本發明涉及功能微生物篩選
技術領域：
，具體涉及一種拜萊青霉及其在農業生產中的應用。
背景技術：
：磷是植物生長所必須的營養元素之一，磷對植物的重要性不言而喻，同時磷元素是植株體內多種化合物的組成成分，參與植物體的新陳代謝，不僅能夠提高作物含量，還能增加植物抗逆性。植株主要利用土壤中的有效磷，但是，土壤中的磷95％以上為植物難以利用的無效磷，為了滿足作物的生長，人們往往會通過施加大量磷肥來提高作物產量，這導致磷酸鹽迅速在土壤中積累，不僅造成磷素資源的浪費，而且對水體環境安全構成一定的威脅。因此，提高土壤中難溶性磷的利用效率對于農業生態系統的健康發展具有重要意義。研究表明，土壤中大量存在一些能夠轉化難溶磷的溶磷微生物，溶磷微生物在轉化土壤難溶磷方面已經引起了國內外專家的廣泛關注，被世界公認為經濟高效環保的生物措施。溶磷微生物是土壤中存在的一些能將難溶態的無機磷或有機磷轉化為易于被植物吸收利用的水溶性磷，提高了土壤的供磷水平，從而增加作物產量。另外，溶磷微生物還能分泌生長調節物質，促進農作物植物根系對鋅、銅等其它營養元素的吸收，增強植物抗病能力，并減少環境污染。具有溶磷作用的微生物種類繁多，大體上可分為三大類：溶磷細菌、溶磷真菌和溶磷放線菌。溶磷細菌現研究報道的有：芽孢桿菌屬(Bacillus)、歐文氏菌屬(Erwinia)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、腸細菌屬(Enterbacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、固氮菌屬(Azotobacter)等的26個菌屬；溶磷真菌報道的有青霉菌屬(penicillium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉菌屬(Aspergillu)、小菌核菌屬(Sclerotium)和根霉菌屬(Rhizopus)等；溶磷放線菌主要為鏈霉菌屬(Streptomyces)、AM菌根菌等。Narsian等(2000)通過對不同溶磷菌溶磷能力的比較，得出曲霉在不同的溶磷菌中的溶磷活性最高，并將磷礦粉中45％的磷溶解出來。Agnihotri等(1970)研究的一株拜萊青霉可以將磷礦粉中80％的磷溶解出來。Kucey和Leggett(1989)將拜萊青霉菌(Penicilliumbilaji)接種與盆栽土壤中，同時加入磷礦石，研究發現接種菌的油菜吸磷量與施用磷肥油菜額定的吸磷量沒有差異。范丙全(2010)將溶磷青霉菌P8接種于土壤中，發現接種青霉菌P8后能提高作物的吸磷量，青霉菌P8對作物的促生效果較為明顯。研究證明，溶磷微生物不僅能提高土壤有效磷，還可以促進作物的生長，提高作物的抗逆性，應用溶磷微生物，提高當季磷肥使用率，增加土壤難溶磷的轉化率，節省磷肥的浪費，對延長我國有限磷礦使用年限和促進農業持續發展意義重大，并且對解決施加磷肥帶來的環境污染問題具有深遠的實踐意義。因此，篩選出溶磷穩定、增產穩定、環境適應力強，高效的溶磷微生物菌株刻不容緩。技術實現要素：本發明為解決現有技術問題，提供了一種高效解磷的拜萊青霉(Penicilliumbilaji)菌株以及該菌株在農業生產中的應用。所述拜萊青霉菌株是從山東省萊州市彭家磷礦區的土壤中篩選得到的，能高效利用土壤中的難溶磷，并有效降低土壤中的重金屬含量，應用前景廣闊。本發明一方面提供了一種拜萊青霉VLD-11(PenicilliumbilajiVLD-11)，已于2015年11月23日保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO：M2015690。本發明另一方面提供了一種微生物制劑，是通過將上述拜萊青霉VLD-11進行發酵得到的。本發明還提供了一種解磷菌劑，包含所述微生物制劑。所述解磷菌劑還包含枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、丁酸梭菌、草酸青霉、黑曲霉中的任意一種或兩種或多種的組合。本發明還提供了所述拜萊青霉在農作物育苗中的應用。本發明還提供了所述拜萊青霉在土壤修復中的應用。本發明還提供了一種土壤修復劑，包含所述拜萊青霉和羥磷灰石。本發明篩選到的拜萊青霉VLD-11能將難溶性無機磷液體培養基中的難溶磷(Ca3(PO4)2)分解成可溶性的有效磷，使培養基中有效磷含量高達1.976mg/mL，解磷效果顯著。在油菜大田栽培實驗中，拜萊青霉VLD-11處理組油菜的平均鮮重和干重比空白對照組分別提高了354.7％和297.8％，比培養基處理組分別提高350.9％和292.7％，有效磷含量比空白處理組提高了89.8％，比培養基處理組提高了87.1％。本發明提供的拜萊青霉VLD-11還能顯著提高水稻的育苗質量。與空白對照組相比，拜萊青霉VLD-11處理組水稻秧苗的莖粗，根數，葉齡，1-2葉間距分別提高了25％，20.5％，31.9％，31.4％，株高，第二葉長和葉綠素含量也得到不同程度的提高，效果非常顯著。此外，所述拜萊青霉VLD-11能與羥磷灰石協同作用，有效促進游離態重金屬的固定，降低土壤中游離態重金屬的含量，在一定程度上的恢復重金屬污染土壤，前景廣闊。具體實施方式下面結合具體實施例進一步闡述本發明。對于實施例中所用到的具體方法或材料，本領域技術人員可以在本發明技術思路的基礎上，根據已有的技術進行常規的替換選擇，而不僅限于本發明實施例的具體記載。本發明所選用的設備和試劑可以選自市售任意一種。實施例1具有解磷功能的微生物篩選與鑒定1、初篩土壤樣品：取自山東省萊州市彭家磷礦區的土壤；土壤稀釋液的制備：稱取0.5g土壤樣品溶于4.5ml無菌水中制成1：10的土壤溶液，然后從中吸取0.5ml土壤溶液置于4.5ml無菌水中，制成1：100的土壤溶液，以此方法類推，制備1：106-107的土壤稀釋溶液。取0.1ml土壤稀釋溶液均勻涂布于難溶性無機磷固體培養基(葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KC10.3g，MgSO4·7H200.3g，FeSO4.7H200.03g，MnSO4.4H200.03g，Ca3(PO4)25.0g，蒸餾水1000ml，pH7.0-7.5，瓊脂20g，115℃滅菌30min)上，30℃培養箱中倒置培養2-3天，觀察培養基上長出的菌落，其中有11個菌落周圍產生了明顯的顏色變化，并有透明圈產生，將其分別命名為VLD-1，VLD-2，……，VLD-11。2、復篩將實施例1初篩得到的11株菌分別接種到難溶性無機磷固體培養基(葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KC10.3g，MgSO4·7H200.3g，FeSO4.7H200.03g，MnSO4.4H200.03g，Ca3(PO4)25.0g，蒸餾水1000ml，pH7.0-7.5，瓊脂20g，115℃滅菌30min)上，30℃培養3天后，觀察菌落周圍透明圈的大小，結果發現透明圈最大的3株菌株分別為VLD-2，VLD-9，VLD-11。將上述3株菌分別接種到50mL難溶性無機磷液體培養基(葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KC10.3g，MgSO4.7H200.3g，FeSO4.7H200.03g，MnSO4.4H200.03g，Ca3(PO4)25.0g，蒸餾水1000ml，pH7.0-7.5，115℃滅菌30min)中，30℃，200rpm，培養7天，同時以不加任何菌的液體解磷培養基作為對照組；分別檢測培養液中的有效磷的含量，具體結果見表1。2.1磷標準曲線的繪制依次吸取5mg/l的磷標準溶液0.0、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、3.2、4.0ml于試管中，然后各加入鉬銻抗顯色劑2ml，蒸餾水定容至20ml，搖勻靜置20min，700nm波長下測定吸光度。此時各管中磷的濃度分為：0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.50、0.80、1.00mg/l。以磷濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制磷標準曲線。2.2培養液有效磷含量測定在無菌條件下分別取上述3株菌的培養液各5ml，8000rpm，離心5min，取上清液，稀釋到合適的濃度，吸取0.5ml稀釋液至試管中，加5ml蒸餾水，加2滴2,4-二硝基酚指示劑，加2ml鉬銻抗顯色劑，然后用蒸餾水定容至20ml，搖勻靜置20min，于700nm波長下比色，吸光度值代入標準曲線計算上清液中的有效磷含量，具體結果見表1。表1不同菌株的解磷效果樣品有效磷含量(mg/mL)空白對照組0VLD-21.254VLD-91.139VLD-111.976從表1中的數據可以看出，本發明從磷礦區土壤中篩選到的三株菌株均具有較強的解磷能力，能將培養基中的難溶磷(Ca3(PO4)2)分解成可溶性的有效磷，其中VLD-11菌株的的解磷效率最高，其培養液中有效磷含量高達1.976mg/mL，取得了意料不到的效果。3、菌株鑒定申請人采用分子生物學的方法對篩選到的VLD-11菌株進行鑒定，測得其18srDNA序列，并在GenBank核酸數據庫中進行blast比對。結果顯示，其18srDNA序列與拜萊青霉(Penicilliumbilaji)的序列相似度最高，達99％。申請人確認VLD-11菌株為拜萊青霉(Penicilliumbilaji)，并將其命名為拜萊青霉VLD-11(PenicilliumbilajiVLD-11)。申請人已于2015年11月23日將上述拜萊青霉VLD-11(PenicilliumbilajiVLD-11)于保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO：M2015690。實施例2拜萊青霉VLD-11在油菜大田栽培實驗中的應用1、拜萊青霉VLD-11菌液的制備：先將上述拜萊青霉VLD-11接種到PDA固體培養基上，30℃培養3-4天至孢子成熟，將長好的孢子用適量無菌生理鹽水洗下，轉接入馬鈴薯液體培養基中，充分混合均勻，于30℃培養4天，發酵液中孢子含量為109-1010CFU/mL。2、實驗地點：青島市嶗山區枯桃村油菜種植大棚，土壤整體狀況較為均勻。3、實驗過程：選取2m×2m的方形區域作為一個實驗區，共設置30個實驗區，且每個實驗區之間保持1米的間隔。實驗共設3個組：①空白對照組：不添加任何物質；②培養基處理組：在每個實驗區中按40mL/m2的比例均勻噴灑上述滅菌的馬鈴薯液體培養基，然后將表層5-10cm厚的土壤進行有效混勻；③拜萊青霉VLD-11處理組：在每個實驗區中按40mL/m2的比例均勻噴灑上述拜萊青霉VLD-11發酵菌液，然后將表層5-10cm厚的土壤進行有效混勻。每個組隨機選擇10個實驗區。1)種子處理：用5％的次氯酸鈉表面滅菌油菜種子10min，用蒸餾水清洗3-4次除去次氯酸鈉后在常溫下放置30min自然干燥。2)播種與收獲：在每個實驗區均勻播種30g油菜種子，定時澆水和管理，不施加肥料。播種45天后，收獲全部油菜，并分別檢測每個實驗區油菜的鮮重和干重，計算每個處理組油菜的平均鮮重和平均干重，進行比較。3)收獲油菜的同時，分別采集每個實驗區的土樣，采用Olsen法檢測土樣中有效磷的含量，并進行比較。試驗結果表明：與空白對照組相比，培養基處理組油菜的平均鮮重和干重分別提高了5.56％和6.21％，有效磷含量提高了3.1％；拜萊青霉VLD-11處理組油菜的平均鮮重和干重比空白對照組分別提高了354.7％和297.8％，比培養基處理組分別提高350.9％和292.7％，有效磷含量比空白處理組提高了89.8％，比培養基處理組提高了87.1％。從而說明，使用本發明篩選到的拜萊青霉VLD-11能有效提高土壤中有效磷的含量，進而大幅度提高種植作物的產量，取得了意料不到的效果。本發明所述拜萊青霉VLD-11可單獨使用，也可與黑曲霉、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、丁酸梭菌、草酸青霉中的任意一種或兩種或多種的組合混合制備解磷菌劑，能使土壤中有效磷的含量普遍提高50％-90％，效果顯著。實施例3拜萊青霉VLD-11在水稻育苗中的應用1、實驗地點：黑龍江省鶴崗市寶泉嶺農場二隊4號育苗大棚。2、實驗處理組設計：空白對照組：僅采用育苗基質(購自浙江錦海育苗基質廠)；拜萊青霉VLD-11處理組：1.2kg拜萊青霉VLD-11孢子粉(109CFU/g)與1噸育苗基質摻勻；以上兩個處理組的播種、灌溉和施肥等管理相同，整個育苗期約為40天。3、實驗結果及分析(1)水稻秧苗形態及葉綠素含量評價從各處理組育苗盤的中央隨機抽取100株秧苗，用清水沖洗干凈后進行考苗，并檢測第二葉的葉綠素含量。結果見表3。表2拜萊青霉VLD-11對水稻苗株生長的影響從表2的結果可以看出，本發明提供的拜萊青霉VLD-11能顯著提高水稻的育苗質量。與空白對照組相比，拜萊青霉VLD-11處理組水稻秧苗的莖粗，根數，葉齡，1-2葉間距分別提高了25％，20.5％，31.9％，31.4％，株高，第二葉長和葉綠素含量也得到不同程度的提高，效果非常顯著。(2)水稻秧苗素質評價百株干重和壯苗指數是秧苗素質高低的重要指標。壯苗指數＝(莖粗×100株秧苗全株干重)/株高。本發明所述拜萊青霉VLD-11處理組的水稻秧苗百株干重比空白對照組增加了36.32％，壯苗指數增加了56.15％，取得了意料不到的技術效果。綜上所述，本發明篩選到的拜萊青霉VLD-11不僅能有效提高土壤中有效磷的含量，還能能有效加快水稻秧苗的葉齡進程，有利于爭取積溫；增加莖粗，有利于莖維管束的發育，為保障水稻穗數和形成大穗提供了必要的秧苗基礎；增加葉間距和葉長，提高葉片葉綠素含量，有利于促進光合作用和光合產物的積累；增加水稻根數，有助于加快秧苗移栽后的返青速度。因此，所述拜萊青霉VLD-11能顯著提高水稻秧苗的素質，進而直接有利于提高水稻產量。實施例4拜萊青霉VLD-11在土壤修復中的應用采集青島市嶗山區仰口景區山地土壤10kg。所釆土壤在干燥通風處自然風干，研磨過2mm孔徑篩，混勻，污染Pb的添加濃度為2g/kg，以Pb(NO3)2溶液的形式加入土壤后混勻，置通風處自然風干，老化60天后過2mm孔徑篩，并充分混勻，土壤中Pb2+含量為2.04g/kg。分別稱取過8目的風干土壤200g于500mL三角瓶中，處理組1只添加10g羥基磷灰石(100目)；處理組2只添加2g拜萊青霉VLD-11孢子粉(109CFU/g)；處理組3同時添加10g羥基磷灰石(100目)和2g拜萊青霉VLD-11孢子粉(109CFU/g)。將羥基磷灰石、拜萊青霉VLD-11孢子粉與土壤充分混勻，用去離子水調節土壤含水量至20％～25％，于室溫培養，同時設置空白對照組，各處理設置三個重復。培養30天后，取樣烘干，分別用二乙三胺五乙酸(DTPA)溶液浸提游離態重金屬鉛，振蕩過濾，測定濾液中游離鉛的濃度，計算游離鉛的去除率，具體結果見表1。表1羥基磷灰石和/或拜萊青霉對土壤中游離鉛的去除效果從表1的結果可以看出，單獨添加5％羥基磷灰石的處理組1土壤中游離鉛的去除率僅為19.75％，而單獨添加1％本發明提供的拜萊青霉VLD-11孢子粉的處理組2土壤中游離鉛的去除率能達到30.78％，效果非常顯著；同時添加羥基磷灰石和拜萊青霉VLD-11的處理組3土壤中游離鉛的去除率高達90.64％，說明拜萊青霉VLD-11能與羥磷灰石協同作用，有效促進游離鉛的固定，降低土壤中游離鉛的含量，在一定程度上的恢復鉛污染土壤。除了鉛污染土壤之外，對于其他重金屬污染土壤，如鋅污染、銅污染、鎘污染、汞污染等，本發明提供的拜萊青霉VLD-11均具有一定的修復效果，對游離態重金屬的去除率能達到30％以上，拜萊青霉VLD-11與羥磷灰石協同作用，對游離態重金屬的去除率能達到85％以上，效果顯著，應用前景廣闊。當前第1頁1 2 3