本發(fā)明涉及一株酶活提高的苯丙氨酸脫氨酶突變體，屬于蛋白質(zhì)工程。
背景技術(shù)：
苯丙氨酸脫氨酶(PAL)可用于有效并長(zhǎng)期式地治療苯丙酮尿癥(PKU)。魚腥藻Anabaena variabilis來源的PAL(Av-PAL)因?yàn)槠浞€(wěn)定性以及較低免疫原性，在PKU治療方面展示了較好的潛力。但是原核來源的Av-PAL酶活較真核來源的PAL酶活相差較大，而人們也發(fā)現(xiàn)Tyr78這一loop(Ser73至Ala97)對(duì)MIO這一家族酶有著非凡的意義，包括酶活和底物的選擇性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在提供一株酶活提高的苯丙氨酸脫氨酶突變體，由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列編碼。
本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)所述苯丙氨酸脫氨酶突變體的方法，是以大腸桿菌BL21為宿主，以pET28a為表達(dá)載體，將所得重組菌種子液接種于含卡那霉素的2YT表達(dá)培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至OD600至0.8-1.0時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至0.1mM，20℃誘導(dǎo)16-18h苯丙氨酸脫氨酶突變體的表達(dá)。
2YT表達(dá)培養(yǎng)基含有蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，還包括將重組菌體破碎后，收集上清，上清膜過濾后，用His Trap HF柱分離得到苯丙氨酸脫氨酶突變體。
本發(fā)明提供的苯丙氨酸脫氨酶突變體S73N的比酶活為2.22U/mg，較原酶的1.78U/mg提高了25％；kcat(s-1)較原酶的1.650s-1提高了26.7％。
具體實(shí)施方式
酶活的定義：每分鐘每毫克PAL轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸的量(μmols)。
酶活測(cè)定方法：在pH 8.5的100mM Tris-Hcl緩沖液中，以10mM L-苯丙氨酸為底物，在37℃下反應(yīng)20min，根據(jù)290nm的吸收值測(cè)定生成的肉桂酸濃度，確定酶活。
動(dòng)力學(xué)參數(shù)的確定：在37℃下，以0.01至0.3mM的L-苯丙氨酸為底物，加入0.5μg純酶，在pH 8.5的100mM Tris-Hcl緩沖液中反應(yīng)12min，期間96孔板連續(xù)檢測(cè)產(chǎn)物。
實(shí)施例1
(1)突變體S73N的構(gòu)建：
以pET28a-PAL為模版，以表1所示引物在表2所示條件下，PCR得到攜帶編碼突變體S73N的基因的重組載體pET28a-PAL/S73N。pET28a-PAL的構(gòu)建方法參見Moffitt,M.C.,Louie,G.V.,Bowman,M.E.,Pence,J.,Noel,J.P.and Moore,B.S.(2007)Discovery of two cyanobacterial phenylalanine ammonia lyases:Kinetic and structural characterization.Biochemistry-Us,46,1004-1012.
表1引物
表2全質(zhì)粒PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：
PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳方法鑒定。然后將PCR產(chǎn)物純化、消化后轉(zhuǎn)入BL21宿主。
(2)將重組大腸桿菌BL21/pET28a-PAL/S73N接種于4mL卡那霉素濃度為100μg/mL的LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L)，37℃、200r/min振蕩過夜培養(yǎng)。
將上述過夜培養(yǎng)物按1％的接種量接種于含卡那霉素濃度為100μg/mL的100mL 2YT表達(dá)培養(yǎng)基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L)中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至OD600至0.8-1.0時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至0.1mM，20℃誘導(dǎo)16-18h得到菌體，5000g的轉(zhuǎn)速離心收菌。
(3)將重組菌體溶于20mL結(jié)合緩沖溶液(50mmol/L Na2HPO4、50mmol/L NaH2PO4、500mmol/L NaCl、20mmol/L imidazole)，超聲破碎，13000g離心25min，上清用0.22μm濾膜過濾。用10倍柱體積的結(jié)合緩沖溶液平衡1mL的His Trap HF柱，用15倍柱體積的結(jié)合緩沖溶液洗去非特異性吸附的蛋白，分別用8倍柱體積的150、300和500mmol/L咪唑的緩沖液洗脫蛋白，收集樣品并用SDS-PAGE分析鑒定。
(4)酶活的測(cè)定：在400μl pH 8.5的Tris-Hcl緩沖反應(yīng)體系中分別加入3μg純化后的突變酶S73N和野生酶(SEQ ID NO.2)，加底物L(fēng)-苯丙氨酸至10mM，在37℃下反應(yīng)20min，確定相應(yīng)比酶活。S73N的比酶活為2.22U/mg，野生酶的1.78U/mg。
(5)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的確定：以不同濃度的L-苯丙氨酸為底物(0.01至0.3mM)，確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
表1野生酶(WT)和S73N的動(dòng)力學(xué)參數(shù)
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大學(xué)
<120> 一株酶活提高的苯丙氨酸脫氨酶突變體
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1704
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaagacac tatctcaagc acaaagcaaa acctcatctc aacaattttc ttttactgga 60
aattcttctg ccaatgtaat tattggtaat cagaaactca caatcaatga tgttgcaagg 120
gtagcgcgta atggcacctt agtgtcttta accaataaca ctgatatttt gcagggtatt 180
caggcatctt gtgattacat taataatgct gttgaaaatg gggaaccaat ttatggagtg 240
acatctggtt ttggcggtat ggccaatgtt gccatatccc gtgaacaagc atctgaactc 300
caaaccaact tagtttggtt cctgaaaaca ggtgcaggga acaaattacc cttggcggat 360
gtgcgcgcag ctatgctctt gcgtgcaaac tctcatatgc gcggtgcatc tggcatcaga 420
ttagaactta tcaagcgtat ggagattttc cttaacgctg gtgtcacacc atatgtgtat 480
gagtttggtt caattggtgc aagtggtgat ttagtgccac tatcctacat tactggttca 540
ctgataggct tagatcccag ttttaaggtt gacttcaacg gtaaagaaat ggatgcgcca 600
acagctctac gtcaactgaa tttgtcaccc ttgacattgt tgccgaagga aggcttggcg 660
atgatgaacg gcacttcagt catgacaggt attgcagcaa actgcgtcta cgatactcaa 720
attttaactg cgatcgctat gggcgttcac gctctagata tccaagcttt aaacggaacc 780
aatcaatcat tccatccatt tatccataat tccaaaccac atcctggtca attatgggca 840
gcagatcaga tgatttcttt gttagccaat tcccagttag ttcgtgatga gttagatggt 900
aaacacgatt atcgtgatca cgagttgatt caagatcgtt actcactccg atgccttccc 960
cagtatttgg ggccaatcgt tgatggaatt tcccagattg ccaaacaaat tgaaatcgaa 1020
atcaactcag tcaccgataa cccactaatt gatgttgata accaagctag ctatcatgga 1080
ggaaatttcc tcggacagta cgtgggtatg ggaatggatc acctgcgtta ctatattggg 1140
ttattggcta aacacctaga tgtgcagatt gccctcctcg cctcaccaga gtttagcaat 1200
ggactaccac catctttatt aggcaaccga gaacgtaaag tcaatatggg actcaaaggt 1260
ctgcaaatat gcggtaactc aattatgcca ctgttgacct tctatggaaa ttccatcgcc 1320
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tcagcgactc tagcccgccg ttctgtggat atcttccaga attatgtggc gatcgctctg 1440
atgtttggag tccaagctgt tgacctccgc acatataaaa agactggtca ttacgatgca 1500
cgcgcctgtc tatcacctgc aactgagcgc ttatattcag cagtccgcca cgtagttgga 1560
caaaaaccaa cttcagatcg cccatatatt tggaatgata atgagcaagg actggatgag 1620
catattgccc ggatttctgc tgatatcgct gctggtggtg tgattgtgca agcagttcaa 1680
gatatcttac cctgcttgca ttaa 1704
<210> 2
<211> 1704
<212> DNA
<213> 魚腥藻
<400> 2
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