本發(fā)明涉及一種脂肪酶的固定化方法。

(二)

背景技術(shù)：

脂肪酶，全稱為三?；视退饷?，是一類特殊的酰基水解酶，它能夠在脂-水界面上催化酯鍵水解、酯合成、酯交換和立體異構(gòu)體拆分等化學(xué)反應(yīng)。脂肪酶在食品加工、飼料工業(yè)、化學(xué)催化、油脂加工、造紙工業(yè)、洗滌工業(yè)、皮革加工、紡織工業(yè)和生物柴油生產(chǎn)中被大量應(yīng)用。隨著脂肪酶生產(chǎn)成本降低、生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大、脂肪酶應(yīng)用工藝的提升，工業(yè)生產(chǎn)中對(duì)脂肪酶的需求正在不斷擴(kuò)大。

在工業(yè)應(yīng)用中，直接使用游離脂肪酶，反應(yīng)完成后很難將脂肪酶分離，一方面影響后續(xù)的連續(xù)化生產(chǎn)，一方面也造成酶浪費(fèi)。將脂肪酶固定在載體上，制備成固定化脂肪酶，既能保持脂肪酶的催化活性，又容易將酶與反應(yīng)產(chǎn)物分離，還能實(shí)現(xiàn)脂肪酶的回收利用。固定化脂肪酶能夠極大提升脂肪酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍，降低應(yīng)用成本。目前，酶的固定主要有吸附、交聯(lián)、包埋和共價(jià)結(jié)合等方法。吸附法是通過離子作用或物理吸附將酶固定在載體上，操作簡(jiǎn)單，條件溫和，對(duì)酶活性影響較小，但是物理吸附作用力較弱，固定的酶容易流失。交聯(lián)法則是通過雙功能或多功能試劑使酶分子之間交聯(lián)實(shí)現(xiàn)固定化，固定的酶很牢固，但是交聯(lián)條件苛刻，對(duì)酶活性影響比較大。包埋和共價(jià)等固定方法也各有利弊，不同的固定方法適應(yīng)于不同反應(yīng)和應(yīng)用，因此發(fā)展多樣化的固定方法對(duì)擴(kuò)大脂肪酶使用范圍，降低使用成本具有重要的價(jià)值。目前工業(yè)用脂肪酶主要依靠微生物發(fā)酵獲得，微生物發(fā)酵法對(duì)生產(chǎn)設(shè)備、運(yùn)輸儲(chǔ)存要求高，生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)張難度大，產(chǎn)能有限，生產(chǎn)成本高，而且生產(chǎn)工藝復(fù)雜，酶純化難度也大，提高產(chǎn)能，降低生產(chǎn)成本是脂肪酶工業(yè)生產(chǎn)中需要解決的重要問題。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種能夠高效固定在殼聚糖上的固定化脂肪酶，及其規(guī)?；a(chǎn)方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種脂肪酶的固定化方法，所述方法為：將脂肪酶、蛋白連接肽和殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列依次連接成脂肪酶融合蛋白，以殼聚糖為載體，將脂肪酶融合蛋白進(jìn)行固定化，得到固定化脂肪酶；所述蛋白連接肽的氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示，所述殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列為SEQ ID NO.3所示。

進(jìn)一步，所述脂肪酶氨基酸序列為SEQ ID NO.1所示。

進(jìn)一步，所述脂肪酶融合蛋白固定化方法為：通過農(nóng)桿菌侵染法將脂肪酶融合蛋白轉(zhuǎn)化水稻，獲得含有脂肪酶融合蛋白基因的轉(zhuǎn)基因水稻種子，將水稻種子提純，獲得脂肪酶融合蛋白溶液；將殼聚糖加入體積濃度1％的乙酸水溶液中，充分溶解，形成膠狀液；將膠狀液滴加到1mol/L的NaOH水溶液中，形成球形顆粒，水洗至中性，干燥后作為固體載體；然后將固體載體加入脂肪酶融合蛋白溶液中，28℃靜置2h，用去離子水淋洗干凈，室溫干燥，得到固定化脂肪酶。

進(jìn)一步，所述脂肪酶融合蛋白轉(zhuǎn)化水稻是構(gòu)建含有由水稻胚乳特異性啟動(dòng)子介導(dǎo)的脂肪酶融合蛋白表達(dá)框和植物轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記的水稻遺傳轉(zhuǎn)化載體。所述水稻胚乳特異性啟動(dòng)子的核苷酸序列為SEQ ID NO.5所示。更具體是將脂肪酶融合蛋白編碼基因和35S終止子連接(核苷酸序列為SEQ ID NO.4)，再與水稻種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子一起連入pCAMB1300(GenBank:AF234296.1)載體的T-DNA中，獲得水稻轉(zhuǎn)化載體pCAMB1300-GT1-CalB-CBM，利用電擊轉(zhuǎn)化法將轉(zhuǎn)化載體pCAMB1300-GT1-CalB-CBM導(dǎo)入農(nóng)桿菌(LBA4404)細(xì)胞中，獲得含有轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化株系。

進(jìn)一步，所述水稻種子提純的方法為：將水稻種子脫殼，加入20mM、pH8.0Tril-HCL緩沖液(優(yōu)選緩沖液體積用量以脫殼后的水稻種子質(zhì)量計(jì)為20ml/g)中勻漿處理，勻漿后振蕩提取2小時(shí)，靜置后取上清液，將上清液采用300-500目過濾網(wǎng)過濾，取濾液，即脂肪酶融合蛋白溶液。

進(jìn)一步，所述殼聚糖分子量1.05×10⁶，所述的乙酸水溶液體積用量以殼聚糖質(zhì)量計(jì)為50ml/g。

進(jìn)一步，所述脂肪酶融合蛋白溶液體積用量以固體載體質(zhì)量計(jì)為100ml/g。

固定化脂肪酶的回收穩(wěn)定性測(cè)試，將固定后的脂肪酶融合蛋白用于催化合成棕櫚酸十六酯反應(yīng)的批次實(shí)驗(yàn)，通過簡(jiǎn)單的過濾將酶從反應(yīng)體系中分離出來，以繼續(xù)下一批次的反應(yīng)，觀察其使用壽命，經(jīng)過十五次的回收利用固定化脂肪酶融合蛋白催化的棕櫚酸十六酯的轉(zhuǎn)化率仍能保持在90％，說明該固定化脂肪酶具有優(yōu)良的操作穩(wěn)定性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：

本發(fā)明提供了一種脂肪酶固定化方法，可以有效固定脂肪酶，提供脂肪酶重復(fù)利用率，經(jīng)過十五次的回收利用固定化脂肪酶融合蛋白催化的棕櫚酸十六酯的轉(zhuǎn)化率仍能保持在90％；本發(fā)明還提供一種脂肪酶融合蛋白規(guī)?；a(chǎn)方法，可以提高脂肪酶生產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。

(四)附圖說明

圖1是本發(fā)明水稻的轉(zhuǎn)化T-DNA載體pCAMB1300-GT1-CalB-CBM的示意圖。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：水稻轉(zhuǎn)化T-DNA載體pCAMB1300-GT1-CalB-CBM的構(gòu)建

將脂肪酶氨基酸序列編碼基因(氨基酸序列SEQ ID NO.1)、蛋白連接肽編碼基因(氨基酸序列SEQ ID NO.2)和殼聚糖結(jié)合域氨基酸序列編碼基因(氨基酸序列SEQ ID NO.3)依次連接成脂肪酶融合基因，由上海生工公司(上海，中國)人工合成含有脂肪酶融合基因和35S終止子的核苷酸，其序列為SEQ ID NO:4(其中1-957編碼脂肪酶，958-1077bp編碼連接肽，1078-1863bp編碼殼聚糖結(jié)合域，1864-2047bp為終止子序列)。

利用PCR引物GT1-F(5’AAGCTTGAGATTCATCAATATGAGAAAAC，下橫線是HindⅢ位點(diǎn))；和GT1-R(5’TCTAGACTGGGCTAGGGAGCCATCGCAC，下橫線是XbaⅠ位點(diǎn))從水稻(Oryza sativa japonica L.)基因組DNA擴(kuò)增獲得水稻胚乳特異啟動(dòng)子，長908bp，核苷酸序列為SEQ ID NO.5。

將水稻種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子和脂肪酶融合基因一起連入pCAMB1300(GenBank:AF234296.1)載體的T-DNA中，獲得水稻轉(zhuǎn)化載體pCAMB1300-GT1-CalB-CBM，載體圖譜如圖1所示。

利用電擊轉(zhuǎn)化法將轉(zhuǎn)化載體pCAMB1300-GT1-CalB-CBM導(dǎo)入農(nóng)桿菌(LBA4404)細(xì)胞中，獲得含有轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化株系。

實(shí)施例2：含有脂肪酶融合基因的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得

轉(zhuǎn)基因水稻的獲得方法是采用農(nóng)桿菌侵染法，根據(jù)Zhao等報(bào)道的方法和培養(yǎng)基配方(Agricultural Sciences in China,2011,10(9):1307-1312)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，具體步驟：。選取成熟飽滿的“秀水134”種子去殼，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織作為轉(zhuǎn)化材料。取含實(shí)施例1獲得得到植物轉(zhuǎn)化載體pCAMB1300-GT1-CalB-CBM的農(nóng)桿菌在含有50mg/mL卡那抗性的YEP平板上劃線培養(yǎng)，挑單菌落接種到Y(jié)EP液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)至OD₆₆₀為0.5，獲得農(nóng)桿菌菌液，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌。將待轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織放入OD₆₆₀為0.5的含有40mg/mL乙酰丁香酮的農(nóng)桿菌菌液中，水平搖床120rpm震蕩1小時(shí)，讓農(nóng)桿菌附著在愈傷組織表面，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基中，26℃共培養(yǎng)2天。用無菌水沖洗共培養(yǎng)后的愈傷，轉(zhuǎn)移到含50mg潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，28℃篩選培養(yǎng)兩個(gè)月(中間繼代一次)。把篩選后，生長活力良好的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基，28℃、14小時(shí)光照周期進(jìn)行分化培養(yǎng)。2-3周后，把抗性再生植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上壯苗生根，最后將再生植株洗去瓊脂移植于溫室，每個(gè)單獨(dú)抗性愈傷分化獲得的水稻苗為獨(dú)立轉(zhuǎn)化株系(見表1)，分別收取每個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化株系的水稻種子作為鑒定材料。

實(shí)施例3：水稻種子中脂肪酶融合蛋白提取

將實(shí)施例2獲得的轉(zhuǎn)基因水稻種子脫殼，取5g脫殼后的種子，用20mM pH8.0的Tri-HCL緩沖液100ml勻漿處理，勻漿后振蕩提取2小時(shí)，靜置后取上清液，將上清液進(jìn)行300-500目過濾網(wǎng)過濾，獲得的過濾液(即脂肪酶融合蛋白溶液)用于脂肪酶固定。

實(shí)施例4：水稻種子中脂肪酶融合蛋白的活性測(cè)定

脂肪酶活性測(cè)定原理：脂肪酶在一定條件下水解底物對(duì)硝基苯丁酸酯，生成對(duì)硝基苯酚和脂肪酸，在一定范圍內(nèi)對(duì)硝基苯酚的量和反應(yīng)液顏色深淺成正比，在405nm波長處測(cè)定其吸光度，從而計(jì)算出脂肪酶酶活。其中1個(gè)酶活力單位定義為每分鐘釋放1納摩爾的對(duì)硝基苯酚所需的酶量。

以對(duì)硝基苯丁酸酯為底物通過分光光度法測(cè)定脂肪酶融合蛋白的活性。對(duì)從不同獨(dú)立轉(zhuǎn)化株系中提取獲得的脂肪酶融合蛋白進(jìn)行酶活性測(cè)定。以50mM的對(duì)硝基苯丁酸酯的乙腈溶液4μL反應(yīng)底物，以含有150mM NaCl及體積濃度0.5％Triton X-100的100mM的pH8.0磷酸鹽緩沖液的為反應(yīng)介質(zhì)，加入36μL實(shí)施例3獲得的脂肪酶融合蛋白溶液，構(gòu)成400μL的反應(yīng)體系。用可控溫分光光度計(jì)測(cè)定所釋放的對(duì)硝基酚在405nm波長處的吸收值來計(jì)算脂肪酶的活力。結(jié)果顯示脂肪酶融合蛋白表達(dá)量最高的轉(zhuǎn)基因水稻種子中脂肪酶活性達(dá)到6230U/g(按種子重量計(jì))。

表1不同轉(zhuǎn)化株系中脂肪酶融合蛋白表達(dá)量

實(shí)施例5：脂肪酶融合蛋白的固定

取2克殼聚糖(分子量1.05×10⁶)溶于100mL體積濃度1％的乙酸水溶液中，充分溶解，形成膠狀溶液。將100mL膠狀液緩慢滴加到1mol/L的NaOH水溶液1000mL中，殼聚糖凝結(jié)成顆粒，收集顆粒，純凈水沖洗后干燥作為固體載體。取0.1g殼聚糖顆粒，加入10mL的實(shí)施例3獲得的脂肪酶融合蛋白溶液中，28℃靜置固定2h，用純凈水淋洗干凈，室溫干燥，得到固定化的脂肪酶融合蛋白0.1g。

實(shí)施例6：固定化脂肪酶融合蛋白的操作穩(wěn)定性

棕櫚酸十六酯的合成反應(yīng)，在50mL錐形瓶中加入1.28g十六酸和1.57g十六醇(酸醇摩爾比為1:1.3)，0.1g實(shí)施例5制備的固定化脂肪酶融合蛋白，以5mL石油醚作為溶劑，40℃密閉振蕩反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后過濾，濾餅回收固定化脂肪酶用于進(jìn)行下一輪的反應(yīng)，濾液以0.1mol/L的NaOH水溶液滴定，以10％酚酞做指示劑，計(jì)算棕櫚酸十六酯的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示經(jīng)過十五次回收反應(yīng)后，固定化脂肪酶融合蛋白催化的棕櫚酸十六酯的轉(zhuǎn)化率仍能保持90％。

表2固定化脂肪酶融合蛋白回收轉(zhuǎn)化率

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大學(xué)

<120> 一種脂肪酶的固定化方法

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 317

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu

1 5 10 15

Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys

20 25 30

Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe

35 40 45

Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys

50 55 60

Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr

65 70 75 80

Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn

85 90 95

Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln

100 105 110

Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu

115 120 125

Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu

130 135 140

Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly

145 150 155 160

Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile

165 170 175

Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro

180 185 190

Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys

195 200 205

Asn Ile Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His

210 215 220

Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala

225 230 235 240

Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr

245 250 255

Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val

260 265 270

Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Glu Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly

275 280 285

Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe

290 295 300

Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro

305 310 315

<210> 2

<211> 40

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Pro Gly Gly Ala Pro Ser Asn Arg Ser Thr Thr Ser Arg Val Ser Pro

1 5 10 15

Thr Thr Ser Arg Ser Ser Ser Val Thr Pro Pro Pro Gly Ser Thr Thr

20 25 30

Thr Arg Val Asn Asn Gly Glu Phe

35 40

<210> 3

<211> 262

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

Thr Ala Thr Ala Ser Ser Ile Glu Gly Ala Gly Phe Glu Ala Ser Arg

1 5 10 15

Ala Phe Asp Gly Ser Ser Thr Thr Arg Trp Ala Ser Ala Glu Gly Val

20 25 30

Asp Pro Gln Trp Ile Tyr Val Asn Leu Gly Ser Ser Gln Thr Val Asn

35 40 45

Arg Val Lys Leu Asn Trp Glu Ala Ala Tyr Ala Ser Ser Tyr Thr Ile

50 55 60

Gln Val Ser Asn Asp Ser Gly Thr Pro Thr Asn Trp Thr Thr Val Tyr

65 70 75 80

Thr Thr Thr Thr Gly Asp Gly Gly Ile Asp Asp Ile Thr Phe Thr Ala

85 90 95

Arg Thr Ala Lys Tyr Val Arg Val His Gly Thr Val Arg Gly Thr Pro

100 105 110

Tyr Gly Tyr Ser Leu Trp Glu Phe Glu Val Tyr Gly Gly Ser Thr Ala

115 120 125

Pro Ser Asn Leu Ala Leu Asn Lys Ala Thr Ala Thr Ser Ser Ile Glu

130 135 140

Thr Ala Gly His Glu Gly Asp Lys Ala Val Asp Gly Asn Ala Ala Thr

145 150 155 160

Arg Trp Ala Ser Ala Tyr Gly Ala Ser Pro Gln Trp Ile Tyr Ile Asn

165 170 175

Leu Gly Ser Thr Gln Ser Ile Ser Arg Val Lys Leu Asn Trp Glu Asp

180 185 190

Ala Tyr Ala Thr Ala Tyr Ser Ile Gln Val Ser Asn Asp Ser Gly Ser

195 200 205

Thr Pro Thr Asn Trp Thr Thr Val Tyr Ser Thr Thr Thr Gly Asp Gly

210 215 220

Ala Ile Asp Asp Ile Thr Phe Ala Ala Thr Asn Ala Lys Phe Val Arg

225 230 235 240

Val Tyr Ala Thr Thr Arg Ala Thr Ala Tyr Gly Tyr Ser Leu Trp Glu

245 250 255

Phe Glu Val Tyr Gly Ala

260

<210> 4

<211> 2047

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

tctagactcc cgctgggcct ggacccggcc ttcctgcagc cgaagctggt gctcgacgcc 60

ggcctcacct gccagggcgc cctgccgctg ctggtgctga agccgatcct cctcgtgccg 120

ggcaccggca ccaccggccc gcagctgttc gacctgaact ggatcccgct cctgacccag 180

ctcggctaca ccccgtgctg gatcctgccg ccgccgttca tgctcaacga cacccaggtg 240

aacaccgagt acatggtgaa cgccatcacc gccctctacg ccggcctggg caacaacaag 300

ctcccggtgc tcacctggct gcagggcggc ctcgtggccc agtggggcct caccttcttc 360

ccgctgatcc gcctgaaggt ggaccgcctc atggccttcg ccccggacta caagggcacc 420

gtgctcgccg gcccgctcga cgccctcgcc gtgctggccc cgctggtgtg gcagcagacc 480

accggcctgg ccctcaccac cgccctccgc aacgccggcg gcctcaccca gatcgtgccg 540

accaccaacc tctacctggc caccgacgag atcgtgcagc cgcaggtgct gaacctgccg 600

ctcgacctgc tgtacctctt caacggcaag aacatccagg cccaggccgt gtgcggcccg 660

ctcttcgtga tcgaccacgc cggcctgctc accctgcagt tcctgtacgt ggtgggccgc 720

ctggccctcc gcctgaccac cggccaggcc cgcctggccg actacggcat caccgactgc 780

aacccgctcc cggccaacga cctcaccccg gagcagaagg tggccgccgc cgccctcctc 840

gccccggagg ccgccgccat cgtggccggc ccgaagcaga actgcgagcc ggacctcatg 900

ccgtacgccc gcccgttcgc cgtgggcaag cgcacctgcc tgggcatcgt gaccccgccg 960

ggcggcgccc cgctgaaccg cctgaccacc ctgcgcgtgc tgccgaccac cctgcgcctg 1020

ctgctggtga ccccgccgcc gggcctgacc accacccgcg tgaacaacgg cgagttcacc 1080

gccaccgccc tgctgatcga gggcgccggc ttcgaggccc tgcgcgcctt cgacggcctg 1140

ctgaccaccc gctgggccct ggccgagggc gtggacccgc agtggatcta cgtgaacctc 1200

ggcctgctgc agaccgtgaa ccgcgtgaag ctcaactggg aggccgccta cgccctgctg 1260

tacaccatcc aggtgctgaa cgacctgggc accccgacca actggaccac cgtgtacacc 1320

accaccaccg gcgacggcgg catcgacgac atcaccttca ccgcccgcac cgccaagtac 1380

gtgcgcgtgc acggcaccgt gcgcggcacc ccgtacggct acctgctctg ggagttcgag 1440

gtgtacggcg gcctgaccgc cccgctgaac ctcgccctca acaaggccac cgccaccctg 1500

ctgatcgaga ccgccggcca cgagggcgac aaggccgtgg acggcaacgc cgccacccgc 1560

tgggccctgg cctacggcgc cctgccgcag tggatctaca tcaacctcgg cctgacccag 1620

ctgatcctgc gcgtgaagct caactgggag gacgcctacg ccaccgccta cctgatccag 1680

gtgctgaacg acctgggcct gaccccgacc aactggacca ccgtgtacct gaccaccacc 1740

ggcgacggcg ccatcgacga catcaccttc gccgccacca acgccaagtt cgtgcgcgtg 1800

tacgccacca cccgcgccac cgcctacggc tacctgctct gggagttcga ggtgtacggc 1860

gcctaataat gtgtgagtag ttcccagata agggaattag ggttcctata gggtttcgct 1920

catgtgttga gcatataaga aacccttagt atgtatttgt atttgtaaaa tacttctatc 1980

aataaaattt ctaattccta aaaccaaaat ccagtactaa aatccagatc ccccgaatta 2040

ggtaccg 2047

<210> 5

<211> 908

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

aagcttgaga ttcatcaata tgagaaaaca gagaatggac aaccctcctt ctgtagtaca 60

gacaaaacta aaagtaatga aagaagatgt ggtgttagaa aaggaaacaa tatcatgagt 120

aatgtgtgag cattatggga ccacgaaata aaaagaacat tttgatgagt cgtgtatcct 180

cgatgagcct caaaagttct ctcaccccgg ataagaaacc cttaagcaat gtgcaaagtt 240

tgcattctcc actgacataa tgcaaaataa gatatcatcg atgacatagc aactcatgca 300

tcatatcatg cctctctcaa cctattcatt cctactcatc tacataagta tcttcagcta 360

aatgttagaa cataaaccca taagtcacgt ttgatgagta ttaggcgtga cacatgacaa 420

atcacagact caagcaagat aaagcaaaat gatgtgtaca taaaactcca gagctatatg 480

tcatattgca aaaagaggag agcttataag acaaggcatg actcacaaaa attcacttgc 540

ctttcgtgtc aaaaagagga gggctttaca ttatccatgt catattgcaa aagaaagaga 600

gaaagaacaa cacaatgctg cgtcaattat acatatctgt atgtccatca ttattcatcc 660

acctttcgtg taccacactt catatatcat aagagtcact tcacgtctgg acattaacaa 720

actctatctt aacatttaga tgcaagagcc tttatctcac tataaatgca cgatgatttc 780

tcattgtttc tcacaaaaag cattcagttc attagtccta caacaacatg gcatccataa 840

atcgccccat agttttcttc acagtttgct tgttcctctt gtgcgatggc tccctagccc 900

agtctaga 908