本發(fā)明涉及一種提高葡萄糖氧化酶耐氧化性的方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，簡稱GOD)是生物領(lǐng)域中最主要的工具酶之一，自1967年Updike和Hicks將GOD固定在Clark氧電極表面將其應(yīng)用于血糖測定以來，GOD被廣泛應(yīng)用于食品飼料醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域。國內(nèi)外對葡萄糖氧化酶的研究主要集中產(chǎn)該酶的新菌株的篩選，菌株的定向改良以及發(fā)酵工藝的優(yōu)化等方面。
在食品工業(yè)中，由于氧的存在引起許多不利于產(chǎn)品質(zhì)量的化學(xué)反應(yīng)，并為許多微生物生長創(chuàng)造了條件。目前許多國家已將GOD作為公認(rèn)的安全抗氧劑而廣泛應(yīng)用于各種食品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主要在于將葡萄糖氧化形成過氧化氫和葡萄糖酸。利用其專一氧化酶的原理制成葡萄糖氧化酶分析儀能快速準(zhǔn)確簡易地測定各種食品中的葡萄糖含量指導(dǎo)生產(chǎn)。在醫(yī)藥工業(yè)中GOD作為試劑盒酶電極等用于血清(漿)尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析；GOD制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑牙垢和齲齒的形成，防止口腔疾病和牙病的發(fā)生。此外由于可以催化生成H2O2，還可用于對H2O2敏感的淋巴瘤的導(dǎo)向目標(biāo)的治療。GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動(dòng)物腸道環(huán)境調(diào)節(jié)飼料消化促進(jìn)動(dòng)物生長。含葡萄糖氧化酶乳酸過氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑可用于預(yù)防牲畜胃腸道感染腹瀉并有促進(jìn)動(dòng)物生長作用。從動(dòng)植物組織中提取GOD有一定的局限，酶量亦不豐富；細(xì)菌GOD產(chǎn)酶量少；一般采用黑曲霉和青霉屬菌株作為GOD生產(chǎn)菌。我國及美國均采用點(diǎn)青霉及產(chǎn)黃青霉生產(chǎn)GOD，日本常用尼奇青霉，俄羅斯用生機(jī)青霉。近年報(bào)道膠霉屬(Clioctadium)、擬青霉屬(Paecilomyces)和帚霉屬(Scopulariopsis)也能生產(chǎn)GOD。葡萄糖氧化酶主要來源是黑曲霉，由于黑曲霉所產(chǎn)葡萄糖氧化酶酶活低、催化效率低和雜蛋白較多而使得其在實(shí)際應(yīng)用中有一定的局限性。
GOD反應(yīng)過程中產(chǎn)生過氧化氫，使得該酶具有抗菌殺菌的作用，但是過氧化氫的積累會(huì)抑制GOD的活性而影響其本身的催化效率。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)過氧化氫濃度達(dá)到30mM時(shí)就會(huì)對GOD活性產(chǎn)生抑制作用。因此提高GOD對氧的耐受性事目前亟待解決的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服上述問題，本發(fā)明利用定點(diǎn)突變獲得了耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶。
本發(fā)明的耐氧化性提高的葡萄糖氧化酶，所述葡萄糖氧化酶是以SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列為出發(fā)序列，將第340位的絲氨酸S突變?yōu)楫惲涟彼酙，同時(shí)將第352位的丙氨酸A突變成為甘氨酸G；所得突變葡萄糖氧化酶命名為S340I-A352G。
本發(fā)明還要求保護(hù)編碼所述突變體的核苷酸片段、含有編碼權(quán)利要求1所述突變體的基因的載體、表達(dá)所述突變體的基因工程菌，以及所述突變體在食品、化工或紡織領(lǐng)域的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一株產(chǎn)所述葡萄糖氧化酶的基因工程菌，是以畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115為宿主，以pPIC9K為載體，表達(dá)所述葡萄糖氧化酶。
所述基因工程菌的構(gòu)建方法包括如下步驟：PCR或化學(xué)合成得到編碼葡萄糖氧化酶S340I-A352G的基因，連接表達(dá)載體pPIC9K，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115，獲得基因工程菌。
利用所述基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步驟：(1)將攜帶突變基因的基因工程菌活化后，在30℃、200rpm下培養(yǎng)至OD600＝1.5，作為種子液；(2)將種子液以3％(v/v)的接種量轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于30℃、200rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)；(3)當(dāng)在基本發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600＝1.4時(shí)，收集菌體，將酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)蛋白的產(chǎn)生。
所述基本發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB 13.4g，100mM pH 6.0的磷酸緩沖液。
所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為BMMY培養(yǎng)基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB 13.4g，100mM pH 6.0的磷酸緩沖液。
突變體命名方式：
采用“原始氨基酸位置替換的氨基酸”來表示突變體。如S234F，表示位置234的氨基酸由親本普魯蘭酶的Ser替換成Phe，位置的編號(hào)對應(yīng)于親本普魯蘭酶的氨基酸序列。
本發(fā)明的有益效果：
該菌株表達(dá)的葡萄糖氧化酶S340I-A352G相比于對照出發(fā)酶，耐氧化性在不同濃度的H2O2處理后剩余酶活均有不同程度的提高，在100mmol·L-1和500mmol·L-1 H2O2存在下是對照酶的2.1、3.2倍。本發(fā)明提高了葡萄糖氧化酶的氧化穩(wěn)定性，在工業(yè)上具有重大應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施方式
葡萄糖氧化酶酶活測定方法：
GOD活性測定采用鄰-聯(lián)(二)茴香胺分光光度法。在有氧的條件下，GOD催化葡萄糖脫氫產(chǎn)生H2O2，在過氧化物酶(POD)作用下，氧供體鄰-聯(lián)(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色產(chǎn)物。測540nm處吸光度的變化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果計(jì)算葡萄糖氧化酶活力單位。1個(gè)葡萄糖氧化酶活力(1U)定義為：在30℃、pH 6.0的條件下，1min將1μmol的β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H2O2所需的酶量為一個(gè)葡萄糖氧化酶酶活力單位。
實(shí)施例1 重組菌的構(gòu)建及鑒定
通過PCR擴(kuò)增或者直接化學(xué)合成的方式，得到含有氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的序列的核苷酸片段，然后將該核苷酸片段連接到PMD18-T載體上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，得到重組菌；從重組菌中提取質(zhì)粒。
根據(jù)要突變的S340和A352的前后序列，設(shè)計(jì)兩對引物，引物上相應(yīng)的位點(diǎn)核苷酸為突變后的核苷酸。利用 HS PCR酶(購于TaKaRa公司)采用全質(zhì)粒PCR的方法進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物線性化處理后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞。
分別利用針對S340、A352位點(diǎn)突變設(shè)計(jì)的引物以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，可得到單位點(diǎn)突變的S340I和A352G核苷酸片段；先利用針對S340位點(diǎn)突變設(shè)計(jì)的引物以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，再以針對A352位點(diǎn)突變設(shè)計(jì)的引物以PCR得到的產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR，可得到發(fā)生了兩個(gè)位點(diǎn)突變的S340I-A352G的核苷酸片段。
將得到的核苷酸片段分別再連接到表達(dá)載體pPIC9K中形成重組質(zhì)粒，然后重組質(zhì)粒線性化后電轉(zhuǎn)入Pichiapastoris GS115感受態(tài)細(xì)胞。篩選正確的轉(zhuǎn)化子即為重組基因工程菌。Pichia pastoris GS115/pPIC9K-S340I、Pichiapastoris GS115/pPIC9K-A352G、Pichia pastoris GS115/pPIC9K-S340I-A352G。
實(shí)施例2 重組菌產(chǎn)葡萄糖氧化酶的純化和蛋白電泳鑒定
采用實(shí)施例1中獲得的重組基因工程菌為生產(chǎn)菌株，活化后將在30℃、200rpm條件下在YPD生長培養(yǎng)基(裝液量50mL)培養(yǎng)到OD600＝1.5的種子以3％(v/v)的接種量轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基(裝液量50mL)，于30℃、200rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)。在基本發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600＝1.4時(shí)，離心收集全部菌體，生理鹽水洗滌2次，將菌體全部轉(zhuǎn)入50mL(500mL三角瓶)液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中，置于30℃、200r/min搖床培養(yǎng)，每24h補(bǔ)加發(fā)酵液體積1％的甲醇，誘導(dǎo)產(chǎn)酶。以表達(dá)野生型(即，未經(jīng)突變的出發(fā)GOD)葡萄糖氧化酶的P.pastoris GS115為對照菌株。
基本發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB 13.4g，100mM pH 6.0的磷酸緩沖液。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基為BMMY培養(yǎng)基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB 13.4g，100mM pH 6.0的磷酸緩沖液。
發(fā)酵結(jié)束后獲得發(fā)酵液，離心獲得發(fā)酵上清，對酶進(jìn)行純化，純化方法是陰離子層析，采用梯度洗脫的方法，最終獲得較純的葡萄糖氧化酶。
實(shí)施例3 葡萄糖氧化酶的固定化方法
采用無載體交聯(lián)技術(shù)(CLEAs)固定化原酶與突變酶。取100μL酶液，加入等體積的10U/mL通用過氧化物酶，接著，緩慢滴加聚乙二醇2000至終濃度為75％(w/v)，然后加入交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)為25％的戊二醛，至終濃度為70mmol·L-1。將混合物放入搖床，30℃交聯(lián)一段20h時(shí)間，取出混合物，用緩沖液(10mM丙二酸鈉緩沖液pH 5.0)洗滌，離心后收集上清，并重復(fù)上述操作，直到上清中無法檢測到酶活，將固定化酶放入緩沖液中(終體積10mL)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例4 酶的耐氧化性測定
用Brandford試劑盒將原酶和突變酶的酶液統(tǒng)一到同一蛋白濃度，采用無載體交聯(lián)技術(shù)固定化原酶與突變酶。
將固定化后的原酶(對照酶)和三個(gè)突變酶S340I、A352G、S340I-A352G放在不同濃度H2O2(10、20、50、100、500mM)處理，處理溫度為35℃，處理時(shí)間為2h，緩沖液為丙二酸鈉緩沖液(pH 5.0，10mM)。處理后，離心，倒掉上清，并用緩沖液洗沉淀直到上清中無法檢測到H2O2以徹底除去H2O2。將沉淀用等體積的緩沖液溶解，離心并充分重懸后測定剩余酶活。相對酶活是經(jīng)H2O2處理后的酶活與初始酶活的比值，定義初始酶活力為100％。
結(jié)果如表1所示。
表1 不同濃度H2O2處理后的酶活保留率
結(jié)果顯示，S340I-A352G在100mmol·L-1和500mmol·L-1H2O2存在下的酶活保留率是對照酶的2.1、3.2倍，耐氧化性顯著提高。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
<110> 曹書華
<120> 一種提高葡萄糖氧化酶耐氧化性的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser
1 5 10 15
Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu
20 25 30
Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100 105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser
325 330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340 345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu
355 360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370 375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425 430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450 455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu
565 570 575
Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580