具有或包含一定的氨基酸序列同一性％)：100乘以分數X/Y，其中X為在A與B的序列比對程序(如BLAST^SM、BLAST^SM-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign)比對中通過該程序評定為相同匹配的氨基酸殘基的數目，且其中Y為B中的氨基酸殘基的總數。應當理解的是，在氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度的情況下，A相對于B的氨基酸序列同一性％不會等于B相對于A的氨基酸序列同一性％。

如本文中使用的，多肽中的氨基酸殘基被視為“貢獻于結合”靶標，如果(1)殘基的側鏈或主鏈的任何非氫原子被發現與結合靶標的任何原子相距五埃之內(基于實驗確定的該復合物的三維結構)；和/或(2)該殘基突變為野生型¹⁰Fn3(例如SEQ ID NO:1)中等價殘基、突變為丙氨酸、或突變為具有與討論中的殘基大小相似或更小的側鏈的殘基，導致測量的針對靶標的平衡解離常數增加(例如，k_on增加)。

多肽的血清或血漿“半衰期”可通常定義為該多肽的血清濃度在體內降低50％(例如，由于通過天然機制對該多肽的降解和/或該多肽的清除或鰲合)所花費的時間。可以任何本身已知的方式，例如通過藥代動力學分析，來測定半衰期。適合的技術對于本領域人員來說是清楚的，例如，可通常涉及下列步驟：向靈長動物給予適宜劑量的多肽；以規律間隔從所述靈長動物采集血液樣品或其他樣品；確定所述血液樣品中的多肽濃度水平；并且根據由此獲得的數據(的繪圖)計算直到該多肽的水平或濃度相比于給藥時的初始水平降低50％的時間。確定半衰期的方法例如可見于Kenneth等人，Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists(1986)；Peters等人，Pharmacokinete Analysis:A Practical Approach(1996)；和Gibaldi,M.等人，Pharmacokinetics,Second Rev.Edition,Marcel Dekker(1982)。

可以使用諸如t1/2-α、t1/2-β和曲線下面積(AUC)之類的參數來表示血清半衰期。“半衰期的增加”是指這些參數中任一者、這些參數的任何兩者、或所有這三個參數的增加。在某些實施方案中，半衰期的增加是指t1/2-β的增加，同時有或者沒有t1/2-α和/或AUC或這兩者的增加。

藥物產品(例如，包含FBS部分和HSA部分的蛋白質)的“貨架期”是該產品在發生分解之前的儲存時長。例如，貨架期可以定義為該產品分解0.1％、0.5％、1％、5％、或10％的時間。

概覽

本文中提供了與靶標特異性地結合的包含基于纖連蛋白的支架(FBS)結構域(例如Fn3)的蛋白質，如¹⁰Fn3分子，其中FBS結構域在其C端與由PmXn組成的區域連接，其中P是脯氨酸，X是任何氨基酸，并且其中n是0或至少為1的整數，m是至少為1的整數。本申請至少部分地基于這樣的發現：相對于未經修飾的¹⁰Fn3分子，在¹⁰Fn3分子的C端添加脯氨酸和任選地一個或多個氨基酸可增強¹⁰Fn3分子的至少一種特征，例如其熱穩定性或溶解度。

本文中描述的¹⁰Fn3分子可被設計為與任何感興趣的靶標結合。在示例性實施方案中，靶標是抗原、多肽或感興趣的治療蛋白靶標。示例性的治療上期望的靶標包括，例如，腫瘤壞死因子α(TNF-α)、VEGFR2、PCSK9、IL-23、EGFR和IGF1R。

基于纖連蛋白的支架

如本文中使用的，“基于纖連蛋白的支架”或“FBS”蛋白或部分是指基于纖連蛋白III型(“Fn3”)重復的蛋白質或部分。Fn3是一種小型(約10kDa)結構域，具有免疫球蛋白(Ig)折疊(即，Ig樣β夾心結構，由七個β鏈和六個環構成)結構。纖連蛋白具有18個Fn3重復，雖然各重復之間的序列同源性較低，但它們在三級結構上有高度的相似性。Fn3結構域還出現在除了纖連蛋白之外的多種蛋白質，例如粘附分子、細胞表面分子(例如，細胞因子受體)、和碳水化合物結合結構域中。綜述可參見Bork等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89(19):8990-8994(1992)；Bork等人，J.Mol.Biol.,242(4):309-320(1994)；Campbell等人，Structure,2(5):333-337(1994)；Harpez等人，J.Mol.Biol.,238(4):528-539(1994))。“FBS”蛋白或部分這一術語意圖包括來自這些其他蛋白質(即，非纖連蛋白分子)的基于Fn3結構域的支架。

Fn3結構域是小型的、單體的、可溶的、且穩定的。它缺乏二硫鍵，因此在還原條件下是穩定的。按照從N端到C端的順序，Fn3結構域包含：β或β樣鏈A；環AB；β或β樣鏈B；環BC；β或β樣鏈C；環CD；β或β樣鏈D；環DE；β或β樣鏈E；環EF；β或β樣鏈F；環FG；和β或β樣鏈G。上述七個反平行β鏈排列成兩個β片層，這兩個β片層形成穩定的核心，同時產生兩個由連接β或β樣鏈的環構成的“面”。環AB、CD、和EF位于一個面上(“南極”)，且環BC、DE、和FG位于相對的面上(“北極”)。

Fn3分子中的環在結構上類似于抗體的互補決定區(CDRs)，并且當其被改變時，可能參與Fn3分子和靶標(例如靶蛋白)的結合。Fn3分子的其他區域，如β或β樣鏈以及N端或C端區，當被改變時，也可能參與和靶標的結合。任何或所有環AB、BC、CD、DE、EF和FG均可參與靶標結合。任何β或β樣鏈都可能參與和靶標的結合。Fn3結構域還可通過一個或多個環以及一個或多個β或β樣鏈而結合至靶標。結合可能還需要N端或C端區。在蛋白質中使用的FBS結構域可包含所有環、所有β或β樣鏈、或僅僅它們的一部分，其中某些環和/或β或β樣鏈和/或N端區或C端區被修飾(或改變)，條件是FBS結構域優選地與靶標特異性結合。例如，FBS結構域可包含1、2、3、4、5或6個環，1、2、3、4、5、6、7、或8個β鏈，以及任選地包含N端區和/或C端區，其中一個或多個環、一個或多個β鏈、N端區和/或C端區相對于野生型FBS結構域被修飾。

在示例性實施方案中，本文中描述的配體(或靶標)結合FBS部分基于纖連蛋白III型第十結構域，即，Fn3的第十模塊(¹⁰Fn3)。野生型人¹⁰Fn3部分的氨基酸序列如下：

(AB、CD和EF環加下劃線；BC、FG、和DE環用粗體著重標記；β鏈位于各個環區之間或其鄰近；N端區以斜體表示)。SEQ ID NO:1的最后兩個氨基酸殘基為C端區的一部分。

野生型人¹⁰Fn3分子還包括那些缺乏N端區或其部分的分子。例如，野生型¹⁰Fn3分子可包含SEQ ID NO:1，其中缺失了氨基酸殘基1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6或1-7(分別為SEQ ID NO:2-8)。表1顯示了這些野生型人¹⁰Fn3部分的氨基酸序列：

表1：具有不同N端區的野生型人¹⁰Fn3分子的氨基酸序列

在一些實施方案中，AB環對應于SEQ ID NO:1的殘基14-17，BC環對應于殘基23-31，CD環對應于殘基37-47，DE環對應于殘基51-56，EF環對應于殘基63-67，并且FG環對應于殘基75-87。BC、DE和FG環沿著該分子的一個面，即“北極”對齊，而AB、CD和EF環沿著該分子的相對面，即“南極”對齊。在SEQ ID NO:1中，β鏈A對應于殘基8-13，β鏈B對應于殘基殘基18-22，β鏈C對應于32-36，β鏈D對應于殘基48-50，β鏈E對應于殘基57-62，β鏈F環對應于殘基68-74，并且β鏈G環對應于殘基88-92。β鏈通過相應的環彼此連接，例如，在β鏈A、環AB、β鏈B等等的形成中，鏈A和B經由環AB連接。

基于人¹⁰Fn3結構域的FBS蛋白的實例為adnectin(Adnexus，Bristol-Myers Squibb的全資附屬公司)。Adnectin是這樣的¹⁰Fn3分子，其中¹⁰Fn3結構域的CDR樣環區、β鏈、N端區和/或C端區已經被修飾，從而演化出能夠與感興趣的化合物結合的蛋白質。例如，美國專利號7,115,396描述了¹⁰Fn3結構域蛋白，其中針對BC、DE、和FG環的改變導致高親和力TNFα結合物。美國專利號7,858,739描述了Fn3結構域蛋白，其中針對BC、DE、和FG環的改變導致高親和力VEGFR2結合物。

在某些實施方案中，FBS部分包含¹⁰Fn3結構域，所述¹⁰Fn3結構域由以下簡并序列概括性地限定：

VSDVPRDLEVVAA(X)_uLLISW(X)_vYRITY(X)_wFTV(X)_xATISGL(X)_yYTITVYA(X)_zISINYRT(SEQ ID NO:9)，

或由選自SEQ ID NO:10-16的序列限定，所述序列除了分別缺乏1、2、3、4、5、6或7個N端氨基酸之外，與SEQ ID NO:9相同。表2顯示了這些簡并的人¹⁰Fn3分子的氨基酸序列。

表2：具有不同N端區的簡并野生型人¹⁰Fn3分子的氨基酸序列

在SEQ ID NO:25-32和50中，AB環以(X)_u表示，BC環以(X)_v表示，CD環以(X)_w表示，DE環以(X)_x表示，EF環以(X)_y表示，FG環以X_z表示。X表示任何氨基酸，在X下面的下標表示氨基酸的數目的整數。具體地說，u、v、w、x、y和z各自可獨立地為2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7、或6-7個氨基酸。β鏈序列(在SEQ ID NO:9中加下劃線)在所有7個支架區上可以具有相對于SEQ ID NO:9-16中所示的相應氨基酸的0到10、0到8、0到6、0到5、0到4、0到3、0到2、或0到1個取代、缺失或添加。在一些實施方案中，β鏈序列在所有7個支架區上可以具有相對于SEQ ID NO:9-16中所示的相應氨基酸的0到10、0到8、0到6、0到5、0到4、0到3、0到2、或0到1個取代(例如保守性取代)。

在某些實施方案中，疏水性核心氨基酸殘基(在以上SEQ ID NO:9中的粗體字的殘基)是固定的，且任何取代、保守性取代、缺失或添加均發生在除了所述疏水性核心氨基酸殘基之外的殘基處。因此，在一些實施方案中，本文中提供的多肽的疏水性核心殘基相對于野生型人¹⁰Fn3結構域(例如，SEQ ID NO:1)未經修飾。

在一些實施方案中，FBS部分包含¹⁰Fn3結構域，其中該¹⁰Fn3結構域包含環AB、環BC、環CD、環DE、環EF、和環FG，并且選自環AB、BC、CD、DE、EF和FG中的至少一個環具有相對于野生型人¹⁰Fn3結構域的相應環序列改變的氨基酸序列。在一些實施方案中，單個環被改變。在一些實施方案中，至多2個環被改變。在一些實施方案中，至多3個環被改變。在一些實施方案中，BC、DE和/或FG環被改變。在某些實施方案中，AB、CD、和EF環被改變。在某些實施方案中，FG環是唯一被改變的環。在某些實施方案中，CD環是唯一被改變的環。在其他實施方案中，CD和FG環均被改變，并且任選地，其他環都不被改變。在某些實施方案中，CD和EF環均被改變，并且任選地，其他環都不被改變。在一些實施方案中，一個或多個特定的支架改變與一個或多個環改變相組合。“改變”意指相對于模板序列(即，相應的野生型人纖連蛋白結構域)的一個或多個氨基酸序列改變，并且包括氨基酸添加、缺失、和取代。本文中進一步公開了包含改變的環和/或支架區(例如，β鏈、N端區和C端區)的特定組合的示例性¹⁰Fn3分子。

應當理解，為了實現對于期望靶標具有強親和力的¹⁰Fn3結合結構域，并不是環區中的每個殘基都需要修飾。另外，還可在環區中形成插入和缺失，同時仍然產生高親和力¹⁰Fn3結合結構域。

在一些實施方案中，選自AB、BC、CD、DE、EF和FG的一個或多個環相對于野生型人¹⁰Fn3中的相應環可以在長度上延長或縮短。在任何給定的多肽中，一個或多個環可以在長度上延長，一個或多個環可以在長度上縮短，或者這兩者的組合。在一些實施方案中，給定環的長度可以延長2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、5-25、5-20、5-15、5-10、10-25、10-20、或10-15個氨基酸。在一些實施方案中，給定環的長度可以縮短1-15、1-11、1-10、1-5、1-3、1-2、2-10、或2-5個氨基酸。具體地說，¹⁰Fn3的FG環的長度為13個殘基，而在抗體重鏈中的相應環的長度在4-28個殘基的范圍。因此，對于靶結合依賴于FG的多肽，為了優化其抗原結合，可以改變¹⁰Fn3的FG環的長度以及序列，以在靶結合中獲得盡可能大的靈活性和親和力。

在一些實施方案中，FBS部分包含¹⁰Fn3結構域，其中非環區包含與SEQ ID NO:1的非環區具有至少80％、85％、90％、95％、98％、或100％同一性的氨基酸序列，其中選自AB、BC、CD、DE、EF和FG的至少一個環被改變。例如，在某些實施方案中，AB環可具有至多4個氨基酸取代，至多10個氨基酸插入，至多3個氨基酸缺失，或上述組合；BC可具有至多10個氨基酸取代，至多4個氨基酸缺失，至多10個氨基酸插入，或上述組合；CD環可具有至多6個氨基酸取代，至多10個氨基酸插入，至多4個氨基酸缺失，或上述組合；DE環可具有至多6個氨基酸取代，至多4個氨基酸缺失，至多13個氨基酸插入，或上述組合；EF環可具有至多5個氨基酸取代，至多10個氨基酸插入，至多3個氨基酸缺失，或上述組合；和/或FG環可具有至多12個氨基酸取代，至多11個氨基酸缺失，至多25個氨基酸插入，或上述組合。

在一些實施方案中，FBS部分包含與人¹⁰Fn3結構域具有至少40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％同一性的¹⁰Fn3結構域，所述人¹⁰Fn3結構域具有選自包括SEQ ID NO:1-16的序列組的氨基酸序列。在某些實施方案中，本文中提供的FBS部分與選自包括SEQ ID NO:1-16的氨基酸序列組的氨基酸序列具有至少50％的同一性。在其他實施方案中，該FBS部分與選自包括SEQ ID NO:1-16的氨基酸序列組的氨基酸序列具有至少65％的同一性。在某些實施方案中，一個或多個環相對于野生型序列的相應環的序列將不被修飾、并且/或者一個或多個β鏈相對于野生型序列的相應β鏈的序列將不被修飾、并且/或者N端區或C端區將不被修飾。在某些實施方案中，FBS部分中的¹⁰Fn3結構域的各個β或β樣鏈可包含、其基本組成為、或其組成為與具有SEQ ID NO:1的相應β或β樣鏈的序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸序列。優選地，β鏈區中的變化將不會破壞多肽在生理條件下的穩定性。

在一些實施方案中，通過一個或多個保守取代可以修飾⁰Fn3結構域的非環區。通過保守取代可以改變¹⁰Fn3結構域中多達5％、10％、20％或甚至30％或更多的氨基酸，而基本上不改變¹⁰Fn3的配體親和力。在某些實施方案中，非環區，例如β鏈，可包含0-15、0-10、0-8、0-6、0-5、0-4、0-3、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、2-15、2-10、2-8、2-6、2-5、2-4、5-15、或5-10個保守氨基酸取代。在示例性實施方案中，支架修飾可將¹⁰Fn3結合物對配體的結合親和力降低100倍、50倍、25倍、10倍、5倍、或2倍。這樣的變化可能改變¹⁰Fn3的體內免疫原性，并且在免疫原性降低的情況下，這樣的變化可能是合意的。如本文中使用的，“保守取代”是在物理上或功能上與相應參考殘基類似的殘基。即，保守取代與其參考殘基具有相似的大小、性狀、電荷、化學特性，包括形成共價鍵或氫鍵等等的能力。示例性的保守取代包括滿足在Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure,5:345-352(1978and Supp.)中針對可接受點突變所定義的標準的那些取代。保守取代的實例包括在下組范圍內的取代：(a)纈氨酸、甘氨酸；(b)甘氨酸、丙氨酸；(c)纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；(d)天冬氨酸、谷氨酸；(e)天冬酰胺、谷氨酰胺；(f)絲氨酸、蘇氨酸；(g)賴氨酸、精氨酸、甲硫氨酸；和(h)苯丙氨酸、酪氨酸。

本文中還提供了具有環和支架修飾組合的¹⁰Fn3結構域。偶聯物可包含¹⁰Fn3結構域，所述結構域包含(i)在環AB、BC、CD、DE、EF、或FG中的至少一者的氨基酸序列中的修飾，和(ii)在至少一個支架區的氨基酸序列中的修飾(即，在β鏈、N端區、和/或C端區的至少一者中的修飾)，其中修飾的環和修飾的支架區兩者貢獻于對同一個靶標的結合。在示例性實施方案中，支架區修飾位于環區中的修飾的附近，例如，如果AB環被修飾，則支架突變可能傾向于位于在¹⁰Fn3結構域的線性序列上鄰近于AB環的β鏈A和/或β鏈B中。在其他實施方案中，在¹⁰Fn3結構域的線性序列上彼此鄰近的環區和支架區中可能同時出現一簇修飾。例如，對于既具有環修飾有具有支架修飾的Fn3結合物而言，氨基酸修飾簇可能出現于下列在¹⁰Fn3結構域的線性序列上彼此鄰近的下列環區和支架區組合：β鏈/環/β鏈、環/β鏈/環、環/β鏈/環/β鏈、端區/β鏈/環、或環/β鏈/端區，等等。例如，就具有新穎的環修飾和支架修飾組合的Fn3結構域而言，其可具有這樣的修飾簇：在一段20個連續氨基酸的序列上，相對于野生型至少有15個氨基酸被修飾。在其他實施方案中，相對于野生型Fn3結構域序列的相應氨基酸序列段，在一段連續的20個殘基中的至少17個、20個殘基中的至少18個、25個殘基中的至少17個、25個殘基中的至少20個、或30個殘基中的至少25個被修飾。在某些實施方案中，給定的Fn3結構域可具有被未修飾的(即，野生型)序列段分隔開的兩個或三個修飾簇。對于任何給定的經修飾區域(即，環、β鏈或端區)而言，可以是該區域的全部、或者是該區域僅僅一個部分相對于野生型序列修飾。當β鏈區被修飾時，疏水性核心殘基優選地保持未被修飾(即，野生型)，而β鏈中的一個或多個非核心殘基被修飾。

在一些實施方案中，¹⁰Fn3結構域包含沿著分子的“西側”的結合面(“西側結合物”或“WS結合物”)。與在SEQ ID NO:1中示出的相應CD和FG環序列相比，WS結合物可包含修飾的CD環和修飾的FG環。CD環和FG環兩者貢獻于與同一個靶標結合。在某些實施方案中，WS結合物可在Fn3結構域內的一個或多個區域包含另外的修飾。例如，WS結合物可包含在鄰近CD和/或FG環的一個或多個β鏈區中的支架修飾。具體地說，WS結合物在β鏈C、β鏈D、β鏈F、和/或β鏈G的一者或多者中可以包含序列修飾。示例性的支架修飾包括在對應于SEQ ID NO:1的氨基酸位置33、35、49、69、71、73、89和/或91的一個或多個支架區位置處的修飾。WS結合物還可以在BC環中，尤其是在BC環的C端部分中包含修飾。在一個實施方案中，BC環中的最后兩個殘基(即，對應于野生型¹⁰Fn3結構域中的氨基酸30和31)相對于野生型序列被修飾。上述另外的環修飾和支架修飾的全部或部分可以與修飾的CD和FG環一道貢獻于與靶標的結合。優選地，疏水性核心殘基相對于野生型序列未被修飾。

示例性WS結合物包括在位置30、31、33、35、37、38、46、47、49、50、67、69、71、73、75、76、84、85、86、87、89或91處具有野生型或突變氨基酸的那些結合物。

在一些實施方案中，¹⁰Fn3結構域包含在CD環、DE環以及在一些情況下在EF環中的修飾，其中這些環修飾均貢獻于靶接合。這些多肽被稱為“前結合物”(“front binder”)。前結合物可另外包含在一個或多個支架區、尤其是在修飾環區之側翼或鄰近的支架區中的修飾。例如，前結合物可在β鏈C、β鏈D、和/或β鏈E中一者或多者中包含相對于野生型Fn3結構域、例如人¹⁰Fn3結構域(SEQ ID NO:1)的相應β鏈的序列的支架修飾。優選地，疏水性核心殘基相對于野生型序列未被修飾。可存在于前結合物中的示例性支架修飾包括在對應于SEQ ID NO:1的氨基酸位置36、49、58和/或50中的一個或多個位置處的修飾。這樣的支架修飾可以與修飾的環一道貢獻于對靶標的結合。在某些實施方案中，前結合物可包含跨Fn3(例如¹⁰Fn3結構域)的若干環區和鏈區的修飾簇。具體地說，前結合物在對應于野生型Fn3(例如人¹⁰Fn3)結構域(SEQ ID NO:1)的殘基36到66的氨基酸之間的31個殘基中可包含至少15、20、24、25、或27個殘基的修飾。環和/或鏈修飾可包括氨基酸取代、缺失和/或插入，或其組合。在示例性實施方案中，CD環相對于Fn3例如野生型人¹⁰Fn3結構域(SEQ ID NO:1)的CD環在長度上延長或在長度上縮短。

在一些實施方案中，¹⁰Fn3結構域包含在EF和FG環中的修飾，其中這些環修飾貢獻于與同一個靶標的結合。這些多肽在本文中稱為“后結合物”(“back binder”)。后結合物可在其他環和/或支架區中包含另外的修飾。例如，后結合物在AB環的至少一個部分，優選地在AB環的N端部分中可含有修飾。在示例性實施方案中，相對于野生型序列，AB環中的前兩個氨基酸(即，對應于野生型¹⁰Fn3結構域中的氨基酸殘基14和15)被修飾。在某些實施方案中，后結合物還可含有一個或多個支架修飾，尤其是在鄰近修飾的環區的一個或多個支架區中的修飾。例如，后結合物可在β鏈A、β鏈G、N端區、和/或C端區的一者或多者中含有一個或多個修飾。優選地，疏水性核心殘基相對于野生型序列未被修飾。示例性支架修飾包括在對應于SEQ ID NO:1的氨基酸位置1-7、9-13、89、91、93和/或94的一個或多個位置處的修飾。一個或多個所述的另外的環修飾和/或支架修飾可以連同所述修飾的EF和FG環一起貢獻于對靶標的結合。適合的環和/或支架區修飾包括氨基酸取代、缺失和/或插入，或其組合。在某些實施方案中，FG環的氨基酸序列相對于野生型人¹⁰Fn3結構域(SEQ ID NO:1)的FG環在長度上延長或在長度上縮短。

在某些實施方案中，后結合物可包含跨越¹⁰Fn3結構域中連續幾個區域的修飾氨基酸殘基簇。例如，Fn3(例如¹⁰Fn3)結構域的前15個氨基酸殘基中的至少14個殘基可相對于野生型Fn3(例如人¹⁰Fn3結構域)(SEQ ID NO:1)中的相應殘基被修飾，和/或對應于野生型Fn3(例如人¹⁰Fn3)結構域(SEQ ID NO:1或23)的殘基80到97(或94)之間的氨基酸的18個殘基中的至少15個殘基可相對于野生型序列中的相應殘基被修飾。當提及在¹⁰Fn3分子中比94位更靠C端的氨基酸時，其語境是這樣的¹⁰Fn3分子：該分子在Fn3結構域的第10個重復和第11個重復之間包含一個柔性接頭(即，EIDKPSQ)，由此形成101個氨基酸長的蛋白質(因此，SEQ ID NO:23表示SEQ ID NO:1的C端連接EIDKPSQ)。

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:23)

在某些實施方案中，相對于野生型序列的相應區域的序列，¹⁰Fn3結構域在β鏈A、環AB、β鏈B、環CD、β鏈E、環EF、和β鏈F的氨基酸序列中包含修飾。這些多肽在本文中被稱為“南極結合物”(“south pole binder”)或“SP結合物”。這些修飾的環和鏈貢獻于對同一個靶標的結合。CD環的氨基酸序列相對于野生型Fn3(例如人¹⁰Fn3)結構域(SEQ ID NO:1或23)的CD環可以在長度上延長或在長度上縮短。相對于野生型序列對應區的序列，這些南極結合物在β鏈G和/或C端區中可包含另外的修飾。在示例性實施方案中，南極結合物可在對應于野生型序列的位置11、12、19、60、61、69、91、93和95-97的氨基酸處包含一個或多個修飾。

在一些實施方案中，與SEQ ID NO:1或23中示出的相應BC、DE和FG環相比，¹⁰Fn3結構域包含修飾的BC、DE和FG環，以及在β鏈C、β鏈D、β鏈F和β鏈G鏈殘基的一者或多者中的另外的修飾。這些β鏈和環區修飾一起貢獻于對靶標的結合。這些蛋白質在本文中被稱為“西北結合物”(“Northwest binder”)或“NW結合物”。在示例性實施方案中，NW結合物包含一個或多個對應于SEQ ID NO:1或23的支架區位置R33、T49、Y73和S89的氨基酸位置中任一者或其組合的支架修飾。環和/或支架區中的適合修飾包括氨基酸取代、缺失和/或插入，或其組合。在某些實施方案中，BC、DE和FG環的一者或多者相對于野生型序列在長度上延長或在長度上縮短，或其組合。在一個實施方案中，BC、DE和FG環各自相對于野生型序列(例如，SEQ ID NO:1或23)在長度上延長或在長度上縮短，或其組合。在一些實施方案中，BC環僅有一個部分，尤其是C端部分，相對于野生型序列被修飾。例如，BC環可以僅在對應于野生型BC環的氨基酸27-31的氨基酸殘基處被修飾，而BC環的剩余部分(即，對應于野生型環的殘基23-26)不被修飾。

在一些實施方案中，¹⁰Fn3結構域包含修飾的BC、DE和FG環，并且在N端區、β鏈A、β鏈B和/或β鏈E中任一者或其組合中包含一個或多個另外的修飾。這些蛋白質在本文中被稱為“東北結合物”(“Northeast binder”)或“NE結合物”。在示例性實施方案中，NE結合物在對應于野生型序列(SEQ ID NO:1或23)的支架區位置1-7、E9、L19、S21和/或T58的氨基酸中任一者或其組合處被修飾。修飾的環和支架區的組合貢獻于對靶標的結合。

在一些實施方案中，¹⁰Fn3結構域在AB、CD、DE和EF環的一者或多者中包含修飾，并且在β鏈B、β鏈D和/或β鏈E的一者或多者中包含另外的修飾。這些蛋白質在本文中被稱為“南前結合物”(“South Front binder”)。修飾的環和鏈殘基的組合貢獻于與靶標的結合。在示例性實施方案中，南前結合物可在對應于SEQ ID NO:1或23的支架區位置L19、T49、T58、S60、和/或G61的一個或多個氨基酸位置處和/或在對應于SEQ ID NO:1或23的環區位置T14-S17、P51、T56、G40-E47、和/或K63-G65的一個或多個氨基酸位置處被修飾。在示例性實施方案中，南前結合物在AB環中、在對應于野生型序列的殘基18和20的氨基酸之間、和/或在CD環中，可以在長度上延長或在長度上縮短。

在一些實施方案中，與SEQ ID NO:1或23的相應鏈比較，¹⁰Fn3結構域包含修飾的β鏈A和β鏈G。這些蛋白質在本文中被稱為“AG結合物”或“AG鏈”。在某些實施方案中，AG鏈結合物在Fn3(例如¹⁰Fn3結構域)的N端和C端部分包含修飾簇，而Fn3的中間部分保持未修飾。例如，在AG鏈結合物的¹⁰Fn3結構域的前19個氨基酸(即，對應于SEQ ID NO:1或23的氨基酸位置1-19)中可包含16/19個氨基酸的修飾，且在¹⁰Fn3結構域的最后18個氨基酸(即，對應于SEQ ID NO:9的氨基酸位置84-101)中可包含13-17/18個氨基酸的修飾、或在¹⁰Fn3結構域的最后22個氨基酸(即，對應于SEQ ID NO:9的氨基酸位置80-101)中可包含14-18/22個氨基酸的修飾。在示例性實施方案中，AG結合物在對應于SEQ ID NO:9的位置1-7、9、11-17、19、84-89和91-97的一個或多個位置處可包含修飾。優選地，AG結合物中的這些修飾區貢獻于與同一個靶標結合。

在一些實施方案中，¹⁰Fn3結構域包含修飾的CD和EF環、并且在對應于SEQ ID NO:1或23的位置69或91-97的殘基中任一者或其組合中包含另外的修飾。這些蛋白質在本文中被稱為“西南結合物”(“Southwest binder”)或“SW結合物”。修飾的環和支架區貢獻于與靶標的結合。

在某些實施方案中，蛋白質包含具有降低的免疫原性的¹⁰Fn3結構域，其中BC環的一部分保留為野生型。優選地，這樣的多肽相對于在BC環的更大部分中具有修飾的等同多肽具有較低的免疫原性。在示例性實施方案中，BC環的N端部分保留為野生型。例如，BC環的前1、2、3、4、5、或5個殘基可保留為野生型，而BC環的剩余C端殘基可被修飾。在BC環的N端區的至少一部分為野生型的Fn3設計中，建議相對于野生型序列保持β鏈B和/或β鏈C的全部或部分不被修飾，尤其是鄰近BC環的β鏈B和/或β鏈C部分(即，β鏈B的C端部分和/或β鏈C的N端部分)。在示例性實施方案中，Fn3結構域在BC環的N端部分中具有野生型序列，且具有降低的免疫原性，該Fn3結構域在N端區、β鏈A、AB環、和β鏈B中可以沒有任何修飾。在BC環的一部分為野生型的Fn3設計中，BC環的修飾部分連同¹⁰Fn3結構域的其他區中的修飾可貢獻于靶結合。

在某些實施方案中，蛋白質包含具有降低的免疫原性的¹⁰Fn3結構域，其中在β鏈B/BC環/β鏈C區中的強HLA錨(“BC錨”)已經被去除或破壞(例如，相對于野生型序列被修飾從而降低與一個多個HLA受體的結合親和力)。例如，通過在對應于SEQ ID NO:1的位置L19、S21、R33和/或T35的一個或多個位置修飾Fn3(例如¹⁰Fn3)結構域，可去除或破壞BC錨。當BC錨已經去除或破壞時，有可能修飾BC環的序列，而不顯著增加BC區的免疫原性。因此，許多這樣的Fn3設計除了在β鏈B和/或β鏈C中的修飾之外，還具有BC環中的修飾。BC環可貢獻于靶結合，任選地與Fn3結構域的其他區中的修飾聯合貢獻于靶結合。在β鏈B和/或β鏈C中的修飾可以貢獻于也可以不貢獻于靶接合。

在示例性實施方案中，FBS，例如¹⁰Fn3結構域，以小于500nM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、500pM、100pM或更小的K_d與期望靶標結合。在一些實施方案中，FBS，例如¹⁰Fn3結構域，以1pM和1μM之間、100pM和500nM之間、1nM和500nM之間、或1nM和100nM之間的K_d與期望靶標結合。在示例性實施方案中，¹⁰Fn3部分特異性地結合不被野生型¹⁰Fn3結構域，尤其是野生型人¹⁰Fn3結構域，例如具有SEQ ID NO:1-8的野生型人¹⁰Fn3結構域結合的靶標。

在某些實施方案中，FBS部分包含與選自SEQ ID NO:1-16的序列組的氨基酸序列具有至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列，并且FBS特異性地與靶標結合，例如以小于500nM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、500pM、100pM或更小的K_d特異性地與靶標結合。FBS部分可以在一個或多個環、以及一個或多個支架區中包含氨基酸改變(或變化)。

在一些實施方案中，可以將整聯蛋白結合基序“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD)(SEQ ID NO:1的氨基酸78-80)中的一個或多個殘基加以取代，從而破壞整聯蛋白結合。在一些實施方案中，本文中提供的所述多肽的FG環不含RGD整聯蛋白結合位點。在一個實施方案中，該RGD序列被替換為極性氨基酸-中性氨基酸-酸性氨基酸序列(以N端到C端的方向)。在某些實施方案中，該RGD序列被替換為SGE或RGE。

在一些實施方案中，相對于¹⁰Fn3結構域(例如包含SEQ ID NO:1的¹⁰Fn3結構域)的相應區域的氨基酸序列，FBS部分的N端和/或C端區的氨基酸序列可以通過缺失、取代或插入而被修飾。

在某些實施方案中，相對于具有SEQ ID NO:1的野生型人¹⁰Fn3結構域中的相應氨基酸的序列，本文提供的多肽中SEQ ID NO:1的前1、2、3、4、5、6、7、8或9個殘基的氨基酸序列可以被修飾或缺失。在示例性實施方案中，與SEQ ID NO:1-16中任一者的氨基酸1-7、8或9對應的氨基酸被替換為長度為1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3,1-2、或1個氨基酸的替代N端區。示例性替代N端區包括(用單字母氨基酸代碼表示)：M、MG、G、MGVSDVPRDL(SEQ ID NO:24)和GVSDVPRDL(SEQ ID NO:25)、或SEQ ID NO:24或25中任一者的N端截短。其他適合的替代N端區包括，例如，X_nSDVPRDL(SEQ ID NO:26)、X_nDVPRDL(SEQ ID NO:27)、X_nVPRDL(SEQ ID NO:28)、X_nPRDL(SEQ ID NO:29)、X_nRDL(SEQ ID NO:30)、X_nDL(SEQ ID NO:31)、或X_nL，其中n＝0、1或2個氨基酸，其中當n＝1時，X是Met或Gly，并且當n＝2時，X是Met-Gly。當Met-Gly序列被添加至¹⁰Fn3結構域的N端時，M常被切割掉，在N端留下G。在其他實施方案中，替代的N端區包含氨基酸序列MASTSG(SEQ ID NO:32)。

如本文中進一步描述，在一些實施方案中，SEQ ID NO:1的前七個或八個殘基(即，殘基1-7或1-8)缺失，從而產生具有例如SEQ ID NO:8的氨基酸序列的¹⁰Fn3結構域。具有SEQ ID NO:1-16中任一者的氨基酸序列的¹⁰Fn3結構域的N端或C端還可添加另外的序列。例如,在一些實施方案中，N端延伸由選自下組的氨基酸序列組成：M、MG、和G。例如，SEQ ID NO:1-16中任一者之前可以是M、MG、或G。

在某些實施方案中，FBS部分基于纖連蛋白例如人纖連蛋白的III型結構域的第10重復之外的Fn3重復。例如，FBS部分可類似于任何其他纖連蛋白III型重復，例如，第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、和第18Fn3重復。在其他實施方案中，FBS部分可以來自纖連蛋白之外的分子。示例性FBS部分可以來源于肌腱蛋白，肌腱蛋白是一種由15個Fn3結構域組成的蛋白質，這些結構域彼此具有如纖連蛋白中所見的相似的序列相似性。這些重復描述于例如Jacobs等人，Protein Engineering,Design&Selection,25:107(2012)。基于纖連蛋白分子中的重復以及肌腱蛋白分子中的重復的同源性，已經產生基于這些同源性的人工分子。包含基于纖連蛋白分子中的結構域的同源性的共有氨基酸序列的蛋白質被稱為Fibcon和FibconB(WO2010/093627和Jacobs等人，(2012)，上文)，基于肌腱蛋白分子中的結構域的同源性的蛋白質被稱為Tencon。示例性Fibcon氨基酸序列包含下列氨基酸序列：

MPAPTDLRFTNETPSSLLISWTPPRVQITGYIIRYGPVGSDGRVKEFTVPPSVSSATITGLKPGTEYTISVIALKDNQESEPLRGRVTTGG(FibconB；SEQ ID NO:33)，

其中環AB由氨基酸13-16組成(TPSS；SEQ ID NO:34)，環BC由氨基酸22-28組成(TPPRVQI；SEQ ID NO:35)，環CD由氨基酸38-43組成(VGSDGR；SEQ ID NO:36)，環DE由氨基酸51-54組成(PSVS；SEQ ID NO:37)，環EF由氨基酸60-64組成(GLKPG；SEQ ID NO:38)，環FG由氨基酸75-81組成(KDNQESEP；SEQ ID NO:39)。另一種Fibcon氨基酸序列包含下列氨基酸序列：

LDAPTDLQVTNVTDTSITVSWTPPSATITGYRITYTPSNGPGEPKELTVPPSSTSVTITGITPGVEYVVSVYALKDNQESPPLVGTCTT(SEQ ID NO:40；Jacobs等人，上文)。

源于肌腱蛋白的Fn3蛋白包括Tencons(WO 2010/051274、WO 2010/051310和WO 2011/137319，將它們通過提述明確并入本文)。示例性Tencon蛋白具有下列氨基酸序列：

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT(SEQ ID NO:41；Jacobs等人，上文，和WO 2011/137319)，

其中環AB由氨基酸13-16組成(TEDS；SEQ ID NO:42)，環BC由氨基酸22-28組成(TAPDAAF；SEQ ID NO:43)，環CD由氨基酸38-43組成(SEKVGE；SEQ ID NO:44)，環DE由氨基酸51-54組成(GSER；SEQ ID NO:45)，環EF由氨基酸60-64組成(GLKPG；SEQ ID NO:46)，環FG由氨基酸75-81組成(KGGHRSN；SEQ ID NO:47)。

Fibcon、FibconB或Tencon部分，或其靶結合變體，無論是單獨的還是綴合有異源部分的，可以如本文中描述進行融合。來自其他蛋白質，例如細胞表面激素和細胞因子受體、伴侶蛋白、和碳水化合物結合結構域，的Fn3結構域可以如本文中描述進行偶聯。

FBS蛋白或部分在例如WO 2010/093627、WO 2011/130324、WO 2009/083804、WO 2009/133208、WO 02/04523、WO 2012/016245、WO 2009/023184、WO 2010/051310、WO 2011/020033、WO 2011/051333、WO 2011/051466、WO 2011/092233、WO 2011/100700、WO 2011/130324、WO 2011/130328、WO 2011/137319、WO 2010/051274、WO 2009/086116、WO09/058379、WO 2013/067029WO 2012/016245、WO 2014/120891和WO 2014/043344中有描述(所有這些專利均通過提述明確并入本文)：任何在這些出版物中描述的FBS蛋白或部分均可如本文描述加以使用。

在某些實施方案中，蛋白質包含至少2個FBS部分，例如，所述蛋白質包含多價FBS部分。例如，多價FBS可包含共價締合的2、3或更多個FBS部分，例如¹⁰Fn3結構域。在示例性實施方案中，FBS部分是包含兩個¹⁰Fn3結構域的雙特異性或二聚體蛋白。

在多價蛋白中的各個FBS部分，例如，各個¹⁰Fn3結構域，可以通過多肽接頭加以連接。示例性的多肽接頭包括具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、或1-2個氨基酸的多肽。適合的用于連接¹⁰Fn3結構域的接頭是這樣的接頭，其允許各別的結構域彼此獨立地折疊，形成容許與靶分子高親和力結合的三維結構。適合的接頭的具體實例包括基于甘氨酸-絲氨酸的接頭、基于甘氨酸-脯氨酸的接頭、基于脯氨酸-丙氨酸的接頭、以及本文中描述的任何其他接頭。在一些實施方案中，所述接頭為基于甘氨酸-脯氨酸的接頭。這些接頭包含甘氨酸和脯氨酸殘基，并且長度可以在3和30、10和30、以及3和20個氨基酸之間。這樣的接頭的實例包括GPG、GPGPGPG(SEQ ID NO:48)和GPGPGPGPGPG(SEQ ID NO:49)。在一些實施方案中，所述接頭為基于脯氨酸-丙氨酸的接頭。這些接頭包含脯氨酸和丙氨酸殘基，并且長度可以在3和30、10和30、3和20以及6和18個氨基酸之間。這樣的接頭的實例包括PAPAPA(SEQ ID NO:50)、PAPAPAPAPAPA(SEQ ID NO:51)和PAPAPAPAPAPAPAPAPA(SEQ ID NO:52)。在一些實施方案中，所述接頭是基于甘氨酸-絲氨酸的接頭。這些接頭包含甘氨酸和絲氨酸殘基并且長度可以在8和50、10和30、以及10和20個氨基酸之間。這樣的接頭的實例包括GSGSGSGSGS((GS)₅；SEQ ID NO:53)、GSGSGSGSGSGS((GS)₆；SEQ ID NO:54)、GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS((GS)₁₀；SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS((G₄S)₄；SEQ ID NO:56)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS((G₄S)₅；SEQ ID NO:57)、和GGGGSGGGGSGGGSG(SEQ ID NO:58)。在示例性實施方案中，接頭不含任何Asp-Lys(DK)對。

PmXn部分，例如，穩定化部分

在某些實施方案中，FBS，例如¹⁰Fn3部分，在其C端與由PmXn組成的部分連接，其中P是脯氨酸，X是任何氨基酸，m是至少為1的整數，并且n是0或至少為1的整數，并且P在X的N端。PmXn部分可以直接連接于¹⁰Fn3部分的C端氨基酸，例如它的第94個氨基酸(基于SEQ ID NO:1的氨基酸編號)。PmXn部分可經由肽鍵與¹⁰Fn3部分的第94個氨基酸連接。PmXn部分可與這樣的¹⁰Fn3部分連接，所述¹⁰Fn3部分具有與SEQ ID NO:1同源的氨基酸序列，或者包含表1或2中所示的氨基酸序列、基本上由表1或2中所示的氨基酸序列組成、或由為表1或2中所示的氨基酸序列組成。在SEQ ID NO:1末端的單個脯氨酸殘基稱為“95Pro”或“Pro95”或“P95”或“95P”。

與PmXn部分連接的示例性¹⁰Fn3部分包括下列序列：

LEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTPmXn(SEQ ID NO:59)

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTPmXn(SEQ ID NO:60)

在PmXn中，m可以是1、2、3或更多。例如，m可以是1-3或者m可以是1-2。“n”可以是0、1、2、3或更多，例如，n可以是1-3或1-2。

如本文中進一步描述的，通過修飾一個或多個環和/或一個或多個β鏈的氨基酸序列，可以修飾這些¹⁰Fn3部分使之與靶標結合(并且形成FBS部分)。與PmXn連接的FBS部分在本文中被稱為“修飾的FBS部分”。因此，本文中提供了包含與SEQ ID NO:59或60至少約50％、60％、70％、80％、90％、或95％相同的氨基酸序列的FBS部分的蛋白質，其中所述蛋白質包含PmXn，并且，其中FBS與靶標特異性地結合(除了通過RGD結構域之外)。

在PmXn中，n可以是0，在這種情況下，該蛋白質的C端氨基酸是Pm，例如P。在某些實施方案中，n不是0，并且可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。例如，n可以是0-10、0-5、0-3、1-10、1-5、1-3或1-2。然而，該脯氨酸可以與10個以上的氨基酸連接。例如，在串聯FBS部分或與另一種多肽融合的FBS部分中，FBS部分的C端氨基酸可與一個或多個脯氨酸連接，并且最后的脯氨酸與第二個FBS部分或與異源部分連接。因此，在某些實施方案中，n可以是范圍為0-100、0-200、0-300、0-400、0-500或更大的整數。

在某些實施方案中，PmXn包含半胱氨酸。例如，脯氨酸之后的第一個氨基酸可以是半胱氨酸，并且該半胱氨酸可以是該分子中最后的氨基酸或者該半胱氨酸可以在一個或多個氨基酸之后。半胱氨酸的存在容許異源部分(如化學部分，例如PEG)與FBS部分偶聯。包含半胱氨酸的示例性PmXn部分包括：PmCXn，其中C是半胱氨酸。另一個實例是PmXn₁CXn₂，其中n₁和n₂獨立地是0或至少為1的整數。例如，n₁可以是1并且n₂可以是1、2、3、4或5。

示例性PmXn部分包括在表3中列出的那些。

表3：示例性PmXn部分

任何PmXn部分，例如，在表3中所示的那些，可以被組氨酸尾所跟隨，例如，6xHis標簽，或其他標簽。這并不排除組氨酸尾可能被包括在PmXn中。

PmXn部分添加到FBS部分上可增強FBS部分的一種或多種特征。例如，如實施例中所示，相對于未與PmXn部分連接的部分，它增強¹⁰Fn3部分的熱穩定性。熱穩定性的提高預期可改善其他期望的特性，如溶解度、正確折疊和表達水平。例如，如實施例中所示，相對于未與PmXn部分連接的FBS，FBS C端PmXn部分的存在提高了FBS的溶解度。

因此，在某些實施方案中，相對于未與PmXn部分連接的FBS部分，FBS例如¹⁰Fn3部分的Tm至少被提高1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15℃。例如，相對于未與PmXn部分連接的FBS部分，Tm可增加1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、或1-5℃。例如，可如下所述通過熱掃描熒光(TSF)測量Tm。將蛋白質樣品，例如HTPP樣品歸一化為0.2mg/ml(在PBS中)。將1μl的橙色染料用PBS 1:40稀釋，添加至25μl的各樣品，用透明的96孔微孔板密封膠密封所述板。使用BioRad RT-PCR機使溫度從25℃以每分鐘2度的速率逐漸上升到95℃掃描樣品。使用BioRad CFX manager 2.0軟件分析數據。還可如下所述通過差示掃描量熱法(DSC)測量Tm。在70p.s.i壓力下在VP-毛細管差示掃描量熱儀(GE Microcal)中通過使溫度以每分鐘1度的速率從15℃逐漸上升到110℃來掃描0.5mg/ml溶液。使用Origin軟件(OriginLab Corp)，利用最佳擬合分析相對于適當緩沖液對照運行的數據。

在某些實施方案中，FBS部分的溶解度由于其與PmXn部分連接而提高。這樣的分子可以至少10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml的濃度存在。

PKE部分

FBS部分可與PKE部分連接以延長FBS部分的半衰期。示例性PKE部分包括人血清白蛋白；與人血清白蛋白結合的蛋白質(例如，與HSA或ABD結合的FBS)；Fc；或其任何部分或變體；和PEG。這些部分可連接在PmXn部分和/或FBS的N端或C端。

半胱氨酸偶聯的標記物和治療劑

在某些實施方案中，與PmXn部分連接的FBS部分(并且稱為“修飾的FBS部分”)，其中至少一個或多個氨基酸“X”為半胱氨酸，通過一個或多個半胱氨酸與異源部分連接，所述異源部分如標記物部分、生物活性部分(例如，治療劑)或結合部分。

本文中描述的FBS部分可通過C端半胱氨酸與治療劑偶聯而形成免疫偶聯物，如FBS-藥物偶聯物(FBS-DC；還有“adnectin-藥物偶聯物”)。

在FBS-DC中，FBS與藥物偶聯，其中FBS用作將FBS-DC導向到表達其抗原的靶細胞(如癌細胞)上的靶向劑。優選地，抗原是腫瘤相關抗原，即，由癌細胞獨特地表達或過表達的抗原。一旦在那里，藥物就在靶細胞內部或在其附近被釋放，以發揮治療劑的作用。關于對與抗體一起使用的藥物偶聯物(例如在癌癥治療中)的作用機制和用途的綜述，參見Schrama等人，Nature Rev.Drug Disc.,5:147(2006)。

適合用于藥物偶聯物中的治療劑包括抗代謝藥、烷化劑、DNA小溝結合物、DNA嵌合劑、DNA交聯劑、組蛋白去乙酰化酶抑制劑、核輸出抑制劑、蛋白酶體抑制劑、拓撲異構酶I或II抑制劑、熱休克蛋白抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、抗生素、和抗有絲分裂劑。在FBS-DC中，FBS和治療劑優選地經由可裂解的接頭偶聯，所述接頭例如肽基、二硫鍵、或腙接頭。更優選地，接頭為肽基接頭，如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val(SEQ ID NO:89)、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser、或Glu。可以根據在美國專利Nos.7,087,600；6,989,452；和7,129,261；PCT公開文本WO 02/096910；WO 07/038658；WO 07/051081；WO 07/059404；WO 08/083312；和WO 08/103693；美國專利公開文本2006/0024317；2006/0004081；和2006/0247295中描述的類似方法來制備FBS-DC；這些公開內容通過提述并入本文。接頭自身可以連接(例如共價連接、例如利用馬來酰亞胺化學)于PmXn部分的半胱氨酸(例如，共價連接)，其中至少一個X是半胱氨酸。例如，接頭可與FBS-PmXn共價連接，其中至少一個X是半胱氨酸。例如，接頭可與FBS-PmCn連接，其中P是脯氨酸，C是半胱氨酸，m和n是至少為1的整數，例如1-3。與半胱氨酸的連接可以利用馬來酰亞胺化學以本領域已知的方式進行(例如，Imperiali,B.等人，Protein Engineering:Nucleic Acids and Molecular Biology,Vol.22,pp.65-96,Gross,H.J.,ed.(2009))。為了將接頭與FBS上的半胱氨酸附接，該接頭例如可以包含馬來酰亞胺基部分，該部分然后與半胱氨酸反應而形成共價鍵。在某些實施方案中，優化半胱氨酸周圍的氨基酸以促進化學反應。例如，相對于以一段帶正電荷的氨基酸圍繞半胱氨酸，通過使帶負電荷的氨基酸圍繞半胱氨酸可以使反應更快(EP 1074563)。

關于癌癥治療，該藥物優選地是引起靶向的癌細胞死亡的細胞毒性藥物。可以在FBS-DC中使用的細胞毒性藥物包括下列類型的化合物及其類似物和衍生物：

(a)烯二炔類，如卡奇霉素(參見，例如，Lee等人，J.Am.Chem.Soc.,109:3464,3466(1987))和uncialamycin(參見，例如，Davies等人，WO 2007/038868A2(2007)和Chowdari等人，美國專利號8,709,431B2(2012))；

(b)微管溶素類(參見，例如，Domling等人，美國專利號7,778,814B2(2010)；Cheng等人，美國專利號8,394,922B2(2013)；和Cong等人，美國專利申請公開號2014/0227295A1；

(c)CC-1065和倍癌霉素(參見，例如，Boger,美國專利號6,5458,530B1(2003)；Sufi等人，美國專利號8,461,117B2(2013)；和Zhang等人，美國專利申請公開號2012/0301490A1(2012))；

(d)埃坡霉素類(參見，例如，Vite等人，美國專利申請公開號2007/0275904A1(2007)和美國專利號RE42,930E(2011))；

(e)奧利斯達汀(auristatins)類(參見，例如，Senter等人，美國專利號6,844,869B2(2005)和Doronina等人，美國專利號7,498,298B2(2009))；

(f)吡咯并苯并二氮雜卓(PBD)二聚體類(參見，例如，Howard等人，美國公開文本Nos.2013/0059800A1(2013)和2013/0028919A1(2013)；和WO 2013/041606A1(2013))；以及

(g)美登木素生物堿類，如DM1和DM4(參見，例如，Chari等人，美國專利號5,208,020(1993)和Amphlett等人，美國專利號7,374,762B2(2008))。

在某些實施方案中，FBS-PmXn，其中至少一個X是半胱氨酸，與標記物或可檢測部分連接，用于例如體外或體內檢測或成像。

可檢測標記物可以是當前在體外診斷學領域中使用的任何不同類型，包括顆粒標記物，包括金屬溶膠，如膠體金；同位素，如I¹²⁵或Tc⁹⁹，例如與N₂S₂、N₃S或N₄類型的肽螯合劑一起提供；發色團，包括熒光標志物、生物素、發光標志物、磷光標志物等，還有將給定底物轉化為可檢測標志物的酶標記物，以及通過后續擴增例如聚合酶鏈反應顯示的多核苷酸標簽。然后可通過親和素或鏈霉親和素結合檢測生物素化抗體。適合的酶標記物包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等等。例如，標記物可以是酶(堿性磷酸酶)，其可通過測定在轉化1,2二氧雜環丁烷底物，如金剛烷基甲氧基磷氧酰苯基二氧雜環丁烷(AMPPD)、3-(4-(甲氧基螺{1,2-二氧雜環丁烷-3,2′-(5′-氯)三環{3.3.1.1 3,7}癸烷}-4-基)苯基磷酸二鈉(CSPD)，還有CDP和或本領域技術人員熟知的其他發光底物，例如適合的鑭系元素鋱(III)和銪(III)的螯合物之后化學發光的存在或形成而加以檢測。

可以使用的可檢測部分包括放射性物質，如：放射性重金屬，如鐵螯合物，釓或錳的放射性螯合物，氧、氮、鐵、碳或鎵的正電子發射體，¹⁸F、⁶⁰Cu、⁶¹Cu、⁶²Cu、⁶⁴Cu、¹²⁴I、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、⁶⁶Ga、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴⁴Sc、⁴⁷Sc、¹¹C、¹¹¹In、^114mIn、¹¹⁴In、¹²⁵I、¹²⁴I、¹³¹I、¹²³I、¹³¹I、¹²³I、³²Cl、³³Cl、³⁴Cl、⁷⁴Br、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、⁷⁸Br、⁸⁹Zr、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁸⁶Y、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、⁹⁹Tc、²¹²Bi、²¹³Bi、²¹²Pb、²²⁵Ac、或¹⁵³Sm。

檢測手段由選定的標記物所決定。在標記物是微粒且以適當水平累積的情況下，利用肉眼或使用儀器，如分光光度計、發光計、熒光計等等可獲得標記物或其反應產物的外觀，這一切都遵循標準實踐。

可根據本領域中已知的方法將可檢測部分與半胱氨酸連接。當可檢測部分是放射活性劑，例如本文中進一步描述的那些放射活性劑時，通過可與半胱氨酸反應的螯合劑將可檢測部分與FBS連接，所述螯合劑例如含有馬來酰亞胺的螯合劑，如馬來酰亞胺-NODAGA或馬來酰亞胺-DBCO。馬來酰亞胺-NODAGA或馬來酰亞胺-DBCO可與FBS的C端上的半胱氨酸反應(例如，通過PmXn部分，其中至少一個X是半胱氨酸)，以分別產生FBS-NODAGA或FBS-DBCO。可以使用下列螯合劑中任一者，條件是它包含或可被修飾為包含與半胱氨酸反應的反應部分：DFO、DOTA及其衍生物(CB-DO2A、3p-C-DEPA、TCMC、Oxo-DO3A)、TE2A、CB-TE2A、CB-TE1A1P、CB-TE2P、MM-TE2A、DM-TE2A、diamsar及衍生物、NODASA、NODAGA、NOTA、NETA、TACN-TM、DTPA、1B4M-DTPA、CHX-A″-DTPA、TRAP(PRP9)、NOPO、AAZTA及衍生物(DATA)、H₂dedpa、H₄octapa、H₂azapa、H₅decapa、H₆phospa、HBED、SHBED、BPCA、CP256、PCTA、HEHA、PEPA、EDTA、TETA、和基于TRITA的螯合劑、以及其接近的類似物和衍生物。

在某些實施方案中，FBS用PET示蹤劑加以標記并用作體內成像劑。例如，FBS可用PET示蹤劑⁶⁴Cu加以標記。利用諸如馬來酰亞胺-NODAGA的螯合劑，⁶⁴Cu可與具有C端半胱氨酸的FBS連接。

示例性分子

在某些實施方案中，蛋白質包含(i)包含與SEQ ID NO:1-16中任一者至少約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列的FBS部分；和(ii)PmXn，其中P是脯氨酸，X是任何氨基酸，m是至少為1的整數，并且n是0或至少為1的整數，其中蛋白質特異性地與靶標結合(例如，以小于500nM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、500pM、100pM或更小的K_d，通過例如表面等離子體共振(SPR)，如Biacore測定)，并且，其中相對于由未修飾的FBS部分組成的蛋白質，PmXn部分改善了FBS部分的至少一種特性。

在某些實施方案中，由PmXn部分賦予的增強特性是增強的蛋白質穩定性，例如解鏈溫度(Tm)增加至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、1-15℃、2-15℃、3-15℃、5-15℃、5-15℃、1-10℃、2-10℃、3-10℃、4-10℃或5-10℃。Tm可以通過例如熱掃描熒光(TSF)或差示掃描量熱法(DSC)確定。“增加的Tm”是指統計學顯著的Tm增加。

在某些實施方案中，包含FBS部分和PmXn部分的蛋白質以至少10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml的濃度存在于組合物，例如藥物組合物中。

在某些實施方案中，包含FBS部分和PmXn部分的蛋白質主要以單體存在于組合物，例如藥物組合物中，例如，組合物中的該蛋白質的至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％呈單體形式。例如，通過在Agilent 1100或1200HPLC系統上使用Superdex柱(GE Healthcare)進行大小排阻色譜，可以確定蛋白質溶液的單體性程度，其中在A₂₁₄nm和A₂₈₀nm進行UV檢測，并進行熒光檢測(激發＝280nM，發射＝350nm)。可采用具有適當流速的100mM硫酸鈉、100mM磷酸鈉、150mM氯化鈉的緩沖液(例如，pH 6.8)的SEC柱。使用凝膠過濾標準品(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)進行分子量校準。

在某些實施方案中，包含FBS部分和PmXn部分的蛋白質具有與未修飾的FBS部分至少一樣強的生物活性。上述生物活性可以是與靶標的結合親和力，或者在某種測定中的生物活性，例如破壞腫瘤細胞的能力。在某些實施方案中，所述蛋白質的生物活性在未修飾的FBS部分的活性的5％、10％、25％、50％、100％、2倍或更多倍之內。

包含FBS和PmXn部分的蛋白質還可包括以上特征的組合。例如，蛋白質可以在高達50mg/ml的濃度是可溶的，可以至少90％單體形式存在，并且/或者具有與未修飾的FBS至少一樣強力的生物活性。

當提及增強的特性時，該增強是統計學顯著的增強。

核酸-蛋白質技術

一種迅速制造和測試具有特異性結合性質的FBS結構域的方式是Adnexus(Bristol-Myers Squibb的一家公司)的核酸-蛋白質技術。這種體外表達和標簽化技術(稱作Profusion)利用核酸-蛋白質融合(RNA-和DNA-蛋白質融合)，可用于鑒定對于與蛋白質結合而言重要的新多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白質技術是將蛋白質與其編碼遺傳信息共價偶聯的技術。關于RNA-蛋白質技術和基于纖連蛋白的支架蛋白文庫篩選方法的詳細描述參見Szostak等人，美國專利Nos.6,258,558；6,261,804；6,214,553；6,281,344；6,207,446；6,518,018；PCT公開文本Nos.WO 00/34784；WO 01/64942；WO 02/032925；和Roberts等人，Proc Natl.Acad.Sci.,94:12297-12302(1997)，通過提述將其并入本文。

載體及多核苷酸實施方案

本文中公開的包含FBS部分和PmXn部分的各種蛋白質的編碼核酸可以通過化學、酶促或重組方式合成。可以選擇密碼子用法以提高細胞中的表達。這樣的密碼子用法將取決于所選擇的細胞類型。已經開發了專門針對大腸桿菌和其他細菌、以及哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞和昆蟲細胞的密碼子用法模式。參見，例如，Mayfield等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100(2):438-442(Jan.21,2003)；Sinclair等人，Protein Expr.Purif.,26(1):96-105(Oct.2002)；Connell,N.D.,Curr.Opin.Biotechnol.,12(5):446-449(Oct.2001)；Makrides等人，Microbiol.Rev.,60(3):512-538(Sep.1996)；和Sharp等人，Yeast,7(7):657-678(Oct.1991)。

核酸操作的通用技術描述于例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，或Ausubel,F.等人，Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing and Wiley-Interscience,New York(1987)及定期的更新中，將這些文獻通過提述并入本文。編碼多肽的DNA與適合的來源于哺乳動物、病毒、或昆蟲基因的轉錄或翻譯調節元件可操作連接。這樣的調節元件包括轉錄啟動子、任選的控制轉錄的操作序列、編碼適合的mRNA核糖體結合位點的序列、和控制轉錄和翻譯的終止的序列。另外，組入在宿主中復制的能力(通常由復制起點賦予)、以及易化轉化體識別的選擇基因。

本文中描述的蛋白質不僅可以直接地重組產生，還可以以帶有異源多肽的多肽的形式產生，所述異源多肽優選是信號序列或其他在成熟蛋白或多肽的N端具有特異性切割位點的多肽。選用的異源信號序列優選是可被宿主細胞識別和加工(即，被信號肽酶切割)的信號序列。對于不識別和加工天然信號序列的原核宿主細胞，將信號序列替換為例如選自下組的原核信號序列：堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或熱穩定腸毒素II前導序列。為了酵母分泌，可將天然信號序列取代為例如酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列(包括酵母屬和克魯維酵母屬α-因子前導序列)、或酸性磷酸酶前導序列、白色念珠菌葡糖淀粉酶前導序列、或PCT公開文本WO 90/13646中描述的信號。在哺乳動物細胞表達中，可使用哺乳動物信號序列以及病毒分泌性前導序列，例如單純皰疹gD信號。這樣的前體區域的DNA可以閱讀框的方式連接于編碼蛋白質的DNA。

表達載體和克隆載體都包含使所述載體能夠在一個或多個選定的宿主細胞中復制的核酸序列。通常，在克隆載體中，這個序列是使所述載體能夠獨立于宿主染色體DNA而復制的序列，并且包括復制起點或自主復制序列。對于多種細菌、酵母、和病毒而言這樣的序列是熟知的。來自質粒pBR322的復制起點適合于大多數革蘭氏陰性細菌，2μ質粒起點適合于酵母，而各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳動物細胞中的克隆載體。通常，復制起點組分對于哺乳動物表達載體是不需要的(通常使用SV40起點僅僅是因為它含有早期啟動子)。

表達載體和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標志物。典型的選擇基因編碼這樣的蛋白質，所述蛋白質(a)賦予對抗生素或其他毒素例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四環素的抗性，(b)補足營養缺陷型缺陷，或(c)提供從復合培養基中不可得的關鍵養分，例如，編碼用于桿菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。

適合于在酵母中使用的選擇基因是trp1基因，其存在于酵母質粒YRp7中(Stinchcomb等人，Nature,282:39(1979))。trp1基因針對缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母突變株提供選擇標志物，例如，No.44076或PEP4-1.Jones,Genetics,85:12(1977)。此外，酵母宿主細胞基因組中trp1缺損的存在提供了一個有效的通過在缺乏色氨酸的情況下的生長來檢測轉化的環境。類似地，Leu2缺陷型酵母株(20,622或38,626)通過已知的攜帶Leu2基因的質粒而得到補全。

表達載體和克隆載體常常含有可被宿主生物識別、并且與編碼蛋白質的核酸可操作連接的啟動子。適合于與原核宿主一起使用的啟動子包括phoA啟動子、β-內酰胺酶和乳糖啟動子系統、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統、和雜合啟動子例如tac啟動子。然而，其他已知的細菌啟動子也是適合的。用于細菌系統中的啟動子還將包含Shine-Dalgarno(S.D.)序列，其與編碼蛋白質的DNA可操作連接。

真核生物的啟動子序列是已知的。幾乎所有的真核基因都具有富AT區，它位于轉錄起始的位點上游大約25到30個堿基處。另一個序列在許多基因的轉錄起點上游70到80個堿基處出現的是CNCAAT(SEQ ID NO:109)區，其中N可以是任何核苷酸。在大多數真核基因的3′端有AATAAA(SEQ ID NO:110)序列，它可能是向編碼序列的3′端添加多聚A尾的信號。所有這些序列都適宜地插入真核表達載體中。

適合于與酵母宿主一起使用的啟動序列的實例包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡糖異構酶和葡糖激酶的啟動子。

其他酵母啟動子，它們是擁有可通過生長條件控制轉錄這一額外優勢的誘導型啟動子，是下列酶的啟動子區：醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關的降解酶、金屬硫蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶，以及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶。適合在酵母表達中使用的載體和啟動子在歐洲專利公開文本73,657以及PCT公開文本WO 2011/124718和WO 2012/059486中有進一步描述。將酵母增強子與酵母啟動子一起使用也是有利的。

在哺乳動物宿主細胞中，來自載體的轉錄可以受到例如獲自病毒(如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙型肝炎病毒，以及最優選地，猴病毒40(SV40))的基因組中的啟動子、獲自異源哺乳動物的啟動子(例如啟動子或免疫球蛋白啟動子)、獲熱休克啟動子的控制，只要這樣的啟動子與宿主細胞系統相容即可。

SV40病毒的早期啟動子和晚期啟動子可方便地作為SV40限制性片段獲得，該片段還包含SV40病毒復制起點。人巨細胞病毒的立即早期啟動子可方便作為HindIII E限制性片段獲得。美國專利號4,419,446中公開了利用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達DNA的系統。在美國專利號4,601,978中描述了對這個系統的修改。關于人β干擾素cDNA在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子控制下在小鼠細胞中的表達，還參見Reyes等人，Nature,297:598-601(1982)。或者，可使用勞斯肉瘤病毒長末端重復序列作為啟動子。

經常通過向載體中插入增強子序列來增加高等真核生物對編碼蛋白質的DNA的轉錄。目前已知許多來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α甲胎蛋白、和胰島素)的增強子序列。然而，通常將使用來自真核細胞病毒的增強子。實例包括位于復制起點晚期側(late side)(bp 100-270)的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、位于復制起點晚期側(late side)的多瘤病毒增強子、以及腺病毒增強子。關于真核生物啟動子活化的增強元件，還參見Yaniv,Nature,297:17-18(1982)。增強子可拼接到載體中多肽編碼序列5′或3′位置，但優選位于啟動子的5′的某個位點。

在真核宿主細胞(例如，酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類、或來自其他多細胞生物的有核細胞)中使用的表達載體還將含有對于終止轉錄和穩定化mRNA必需的序列。這樣的序列通常可從真核生物或病毒DNA的5′(有時還有3′)非翻譯區或cDNA得到。這些區域含有轉錄為編碼多肽的mRNA的非翻譯部分中的多腺苷酸化片段的核苷酸區段。一種有用的轉錄終止組分是牛生長激素多腺苷酸化區。參見WO 94/11026及其中所公開的表達載體。

重組DNA也可包括任何類型的可用于純化蛋白質的蛋白質標簽序列。蛋白質標簽的實例包括，但不限于，組氨酸標簽、標簽、myc標簽、HA標簽、或GST標簽。用于細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主的適當克隆與表達載體可見于：Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,New York(1985)，該文獻的相關公開內容通過提述并入本文。

可使用適合于宿主細胞的方法將表達構建體導入宿主細胞中，這對于本領域技術人員是容易想到的。將核酸導入宿主細胞中的各種方法是本領域中已知的，包括，但不限于，電穿孔；使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質轉染；微粒轟擊；脂質體轉染；及感染(其中載體為感染介質)。

適合的宿主細胞包括原核生物、酵母、哺乳動物細胞、或細菌細胞。適合的細菌包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如，大腸桿菌或芽孢桿菌屬物種。酵母，優選地來自酵母屬物種的酵母如釀酒酵母，也可用于產生多肽。還可使用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統來表達重組蛋白質。用于在昆蟲細胞中產生異源蛋白質的桿狀病毒系統由Luckow等人(Bio/Technology,6:47(1988))綜述。適合的哺乳動物宿主細胞系的實例包括內皮細胞、COS-7猴腎細胞、CV-1、L細胞、C127、3T3、中華倉鼠卵巢(CHO)、人胚腎細胞、HeLa、293、293T、和BHK細胞系。通過培養適合的宿主/載體系統來表達重組蛋白而制備純化的蛋白質。然后從培養基或細胞提取物中純化FBS蛋白。

蛋白質產生

用本文中描述的用于產生蛋白質的表達或克隆載體轉化宿主細胞，并在常規營養培養基中培養宿主細胞，所述營養培養基經過改良以適應誘導啟動子、選擇轉化體、或擴增編碼期望序列的基因。

可在各種培養基中培養用于產生蛋白質的宿主細胞。可商購的培養基，如Ham's F10(Sigma)、最小必需培養基((MEM)、(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco's Modified Eagle's Medium((DMEM)、(Sigma))適合于培養宿主細胞。另外，在Ham等人，Meth.Enzymol.,58:44(1979),Barnes等人，Anal.Biochem.,102:255(1980),美國專利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；PCT公開文本WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利號RE30,985中描述的培養基中任一者可用作宿主細胞的培養基。在需要時，可對任何這些培養基補充激素和/或其他生長因子(如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(如氯化鈉、鈣、鎂、和磷酸鹽)、緩沖液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如慶大霉素藥物)、微量元素(定義為無機化合物，通常以在微摩爾范圍內的終濃度存在)、以及葡萄糖或等效能源。還可包括適當濃度的本領域技術人員已知的任何其他必要的補充劑。培養條件，諸如溫度、pH值等，是先前用于經選擇用于表達的宿主細胞的那些條件，且對于普通技術人員而言是容易想到的。

還可使用無細胞翻譯系統產生本文中公開的蛋白質。為了這樣的目的，必須修飾編碼蛋白質的核酸，以允許體外轉錄而產生mRNA并允許mRNA在所用的特定無細胞系統(真核無細胞翻譯系統例如哺乳動物或酵母無細胞翻譯系統，原核無細胞翻譯系統例如細菌無細胞翻譯系統)中進行無細胞翻譯。

也可通過化學合成產生蛋白質(例如，通過在Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，The Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984))中描述的方法)。蛋白質的修飾也可通過化學合成產生。

本文中公開的蛋白質可通過蛋白質化學領域中通常已知的用于蛋白質的分離/純化方法來純化。非限制性實例包括萃取、重結晶、鹽析(例如，使用硫酸銨或硫酸鈉)、離心、透析、超濾、吸附色譜法、離子交換色譜法、疏水色譜法、正相色譜法、反相色譜法、凝膠過濾、凝膠滲透色譜法、親和色譜法、電泳、逆流分布法或這些方法的任何組合。純化后，可通過本領域已知的多種方法中的任何方法，包括但不限于，過濾和透析，將蛋白質交換到不同的緩沖液中和/或濃縮。

經純化的蛋白質優選為至少85％純，更優選為至少95％純，且最優選為至少98％或99％純。不論純度的精確數值，蛋白質的純度足以用作醫藥產品。

示例性用途

修飾的FBS蛋白可以應用于未通過添加PmXn部分被修飾的FBS蛋白能夠應用的任何目的。

在一個方面，本申請提供了包含可用于治療病癥的修飾FBS部分的蛋白質。可以治療的疾病或病癥將由FBS部分的結合特異性來定義。如本文中描述的，修飾的FBS部分可被設計為與任何感興趣的靶標結合。示例性的靶標包括，例如，TNF-α、VEGFR2、PCSK9、IL-23、EGFR和IGF1R。只是作為例子，與TNF-α結合的修飾的FBS部分可用于治療自身免疫病癥，如類風濕關節炎、炎性腸病、銀屑病、和哮喘。本文中描述的修飾的FBS蛋白還可用于治療癌癥。

在某些實施方案中，用于治療患有諸如癌癥之類的疾病的受試者的方法包括向受試者給予修飾的FBS-藥物偶聯物。

本文中提供了用于向受試者給予蛋白質的方法。在一些實施方案中，受試者是人。在一些實施方案中，所述蛋白質對于哺乳動物尤其是人類是藥學上可接受的。“藥學上可接受的”組合物是指給予動物而無顯著不良醫療后果的組合物。藥學上可接受的組合物的實例包括包含缺乏整聯蛋白結合結構域(RGD)的FBS部分的組合物、以及基本上不含內毒素或熱原或具有極低內毒素或熱原水平的組合物。

本文中描述的修飾的FBS蛋白的其他用途包括它們在體外或體內檢測測定法中的用途。例如，它們可用于檢測樣品中的靶分子。方法可包括使該樣品與本文中描述的修飾的FBS接觸，其中所述接觸在允許FBS-靶標復合物形成的條件下進行；和檢測所述復合物，由此檢測所述樣品中的所述靶標。可使用任何本領域公認的技術進行檢測，例如放射線照相術、免疫測定法、熒光檢測、質譜法、或表面等離子體共振。樣品可來自人或其他哺乳動物。對診斷目的而言，適當的作用劑是包括用于全身成像的放射性同位素的可檢測標記物，以及用于樣品測試的放射性同位素、酶、熒光標記物和其他適合的抗體標簽。

在某些實施方案中，本文中描述的修飾的FBS可用于多種診斷和成像應用中。在某些實施方案中，用體內可檢測的部分標記修飾的FBS，并且如此標記的FBS可用作體內成像劑，例如用于全身成像的體內成像劑。例如，在一個實施方案中，用于檢測受試者體內含有給定抗原的腫瘤的方法包括：向受試者給予與可檢測標記物連接的修飾的FBS，并且在適當的時間后檢測受試者體內的標記物。

FBS成像劑可以用來診斷與給定抗原水平增加相關的病癥或疾病，例如癌癥，其中腫瘤選擇性地過表達所述抗原。以類似的方式，與給定抗原特異性地結合的修飾的FBS可以用來監測正在由于與該抗原相關的狀況而接受治療的受試者體內該抗原的水平。修飾的FBS可以修飾后也可以不修飾而使用，并且可以通過共價或非共價附接可檢測部分加以標記。

制劑和施用

本申請進一步提供了包含本文中描述的蛋白質的藥學上可接受的組合物，其中所述組合物基本上不含內毒素和/或熱原。

通過將所描述的具有期望純度的蛋白質與任選的生理學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑混合而制備用于儲存的包含蛋白質的治療制劑(Osol,A.編輯，Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版(1980))，其呈水溶液、凍干或其他干燥制劑的形式。采用劑量和濃度的可接受的載體、賦形劑、或穩定劑對于接受者是無毒的，并且包括諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其他有機酸的緩沖劑；包括抗壞血酸和甲硫氨酸在內的抗氧化劑；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁醇或芐醇；烷基對羥基苯甲酸酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸、或賴氨酸；單糖類、二糖類、和其他碳水化合物類，包括葡萄糖、甘露糖、或葡聚糖；螯合劑，如EDTA；糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子，如鈉；金屬復合物(例如，Zn-蛋白質復合物)；和/或非離子型表面活性劑，如吐溫、或聚乙二醇(PEG)。

在被治療的特殊適應癥需要時，本文中的制劑還可含有一種以上的活性化合物，優選地，所述活性化合物具有彼此無不良影響的互補活性。這樣的分子以對預期目的有效的量適當地組合存在。

還可例如通過凝聚技術或通過界面聚合而將蛋白質包埋在制備的微膠囊中，例如分別在膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠囊)或在粗乳液中的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚甲基丙烯酸甲酯微膠囊。這樣的技術公開于Osol,A.編輯，Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版(1980)中。

用于體內給藥的制劑必須是無菌的。這通過無菌過濾膜容易實現。

可以制備緩釋制劑。緩釋制劑的適合實例包括含有本文中描述的蛋白質的固體疏水聚合物的半透性基質，所述基質呈成形物品的形式，例如薄膜、或微膠囊。緩釋基質的實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美國專利號3,773,919)、L-谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸鹽的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林組成的注射微球)、和聚-D-(-)-3-羥丁酸。雖然諸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能夠使分子釋放持續100天，但某些水凝膠釋放蛋白質持續較短的時期。當封裝的蛋白質在體內長時間保留時，它們可能由于暴露于37℃的濕氣而變性或凝集，導致生物活性的喪失和可能的免疫原性變化。可以根據所涉及的機制針對穩定化設計合理的策略。例如，如果發現凝集機制為通過巰基二硫鍵轉換的分子間S--S鍵形成，可通過修飾巰基殘基、凍干酸性溶液、控制含濕量、使用適當的添加劑、和開發特定的聚合物基質組成而實現穩定化。

雖然技術人員將理解，每種蛋白質的劑量將取決于蛋白質的個性(identity)，優選的劑量范圍可以為從約10mg/平方米到約2000mg/平方米，更優選從約50mg/平方米到約1000mg/平方米。

為了治療應用，以藥學上可接受的劑型向受試者給予蛋白質。所述蛋白質可以推注的方式或通過在一定時段中以連續方式靜脈內給予，通過肌內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、局部、或吸入途徑給予。還可以通過瘤內、腫瘤周圍、病灶內、或病灶周圍途徑給予蛋白質，以發揮局部以及全身性療效。適合的藥學上可接受的載體、稀釋劑、和賦形劑是熟知的，并且在臨床情況允許的情況下可由本領域的技術人員確定。適合的載體、稀釋劑和/或賦形劑包括：(1)杜爾貝科(Dulbecco)磷酸鹽緩沖鹽水，pH約7.4，含有1mg/ml到25mg/ml的人血清白蛋白，(2)0.9％鹽水(0.9％w/v NaCl)、和(3)5％(w/v)右旋糖。本發明的方法可以在體外、體內、或離體實施。

蛋白質、和一種或多種另外的治療劑的給藥，無論是聯合給藥還是依次給藥，可如上文針對治療應用的描述來進行。技術人員將了解，用于聯合給藥的適合的藥學上可接受的載體、稀釋劑、和賦形劑取決于聯合給藥的具體治療劑的個性(identity)。

當以除了凍干劑型之外的含水劑型存在時，一般將蛋白質配制為約0.1mg/ml到100mg/ml的濃度，不過也允許這些范圍之外的廣泛變化。對于疾病的治療，適當的蛋白質劑量將取決于有待治療的疾病的類型、該疾病的嚴重性和病程、所述蛋白質是為預防目的還是治療目的、先前治療的過程、患者的臨床病史和對融合物的反應、以及主治醫師的裁量。適當地以一次或經過一系列治療向患者施用蛋白質。

示例性實施方案

1.一種分離的特異性地與靶標結合的基于纖連蛋白的支架(FBS)蛋白，其中所述FBS是非天然存在的FBS，并且其中該FBS在其C端與由氨基酸序列PmXn組成的部分連接，其中P是脯氨酸，X是任何氨基酸，m是至少為1的整數，n是0或至少為1的整數，并且其中PmXn部分對FBS蛋白提供了相對于未與PmXn部分連接的FBS蛋白增強的特性。

2.實施方案1的分離的FBS蛋白，其中該部分由P組成(m是1并且n是0)。

3.實施方案1的分離的FBS蛋白，其中該部分由PP組成(m是2并且n是0)。

4.實施方案1的分離的FBS蛋白，其中該部分由PmXn組成，其中n是1-150。

5.實施方案1的分離的FBS蛋白，其中該部分由PmXn組成，其中n是1-10。

6.實施方案1的分離的FBS蛋白，其中該部分由PmXn組成，其中n是1-5。

7.實施方案1的分離的FBS蛋白，其中該部分由PI、PC、PID、PIE、PIDK(SEQ ID NO:61)、PIEK(SEQ ID NO:63)、PIDKP(SEQ ID NO:65)、PIEKP(SEQ ID NO:67)、PIDKPS(SEQ ID NO:69)、PIEKPS(SEQ ID NO:71)、PIDKPC(SEQ ID NO:73)、PIEKPC(SEQ ID NO:75)、PIDKPSQ(SEQ ID NO:77)、PIEKPSQ(SEQ ID NO:79)、PIDKPCQ(SEQ ID NO:81)、PIEKPCQ(SEQ ID NO:83)、PHHHHHH(SEQ ID NO:87)或PCHHHHHH(SEQ ID NO:86)組成。

8.實施方案1-7的任一項的分離的FBS蛋白，其中該FBS蛋白是Fn3蛋白。

9.實施方案8的分離的FBS蛋白，其中該Fn3蛋白是¹⁰Fn3蛋白。

10.實施方案9的分離的FBS蛋白，其中該¹⁰Fn3蛋白是人¹⁰Fn3蛋白。

11.實施方案1-10的任一項的分離的FBS蛋白，其包含與SEQ ID NO:1具有至少50％同一性的氨基酸序列。

12.實施方案1-11的任一項的分離的FBS蛋白，其在至少一個環區或一個支架區中包含至少一個氨基酸突變。

13.實施方案1-12的任一項的分離的FBS蛋白，其包含氨基酸序列VSDVPRDLEVVAA(X)_uLLISW(X)_vYRITY(X)_wFTV(X)_xATISGL(X)_yY TITVYA(X)_zISINYRT(SEQ ID NO:9)，其中(X)_u、(X)_v、(X)_w、(X)_x、(X)_y和(X)_z由野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:1)組成或相對于相應野生型序列包含至少一個氨基酸差異，并且該序列任選地包含1-10個支架、N端和/或C端突變。

14.實施方案1-13的任一項的分離的FBS蛋白，其包含與SEQ ID NO:1至少50％相同的氨基酸序列，其中FBS蛋白的C端氨基酸殘基與由PmXn組成的部分融合，其中FBS蛋白以小于500nM的Kd與靶標特異性地結合，所述靶標不被包含SEQ ID NO:1的野生型¹⁰Fn3分子所結合。

15.實施方案14的分離的FBS蛋白，其包含與SEQ ID NO:1至少70％相同的氨基酸序列。

16.實施方案1-15的任一項的分離的FBS蛋白，其中由PmXn組成的部分通過肽鍵與FBS蛋白的C端氨基酸殘基連接。

17.實施方案1-16的任一項的分離的FBS蛋白，其中PmXn是P或PC。

18.實施方案1-17的任一項的分離的FBS蛋白，其包含與SEQ ID NO:1至少60％相同的氨基酸序列，其中FBS蛋白的C端氨基酸殘基通過肽鍵與脯氨酸連接，其中FBS蛋白以小于500nM的Kd與靶標特異性地結合，所述靶標不被包含SEQ ID NO:1的野生型¹⁰Fn3分子所結合。

19.實施方案1-18的任一項的分離的FBS蛋白，其中PmXn的至少一個X是半胱氨酸并且其中該半胱氨酸

20.實施方案19的分離的FBS蛋白，其中該半胱氨酸與異源部分偶聯。

21.實施方案20的分離的FBS蛋白，其中該異源分子是可檢測部分。

22.實施方案20或21的分離的FBS蛋白，其中該異源分子是藥物部分，并且該藥物部分和FBS形成FBS-藥物偶聯物。

23.實施方案1-22的任一項分離的FBS蛋白，其中由PmXn部分賦予的增強特性是增強的穩定性。

24.實施方案23的分離的FBS蛋白，其中增強的穩定性是Tm增加至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃或更多。

下列代表性實施例包含適用于本發明在其不同的實施方案及其等同方案中的實踐的重要附加信息、范例和指導。這些實施例旨在幫助說明本發明，而不意圖構成也不應解釋為對本發明范圍的限制。

實施例

實施例1：通過在¹⁰Fn3分子的C端添加脯氨酸而增強熱穩定性

在自然界中，¹⁰Fn3是一長串纖連蛋白III型結構域中的一部分；緊接在¹⁰Fn3下游的結構域被命名為¹¹Fn3。以下序列顯示了¹⁰Fn3的野生型序列(斜體)和¹¹Fn3(粗體)結構域，以及它們之間的接合部(加下劃線)。

基于¹⁰Fn3的晶體和NMR結構以及在¹⁰Fn3與¹¹Fn3之間的序列比對(Dickinson等人，"Crystal structure of the tenth type III cell adhesion module of human fibronectin",J.Mol.Biol.,36:1079-1092(1994))，這個序列的頭兩個殘基，RT，是¹⁰Fn3的最后β鏈(“鏈G”)的一部分，并且該序列的剩余部分EIDKPSQ是一個柔性接頭，位于結構化的纖連蛋白III型第十和第十一結構域之間。

基于¹⁰Fn3的工程化的蛋白質結構域的C端常常自野生型序列加以修飾，以幫助其克隆、表達和純化。在針對不同的Adnectin的工程化C端的調查中發現，從RTE到RTP的突變導致了幾種不同的Adnectin的熱穩定性增加。表4列出了在本研究中使用的不同C端。

表4：在¹⁰Fn3和¹¹Fn3之間的野生型接頭以及在本研究中進行比較的工程化Adnectin C端序列。“具有P和His標簽的短的工程化C端”和“具有PC的短的工程化C端”含有RTE到RTP的突變。

通過比較幾對在C端有差異的Adnectin，測試了從RTE到RTP突變對Adnectin熱穩定性的影響。表5描述了在本研究中使用的幾對Adnectin，包括其名稱、靶標、和熱力學特性。Adnectin 1為與靶標X結合的Adnectin。所有列出的Adnectin均是使用PROfusion(mRNA-展示)技術從高復雜度文庫中選擇的，并通過定向誘變將其C端再工程化。全蛋白質序列列出如下。

表5：克隆名稱、C端、靶標、和解鏈溫度(如通過差示掃描量熱法在0.5mg/ml在PBS(pH 7.4)中測定的)。Adnectin PRD-1414和PRD-1417與40kDa的2分支的PEG(NOF,Cat.#GL2-400MA01)偶聯

在本實施例中使用的蛋白質的氨基酸序列：

ADX_2382_D09:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAEGYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGVDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISINYRTEIDKPSQHHHHHH*(SEQ ID NO:96)

ADX_5484_A03:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAEGYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGVDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISINYRTPHHHHHH*(SEQ ID NO:97)

ADX_2987_H07:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWTLPHAGRAHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATISGLKPGVDYTITVYAVTVTTTKVIHYKPISINYRTEIDKPSQHHHHHH*(SEQ ID NO:97)

ADX_5484_A04:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWTLPHAGRAHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATISGLKPGVDYTITVYAVTVTTTKVIHYKPISINYRTPHHHHHH*(SEQ ID NO:98)

PRD-1414:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAEGYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGVDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISINYRTEC*(SEQ ID NO:99)

PRD-1417:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAEGYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGVDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISINYRTPC*(SEQ ID NO:100)

在以上每個序列中的“*”表示終止密碼子，以及每個Adnectin的C端。

在每種蛋白質的細菌表達過程中，N端M被去除。在表征每種蛋白質之前，純化的PRD-1414和PRD-1417蛋白中的C殘基與PEG偶聯。

如表5中所示，具有在C端含有脯氨酸取代野生型谷氨酸(RTE到RTP突變)的C端的Adnectin顯示出更高的熱穩定性。對于幾個實施例，當以人¹⁰Fn3和¹¹Fn3之間的天然接頭為模型的較長C端被取代為僅含有脯氨酸和六聚組氨酸純化標簽的較短的工程化C端時，觀察到這種穩定性的增加。在具有短的工程化C端和聚乙二醇(PEG)的¹⁰Fn3蛋白中，在添加C端脯氨酸之后，也觀察到熱穩定性的提高。這種穩定性的增加可能因為該特定位置上的脯氨酸的存在。

實施例2：具有C端脯氨酸的第二PCSK9Adnectin的穩定化

這個實施例顯示，通過添加C端脯氨酸也增強了另一種PCSK9adnectin分子的熱穩定性。

在這個實施例中，聚乙二醇化的(40kDa分支的PEG)PCSK9adnectin ADX_2013_E01的C端來自NYRTEIEKPCQ(SEQ ID NO:101)到NYRTPC(SEQ ID NO:102)的修飾，并通過TSF測量穩定性。這種adnectin的氨基酸序列提供在WO 2011/130354中。這些結果指示，具有NYRTEIEKPCQ(SEQ ID NO:101)C端的聚乙二醇化的adnectin具有70℃的Tm，而具有NYRTPC(SEQ ID NO:102)C端的聚乙二醇化的adnectin具有76℃的Tm。

因此，這種PCSK9adnectin的熱穩定性由于C端脯氨酸的存在而提高了6℃。

實施例3：不同的C端關于熱穩定性的比較

本實施例顯示了在其C端有或沒有脯氨酸的adnectin以及在其C端具有2個脯氨酸的adnectin的熱穩定性的比較。

對于兩種實施例1中描述的adnectin(與PCSK9結合的ADX_2392_D09和與肌肉生長抑制素結合的ADX_2987_H07)以及另一種與不同的靶標結合的Adnectin(Adnectin 1，與靶標X結合)，修飾它們的C端，如表6中所示，并確定了它們的熱穩定性和單體％。針對不同靶標(X)的Adnectin(“Adnectin1”)也用相同的C端序列加以修飾。通過TSF確定熱穩定性并通過SEC確定單體％。

表6：具有不同C端的adnectin的單體百分比和熱穩定性

如表6所示的結果表明，C端的身份對單體％沒有顯著影響，然而，它對解鏈溫度(Tm)有影響。如實施例1中描述的，對兩種adnectin而言，NYRTPH₆(SEQ ID NO:105)相對于NYRTH₆(SEQ ID NO:104)都增加了熱穩定性：對PCSK9adnectin增加了4℃，對肌肉生長抑制素adnectin增加了6℃。另外，第二個脯氨酸的存在提供了與單一脯氨酸所提供的相似的穩定作用。

因此，相對于沒有C端脯氨酸的相同分子，一個或兩個C端脯氨酸的存在增強了adnectin的熱穩定性。

實施例4：C端脯氨酸的添加提高了溶解度

本實施例證明，相對于沒有C端脯氨酸的相同串聯adnectin，C端脯氨酸的存在提高了串聯adnectin的溶解度。

串聯adnectin，即，由接頭連接的兩個adnectin，其各自與不同靶標結合并含有NYRTE(SEQ ID NO:107)C端或NYRTP(SEQ ID NO:108)C端，在大腸桿菌BLR細胞中表達并且在30℃發酵。沒有脯氨酸的串聯物的效價為1.2g/L可溶蛋白和2.8g/L總蛋白，表明所表達的蛋白質的43％可溶。具有脯氨酸的串聯物的效價為2.56g/L可溶蛋白和2.61g/L總蛋白。即使在使沒有脯氨酸的串聯物的不溶部分復性、并且獲得98％純和2.5mg/ml的單體的溶液之后，此蛋白質組成亦未顯示出與其靶標的顯著結合，表明它可能沒有正確地重折疊。

因此，鑒于在兩種蛋白質之間的唯一差異是在C端分別存在E和P，這些結果表明脯氨酸的存在為串聯物提供了提高的溶解度。

在背景、詳述、附圖簡述、和實施例中引證的每篇文獻(包括專利、專利申請、期刊論文、摘要、實驗手冊、書籍、登錄號、登錄號、或其他公開內容)的全部公開內容特此通過提述完整并入本文。

本發明在范圍上不受本文中公開的具體實施方案的限制，這些實施方案旨在作為本發明的單獨方面的簡單說明，并且在功能上等效者均在本發明的范圍內。根據前述說明和教導，除了在本文中描述的那些之外，對本發明的模型和方法的多種修改對于本領域技術人員是顯而易見的，并且類似地預期落入本發明的范圍內。可以實施這樣的修改或其他實施方案而不脫離本發明的真正范圍和精神。