本發(fā)明屬于化工分離技術領域，具體涉及一種大豆凝集素的分離純化方法，尤其涉及一種反膠束分離純化大豆凝集素的方法。
背景技術：
凝集素(lectin或agglutinin)是一類具有糖專一性，可與細胞表面特殊糖蛋白、糖脂的寡糖結構結合，促使細胞凝集或糖復合物沉淀的，非免疫來源的糖蛋白或糖結合蛋白。凝集素用途廣泛，在生物化學研究中可用于含糖高分子的分離純化和糖鏈結構的鑒定；在生物學研究中可專一識別細胞表面信號分子，用于選擇突變細胞株、研究細胞機制和細胞表面特征及鑒定微生物；在免疫學研究中可促細胞有絲分裂，抑制腫瘤等惡性細胞的生長；在醫(yī)學上可鑒定血型，診斷病變和作為載體分子使藥物專一地靶向不同的細胞和組織。因此，凝集素在現(xiàn)代科研領域是一種重要的研究工具，凝集素的分離純化具有極為誘人的科研價值和市場前景。
凝集素的研究始于1888年Herman Stillmark偶然發(fā)現(xiàn)蓖麻毒素(Ricicn)。至今已發(fā)現(xiàn)的凝集素以植物凝集素類為主，近1000種，廣泛分布于豆科、茄科、大戟科、禾木科、百合科和石蒜科等眾多的植物類群中，其中以豆科植物中的凝集素種類最為豐富，目前已有600余種。大豆是我國主要的油料作物之一，在世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和貿(mào)易中占有重要地位。對于食用豆類中含量較少的一些抗營養(yǎng)因子，如凝集素、胰蛋白酶抑制劑等的研究報道較少。鑒于凝集素具有很好的發(fā)展前景，因此，大豆凝集素的分離和純化研究有著重要的現(xiàn)實意義。
目前，凝集素的分離純化方法基本按照蛋白質的傳統(tǒng)分離方法進行，一般先將提取物經(jīng)酸沉或鹽析，然后經(jīng)陰離子和陽離子交換多次層析。在凝集素糖結合專一性已知的情況下，可利用親和層析法進行分離純化。程悅生等(1997)利用凝集素特殊的疏水結合位點，采用疏水相互作用色譜法分離得到大豆凝集素；200510011480.2通過不同飽和度的硫酸銨分級沉淀及多步的離子交換柱層析，得到一種黃芪凝集素蛋白；200610097429.2通過超聲強化酸提、鹽析、熱處理、超濾、親和層析等技術手段獲得麥胚凝集素；201110114904.3公開了一種純化大豆凝集素的親和層析填料D-GalN-FF-sepharose4B；201110025266.8用硫酸銨分級沉淀、超濾除鹽和濃縮、離子交換層析等方法純化得到一種蒜頭果仁凝集素。但是，以上方法還尚未擺脫凝集素分離純化過程中存在的操作繁瑣、處理量低、損耗大和耗時長(一般為1～3天)的不足之處。因此，建立快速、高效的凝集素分離純化技術勢在必行。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，解決大豆凝集素分離純度低、成本高、工藝多、時間長的問題，提供一種高效率、易于操作、成本低且安全環(huán)保的反膠束分離純化大豆凝集素的方法。
本發(fā)明解決技術問題所采用的技術方案為：
一種反膠束分離純化大豆凝集素的方法，具體包括以下步驟：
(1)大豆凝集素水提液制備：將豆類磨成粉，過40～100目篩，溶于蒸餾水中，10～60℃下超聲輔助浸提5～60min，浸提后經(jīng)8000～15000rpm、4℃離心10～20min，取上清液即為大豆凝集素水提液，所述蒸餾水與大豆粉的體積比為5～50：1；
(2)反膠束溶液配制：將表面活性劑和助溶劑甘油加入到有機溶劑中，攪拌至表面活性劑完全溶解，再加入水，使體系Wo值＝15～35，表面活性劑濃度為200～300mM，靜置所得透明溶液即為反膠束溶液，所述助溶劑的添加量為反膠束溶液總量的0～10％，所述Wo表示反膠束溶液中水與表面活性劑的摩爾濃度比值，Wo≈[H2O]/[表面活性劑]；
(3)前萃取過程：調節(jié)步驟(1)所得大豆凝集素水提液pH值為4.0～6.0，離子強度為20～200mM，鹽離子類型優(yōu)選NaCl，將其與反膠束溶液按照體積比為1:1～50的比例搖床震蕩混合5～40min后，1500～5000rpm離心分層，取上層有機相；
(4)反萃取過程：將步驟(3)所得上層有機相與丙酮、蒸餾水混合5～40min后，1500～5000rpm離心分層，取下層水相，經(jīng)冷凍干燥，得到分離純化后的大豆凝集素，所述步驟(3)所得上層有機相與丙酮、蒸餾水的體積比為1：1～5：1～5。
作為優(yōu)選，步驟(1)中所述豆類種類為選自黃豆、青豆和黑豆中的至少一種。
作為優(yōu)選，步驟(2)中所述有機溶劑選自戊烷、環(huán)己烷、正己烷、辛烷、異辛烷、己醇和丁醇中的至少一種。
更優(yōu)選，步驟(2)中所述有機溶劑為異辛烷。
作為優(yōu)選，步驟(2)中所述表面活性劑為結構修飾過的松樹皮提取物，具體制備方法如下：
將松樹皮提取物溶于丙酮中，于-10℃下加入吡啶，再緩慢滴加脂肪酰氯，反應1～8h后加水稀釋反應液，分出有機相，剩余水相用乙酸乙酯萃取后，合并所得有機相，得到酯化接枝松樹皮提取物溶液；依次用1mol/L HCl、飽和Na2CO3溶液、飽和NaCl溶液洗滌，真空干燥得到表面活性劑，所述HCl、飽和Na2CO3溶液和飽和NaCl溶液的體積用量均為酯化接枝松樹皮提取物溶液體積的1～4倍。
更優(yōu)選，所述松樹皮提取物含有95％的原花青素低聚物，分子量范圍為578～1762。
更優(yōu)選，所述脂肪酰氯選自己酰氯、辛酰氯、月桂酰氯、肉豆蔻酰氯、油酸酰氯和硬脂酸酰氯中的至少一種。
更優(yōu)選，所述松樹皮提取物、丙酮、脂肪酰氯和乙酸乙酯的質量之比為1:1～4：0.8～2.6：1～4，松樹皮提取物的質量與吡啶的質量之比為1:0.5～1.6。
本發(fā)明中凝集素含量采用血凝法測定，大豆凝集素的評價標準為：
本發(fā)明具有如下有益效果：
(1)本發(fā)明所提供的大豆凝集素分離純化方法所需時間短，對設備要求低，實施成本小、操作快速簡便，易于連續(xù)化生產(chǎn)和工業(yè)化放大，分離純化和濃縮可同時完成，大豆凝集素純度達到85％以上，收率達到85％以上。
(2)本發(fā)明大豆凝集素被表面活性劑和水分子所保護，不易失活，且純度高，后續(xù)僅需一步簡單的離子交換色譜法或層析法即可獲得高純品。
(3)本發(fā)明所制備的表面活性劑，反膠束萃取凝集素時，可對凝集素進行選擇性的可逆結合。
(4)本發(fā)明所用萃取溶劑均可重復利用，節(jié)約成本，降低環(huán)境污染，為一種綠色、環(huán)保的生物活性物質提取方法。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實施例1：
(1)表面活性劑制備過程：
取松樹皮提取物50g，溶于50g的丙酮，于‐10℃下加入35g吡啶作為敷酸劑，再緩慢滴加50g己酰氯，反應1h后加水稀釋反應液。分出有機相，水相用50g乙酸乙酯萃取，合并有機相，得到酯化接枝松樹皮提取物溶液；依次用1倍體積的1mol/L HCl、飽和Na2CO3溶液、飽和NaCl溶液洗滌，真空干燥得到表面活性劑。
(2)大豆凝集素水提液制備：取50g優(yōu)質黃豆磨粉，過40目篩，溶于250mL蒸餾水中，10℃下超聲輔助浸提60min(120W)，浸提后經(jīng)12000rpm、4℃離心15min，取上清液；
(3)反膠束溶液配制：將45g表面活性劑和2g助溶劑甘油完全溶于65g異辛烷中，加入14g水使反膠束溶液濃度約為200mM，體系Wo值為35，本實施例中加入助溶劑甘油，約占總量的1.6％；
(4)前萃取過程：調節(jié)大豆凝集素水提液pH值為4.0，以NaCl調節(jié)水提液的離子強度為20mM，將大豆凝集素水提液與反膠束溶液按照體積比為1:1的比例混合，搖床震蕩混合10min后，1500rpm離心分層10分鐘，取上層有機相；
(5)反萃取過程：將上述上層有機相與1倍體積的丙酮和2倍體積的蒸餾水混合，搖床震蕩混合10min后，1500rpm離心分層10分鐘，取下層水相，經(jīng)冷凍干燥得到分離純化后的黃豆凝集素。
本實驗用血凝法來測定凝集素含量，大豆凝集素的純度達到89％，收率為88％。
實施例2：
(1)表面活性劑制備過程：
取松樹皮提取物50g，溶于200g的丙酮，于‐10℃下加入50g吡啶作為敷酸劑，再緩慢滴加60g辛酰氯，反應2h后加水稀釋反應液。分出有機相，水相用50g乙酸乙酯萃取，合并有機相，得到酯化接枝松樹皮提取物溶液；依次用1.5倍體積的1mol/L HCl、飽和Na2CO3溶液、飽和NaCl溶液洗滌，真空干燥得到表面活性劑。
(2)大豆凝集素水提液制備：取50g優(yōu)質青豆磨粉，過70目篩，溶于500mL蒸餾水中，25℃下超聲輔助浸提30min(120W)，浸提后經(jīng)12000rpm、4℃離心15min，取上清液；
(3)反膠束溶液配制：將70g表面活性劑和5g助溶劑甘油完全溶于65g戊烷中，加入11g水，使反膠束溶液濃度約為250mM，體系Wo值約為20；
(4)前萃取過程：調節(jié)大豆凝集素水提液pH值為5.0，以NaCl調節(jié)水提液的離子強度為100mM，將大豆凝集素水提液與反膠束溶液按照體積比為1:20的比例混合，搖床震蕩混合20min后，3000rpm離心分層10分鐘，取上層有機相；
(5)反萃取過程：將上述上層有機相與2倍體積的丙酮和1倍體積的蒸餾水混合，搖床震蕩混合20min后，3000rpm離心分層10分鐘，取下層水相，經(jīng)冷凍干燥得到分離純化后的青豆凝集素。
用血凝法來測定凝集素含量，大豆凝集素的純度達到88％，收率為86％。
實施例3：
(1)表面活性劑制備過程：
取松樹皮提取物50g，溶于150g的丙酮，于‐10℃下加入60g吡啶作為敷酸劑，再緩慢滴加95g肉豆蔻酰氯，反應8h后加水稀釋反應液。分出有機相，水相用12.5g乙酸乙酯萃取，合并有機相，得到酯化接枝松樹皮提取物溶液；依次用4倍體積的1mol/L HCl、飽和Na2CO3溶液、飽和NaCl溶液洗滌，真空干燥得到表面活性劑。
(2)大豆凝集素水提液制備：優(yōu)質黑豆磨粉，過100目篩，溶于50倍(體積)蒸餾水中，60℃下超聲輔助浸提5min(120W)，浸提后經(jīng)12000rpm、4℃離心15min，取上清液；
(3)反膠束溶液配制：將130g表面活性劑和24g助溶劑甘油完全溶于40g正己烷和40g丁醇中，加入12g水，使反膠束溶液濃度約為300mM，體系Wo值約為15，本實施例中加入助溶劑甘油，占總量的10％；
(4)前萃取過程：調節(jié)大豆凝集素水提液pH值為6.0，以NaCl調節(jié)水提液的離子強度為150mM，將大豆凝集素水提液與反膠束溶液按照體積比為1:30的比例混合，搖床震蕩混合30min后，4000rpm離心分層10分鐘，取上層有機相；
(5)反萃取過程：將上述上層有機相與4倍體積的丙酮和1倍體積的蒸餾水混合，搖床震蕩混合30min后，4000rpm離心分層10分鐘，取下層水相，經(jīng)冷凍干燥得到分離純化后的黑豆凝集素。
用血凝法來測定凝集素含量，大豆凝集素的純度達到88.5％，收率為90％。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。