本發明屬于棉花分子育種
技術領域：
：，涉及到一種棉花多基因聚合育種材料的分子檢測方法，是一種快速棉花育種材料的分子檢測方法，主要用于轉高產（高衣分FBP：：IaaM）和抗蟲等重要基因棉花品系聚合育種過程中棉花材料的分子檢測。
背景技術：
：：棉花是關系國計民生的重要戰略物資，是僅次于糧食的第二大農作物，涉及到農業和紡織工業兩大產業，在國民經濟中起著重要作用。近年來，在國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）、高技術研究發展計劃（863計劃）和轉基因生物新品種培育重大專項等項目的支持下，以改良品質、提高產量、增強抗逆性等為特征的在第二代轉基因技術在棉花遺傳改良中取得了突破性進展，中國農業科學院棉花研究所、西南大學、復旦大學等單位在轉基因高衣分棉花材料（轉FBP：：IaaM基因）（ZhangM.etal.Spatiotemporalmanipulationofauxinbiosynthesisincottonovuleepidermalcellsenhancesfiberyieldandquality,NatureBiotechnology,2011,29(5):453-458.）、轉基因大鈴優質棉花材料（轉RRM基因）（SunF,LiuC,ZhangC.etal.AconservedRNArecognitionmotif(RRM)domainofBrassicanapusFCAimprovescottonfiberqualityandyieldbyregulatingcellsize.MolecularBreeding,2011,30(1),93-101）、海島棉優質漸滲系（蘭孟焦，楊澤茂，石玉真等，陸海BC4F2和BC4F3代換系的評價及纖維產量與品質相關QTL的檢測，中國農業科學，2011,44(15):3086-3097.）和棉花優質纖維品種培育(袁有祿,石玉真,李俊文等.轉基因抗蟲優質雜交棉-中棉所70，中國棉花，2009，2，17.)等方面取得了了突破性進展，要將將上述新材料快速應用于棉花育種實踐，亟需發明一種簡單、快速和準確性高的分子檢測方法。首先，在棉花育種實踐中，要將第二代高衣分等轉基因新材料快速應用于棉花育種，并與常規育種有機結合起來，形成在棉花分子育種技術體系，亟需發展一系列簡單、快速和準確性高的分子檢測技術，以提高選擇效率、縮短育種周期；其次，隨著轉Bt基因抗蟲棉大面積推廣，國內棉花育種單位普遍采用卡那霉素鑒定的方法進行材料抗蟲性的早期篩選，但由于棉花遺傳轉化中應用的標記基因以NptII基因為主，因此，卡那霉素抗性鑒定在轉基因高衣分、轉基因大鈴優質等材料與抗蟲品系等育種群體的選擇中，難以實現FBP：：IaaM、RRM基因與Bt基因的同步選擇，因此，，需要對以卡那霉素鑒定為代表的轉基因鑒定方法進行改良，發展一些快速、簡便等分子檢測方法，為開展棉花分子聚合育種，提高選擇效率奠定良好的技術基礎。有鑒于此，本發明將卡那霉素抗性鑒定、簡化棉花總DNA提取、多重PCR擴增和非變性聚丙烯核酸電泳等技術進行組裝，發明了棉花高衣分和抗蟲等多基因聚合育種的快速檢測方法，可以從多基因聚合育種群體中快速的鑒定出含有FBP：：IaaM基因與抗蟲基因的個體，這對于快速利用轉FBP：：IaaM基因棉花新材料，實現高衣分、抗蟲等重要基因的有效聚合，提高育種效率等均具有重要意義，同時，該方法還可應用于攜帶有上述基因棉花材料的定性檢測。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是提供一種快速實現轉FBP：：IaaM親本及其與轉Bt抗蟲棉花材料雜交、回交等不同世代材料的FBP：：IaaM與Bt基因的分子檢測方法，可以從多基因聚合育種群體中快速的鑒定出含有FBP：：IaaM基因與抗蟲基因的個體，技術可靠、操作簡便、結果準確、成本低等有優點，可有效提高選擇效率，縮短育種周期。本發明提供的技術方案是：一種快速實現轉FBP：：IaaM親本及其與轉Bt抗蟲棉花材料雜交、回交不同世代材料的FBP：：IaaM與Bt基因的分子檢測方法，該方法包括以下步驟：（1）采用噴霧加涂抹的方法對棉花抗性進行卡那霉素鑒定；（2）提取提取含有目的基因棉花基因組DNA；（3）以第（2）步中提取的基因組DNA為模板，將FBP：：IaaM轉基因系基因檢測特異性引物（P1）、Bt毒蛋白基因（B1）和內標基因Sad1基因引物S1，分別進行單一PCR擴增和多重PCR擴增，其中，2個SSR特征引物堿基序列為：引物B1：Cry-F：5’-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3’；Cry-R：5’-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3’；引物P1：G-P1：5’-ttttggtgaaattctggtctgc-3’G-P2：5’-aaaacagggcttggattag-3’（4）對擴增產物進行凝膠電泳；（5）對電泳結果進行分析：卡那霉素抗性的植株初步認定為攜帶有Bt基因或/和轉FBP：：IaaM基因材料，進入下一步試驗；分別使用引物P1、引物B1和S1的目的片段與該三對引物的多重PCR目的片段的大小一致，說明該方法結果可靠；使用引物組合B1/P1，以FBP：：IaaM基因純系與轉基因抗蟲棉F1代植株、非轉基因純系為模板時，在F1的5個單株中，均可以擴增出相應的目的條帶，而非轉基因系則未見有擴增產物，說明B1/P1的引物組合可以同時檢測FBP：：IaaM基因和Bt基因；使用B1/S1引物組合，分別以轉基因抗蟲棉純系和非轉基因純系為模板，轉基因抗蟲棉純系的不同單株均可以檢測到Bt和Sad基因，而非轉基因純系只能檢測到Sad基因，說明B1/S1的引物組合可以區分抗蟲棉和非抗蟲棉系。本發明所述的分子檢測方法，第（2）步中，PCR擴增反應體系為：反應體系為20μ1，其中各試劑終濃度為，10×Buffer為1×，dNTPs0.50nM，引物P10.2μM、引物B10.1μM、引物S10.01μM，模板DNA3.00ng，TaqDNA聚合酶0.20U/μL；反應程序為：94℃預變性4min，；94℃變性40s，58℃退火40s，72℃延伸1min，30個循環；72℃延伸10min；4℃保存待用。本發明方法中，卡那霉素鑒定采用噴霧加涂抹的方法進行，棉花發育時期為三葉一心，卡那霉素（KanamycinSulphate）濃度為2500mg·kg-1，每畝用量為15.0kg，第一次鑒定采用噴霧法，對棉苗心葉噴霧，有黃化斑的轉基因棉花苗即為陰性植株，轉基因棉花子葉上沒有黃化斑的綠苗即為陽性植株；第二次鑒定采用涂抹法，對部分不抗卡那霉素的植株采用涂抹的方法進行鑒定，有黃化斑的轉基因棉花苗即為陰性植株，轉基因棉花子葉上沒有黃化斑的綠苗即為陽性植株。這些方法具有：（1）時期早，三葉一心，便于及時拔除非卡那霉素抗性植株；（2）簡單易操作，第一次鑒定可使用噴霧器等簡單農具進行，第二次對部分卡那霉素反應植株進行涂抹的方法進行，操作簡便，可在田間大面積鑒定材料；（3）鑒定時間短，晴好天氣4天可見效果，7天之內可以獲得最終結果。本發明簡化CTAB法提取棉花總DNA：將棉花基因組DNA提取方法（CTAB法，PattersonAH,BrubakerCLandWendelJF.Arapidmethodforextractionofcotton(Gossypiumssp)genomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis.PlantMolecularBiologyReporter,1993,11:122-127.）進行了簡化，對其裂解液配方和提取步驟（裂解液配方和提取步驟見本發明實施例部分）進行了優化，縮短了DNA提取時間，提高了工作效率，且可以得到了較高質量DNA。多重PCR：將FBP：：IaaM轉基因系基因檢測特異性引物（P1）、Bt毒蛋白基因（B1）和內標基因Sad1基因（Sad1，Stearoyl-acylcarrierproteindesaturase；GenbankNo.AJ132636，來源于陸地棉，與海島棉、小麥、玉米、大麥、煙草、西紅柿、油菜、水稻、向日葵等植物同源基因的序列相似性很低）引物S1，利用一次PCR擴增即可檢測Bt毒蛋白、FBP：：IaaM等兩個基因目的片段，同時利用內標基因Sad1監控反應體系；本發明對上述引物的擴增條件和引物濃度進行了優化，得到了最適引物濃度組合和擴增條件（反應體系見本發明具體實施方式）。非變性聚丙烯核酸電泳：主要用于多重PCR擴增產物的檢測，凝膠濃度為8.0%，由于該方法具備無電滲作用、樣品用量少(1.2-2.0μl)、分辨率高(1-100ng)、重復性好等特點，可以有效提高檢測效率，并適用于較小體積（≤10μl）PCR體系擴增產物的檢測，降低檢測成本；由于該凝膠電泳具備較高的分辨率，通過與對照比較，可減少引物二聚體、非特異性擴增等陽性DNA片段的檢測，可提高檢測準確性，與瓊脂糖電泳比較，由于該方法點樣量較小，較小體積（≤10μl）PCR體系可以進行多次電泳檢測，便于不同批次間樣品的比較。與現有方法比較，本發明具有以下優點：本發明用于棉花高衣分與抗蟲等基因分子聚合育種過程中材料的分子檢測，本發明將卡那霉素抗性、簡化CTAB法提取棉花總DNA、多重PCR和非變性聚丙烯酰胺DNA凝膠電泳等技術進行有效組合，可快速實現轉FBP：：IaaM親本及其與轉Bt抗蟲棉花材料雜交、回交等不同世代材料的FBP：：IaaM與Bt基因的分子檢測，并從中快速鑒定出含有FBP：：IaaM和Bt基因的個體，為高衣分、抗蟲等基因的分子聚合育種提供了簡單、快速和準確性高的分子檢測方法。本方法能夠彌補已有卡那霉素抗性鑒定技術的不足，可用于轉FBP：：IaaM基因棉花新材料與轉Bt基因抗蟲棉品系育種群體后代材料的分子檢測和帶有上述基因棉花材料的定性檢測，與傳統方法比較，具有技術可靠、操作簡便、結果準確、成本低等有優點，可有效提高選擇效率，縮短育種周期。附圖說明圖1為樣品DNA完整性檢測圖。圖2為單一PCR擴增和多重PCR擴增對比圖。圖3為B1/P1的引物組合擴增結果圖。圖4為B1/S1的引物組合擴增結果圖。圖5為利用三對引物對FBP：：IaaM基因純系與轉基因抗蟲棉聚合育種群體部分單株進行多重PCR擴增結果圖。具體實施方式該發明方法可用于FBP：：IaaM與Bt基因聚合育種及攜帶有FBP：：IaaM和Bt基因棉花材料的定性鑒定。實施例11.對棉花抗性進行卡那霉素鑒定：在棉花苗期（三葉一心）用2500mg/L的卡那霉素溶液噴霧，4-7天后觀察葉片顏色，對于葉片出現黃斑的植株，用相同濃度的卡那霉素溶液涂抹倒二葉，4-7天進行確認，如果仍然出現黃斑，則認為分離出來的非轉基因雜株，直接淘汰?？敲顾乜剐缘闹仓瓿醪秸J定為攜帶有Bt基因或（和）轉FBP：：IaaM基因材料，進入下一步試驗。提取提取含有目的基因棉花基因組DNA：取卡那霉素抗性單株的幼葉100.0mg，提取DNA，DNA提取方法如下。棉花總DNA采用簡化CTAB法提取，具體步驟如下：1)取單株幼葉一片（約50-100mg），置于2.0mL離心管中，液氮速凍，使用RetschMM400將樣品研磨成粉末，加入約0.6mL裂解緩沖液（氯化鈉1.4M、EDTA0.02M、Tris-HCl0.1M、2%十六烷基三甲基溴化銨、3%PVP(K40)、0.3%抗壞血酸、pH8.0)搖勻，65℃水浴30min，每10min搖一次。2)加等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提液，冷卻后，搖勻至乳濁液，離心10min（13000g，16℃）。3)吸取上清，轉入新的1.5mL離心管，加入0.6倍體積的冰凍異丙醇，緩慢搖勻至沉淀析出。4)鉤出沉淀，轉入滅菌1.5mL離心管，70％酒精浸泡30min；換無水乙醇洗一遍，倒干凈乙醇，風干，在DNA沉淀仍有些潮濕的時候，用適量體積的TE溶解。隨機取部分DNA，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性（每100mL瓊脂糖溶液中加入5μL溴化乙錠溶液），利用凝膠成像儀進行DNA檢測，DNA濃度及純度用ThermoScientificNaNoDrop2000cSpectrophotometer檢測，上述的DNA提取方法可以得到質量較好的棉花總基因組DNA，其電泳條帶邊緣較為清晰，基本無降解較，RNA殘留較少（圖1），通過檢測DNA樣品的230、260和280nm的吸光值可以發現，260/280和260/230比值在2.0附近（表一），DNA純度較好，濃度平均值為590.36ng/ul，濃度較高，可以用于下一步試驗。表一：DNA濃度編號A260A280260/230260/280濃度（ng/ul）11.020.4661.792.2511.1021.020.4771.642.15512.2131.250.5991.82.10629.6241.040.5271.51.98522.9050.900.4131.722.18451.8161.220.5551.992.21613.9371.330.6231.902.14666.8081.230.5731.792.15616.9091.570.7462.002.11788.00平均值1.180.551.792.14590.363.進行單一PCR擴增和多重PCR擴增：用于證明的多重PCR體系的可靠性，選擇FBP：：IaaM基因純系與轉基因抗蟲棉F1代的7個單株用于多重PCR體系可靠性的驗證工作，分別用表四中的4個PCR反應體系進行目標基因的擴增，多重PCR擴增體系如下：選用Bt毒蛋白基因通用引物（Cry1Ac基因、Cry1Ab基因、以及Cry1Ac與Cry1Ab融合基因）、FBP：：IaaM轉基因系基因特異性引物和內標基因（Sad1基因），利用一次PCR擴增Cry1ac、FBP：：IaaM和sad基因等片段，本發明引物序列如下：Bt毒蛋白基因序列通用引物B1（cry1Ac基因、cry1Ab基因、以及cry1Ac與cry1Ab融合基因）,擴增片段大小為340bp，用于檢測Bt蛋白基因（王奕海，謝家建，張永軍等.一種檢測抗蟲棉中不同Bt基因表達盒結構的PCR方法,農業生物技術學報2009,17(5):914-919）。Cry-F：5’-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3’；Cry-R：5’-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3’；轉FBP：：IaaM基因高衣分棉花材料檢測引物P1,擴增片段大小為660bp，用于檢測FBP：：IaaM基因：G-P1：5’-ttttggtgaaattctggtctgc-3’G-P2：5’-aaaacagggcttggattag-3’Sad1基因（Sad1，Stearoyl-acylcarrierproteindesaturase；GenbankNo.AJ132636，來源于陸地棉，與海島棉、小麥、玉米、大麥、煙草、西紅柿、油菜、水稻、向日葵等植物同源基因的序列相似性很低）擴增引物S1，產物大小為108bp，主要用于檢測PCR擴增體系(YangL,PanA,ZhangK.etal.,QualitativeandquantitativePCRmethodsforeventspecificdetectionofgeneticallymodifiedcottonMon1445andMon531,2005,14(6):817-831)：s-F:5’-CCAAAGGAGGTGCCTGTTCA-3’s-R:5’-TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC-3’經過對PCR擴增體系的優化，引物P1、B1和S1的最佳組合濃度組合為（P1：B1：S1=0.2：0.1：0.01），其中，20μL反應體系見表二和表三：表二引物組合120μ1體積的擴增反應體系表三：PCR的反應體系PCR程序如下：P1、B1和S1等引物組合反應程序：（1）94℃預變性4min；（2）94℃變性40s，58℃退火40s，72℃延伸1min，循環數為30，（3）72℃延伸10.0min。目標基因的擴增產物用凝膠銀染分析，具體方法如下：多重PCR擴增的產物利用8%非變性聚丙稀酰胺凝膠電泳檢測（配方見表四），凝膠大小180×120mm，厚度1.0mm，電泳緩沖液為1×TBE（Tirs-硼酸緩沖液），電泳電壓180V，電泳時間為50-60min。電泳結束后，按照張軍（張軍,武耀廷,郭旺珍,張天真.棉花微衛星標記的PAGE/銀染快速檢測.棉花學報,2000,12(5):267-269.）的方法進行銀染，并稍作修改。1)固定：將取下的凝膠置于盛有固定液(340mL無離子水+40mL95%酒精＋20mL10％乙酸)的盒子中，并于搖床上輕搖，固定至少5~6min，用純水沖洗一次凝膠。2)滲透：加入300mL滲透液(0.6gAgNO3＋300mL無離子水)，在搖床上滲透12min，用純水漂洗兩遍，每次約30s。3)顯色：加入400mL顯色液(6gNaOH＋4mLCH2O＋4mL0.2%Na2S2O3＋400mL無離子水)，搖動至條帶清晰地顯出，倒去顯色液，然后用純水洗兩遍。4)終止：加入400mL終止液(3gNa2CO3＋400mL無離子水)，暫時保存，分析結果。表四：凝膠配制（8％）結果顯示，分別使用P1（圖2中D）、B1（圖2中C）和S1（圖2中B）的目的片段與多重PCR（三對引物，圖2中A）目的片段的大小一致，證明該方法結果可靠（請參見圖2）。實施例2該實施例用于證明的引物組合B1/P1、以及B1/S1引物組合的可靠性，分別選擇轉FBP：：IaaM基因純系與轉基因抗蟲棉F1代植株、轉基因抗蟲棉純系和非轉基因純系進行。PCR擴增體系分別用表五中所述的兩個PCR反應體系進行（PCR程序同實施例1），目標基因擴增產物的分析方法與實施例1中所述一致。結果顯示，使用引物組合B1/P1，以FBP：：IaaM基因純系與轉基因抗蟲棉F1代植株、非轉基因純系為模板時，在F1的5個單株中，均可以擴增出相應的目的條帶（圖3中1-5），而非轉基因系則未見有擴增產物（圖3中6），說明B1/P1的引物組合可以同時檢測FBP：：IaaM基因和Bt基因；使用B1/S1引物組合，分別以轉基因抗蟲棉純系和非轉基因純系為模板，轉基因抗蟲棉純系的不同單株均可以檢測到Bt和Sad基因（圖4中1、3-7），而非轉基因純系只能檢測到Sad基因（圖4中2），說明B1/S1的引物組合可以區分抗蟲棉和非抗蟲棉系。表五：實例2的反應體系實施例3育種后代群體的多重PCR分析用實施例2表五中的擴增體系1對FBP：：IaaM基因純系與轉基因抗蟲棉聚合育種群體部分單株進行多重PCR擴增，并分別選用轉FBP：：IaaM基因純系與轉基因抗蟲棉F1代植株、轉基因抗蟲棉純系和非轉基因純系作為對照，（PCR程序同實施例1），目標基因的擴增產物分析方法同實施例1（結果見圖2）。結果顯示，轉FBP：：IaaM基因純系與轉基因抗蟲棉F1代單株、轉基因抗蟲棉純系單株和非轉基因純系單株作為對照分別使用分別擴增除了與目的條帶分子量一致的3、2和1個條帶（圖5中1.、2和3）、其他單株的DNA分別擴增出3個（圖5中5、8和9）、2個（圖5中4、6、7和10）和1個條帶（圖5中11）。實施例4育種后代群體的結果分析利用卡那霉素鑒定鑒定后，提取陽性植株的DNA作為模板，如果三對引物的多重PCR反應中，FBP：：IaaM基因、Bt基因（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac與cry1Ab融合基因）和Sad1內標基因的序列得到了擴增，且擴增片段大小與預期片段大小一致，而在陰性對照中僅擴增出Sad1基因片段，空白對照中沒有任何擴增片段，表明PCR反應體系正常工作。如果Sad1內標基因沒有擴增，則表明PCR反應體系不正常，需要查找原因重新檢測。在PCR反應體系正常工作的前提下，育種群體后代的檢測結果通常有以下幾種情況：（1）在試樣PCR反應中，只有Sad1內標準基因得到擴增，則該單株不攜帶有Bt（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac與cry1Ab融合基因）抗蟲基因和FBP：：IaaM基因。（2）在試樣PCR反應中，Sad1內標準基因和Bt（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac與cry1Ab融合基因）抗蟲基因得到了擴增，則該單株攜帶有Bt（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac與cry1Ab融合基因）抗蟲基因。（3）在試樣PCR反應中，Sad1內標準基因和FBP：：IaaM基因得到了擴增，則該單株攜帶有FBP：：IaaM基因。（4）在試樣PCR反應中，Sad1內標準基因、Bt（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac與cry1Ab融合基因）抗蟲基因和FBP：：IaaM基因均得到了擴增，則該單株攜帶有Bt（cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac與cry1Ab融合基因）和FBP：：IaaM基因，該單株為中選單株，可用于下一步研究。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3