技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種Real-Time Q-PCR檢測融合基因BCR-ABL(P210）mRNA表達的試劑盒，特別是涉及以一步法實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（Real-Time Q-PCR）技術快速、定量檢測融合基因BCR-ABL(P210） mRNA的試劑盒。

背景技術：

慢性粒細胞白血?。–hronic Myeloid Leukemia,CML）是一種起源于造血干細胞的惡性增生性疾病，其細胞遺傳學特征表現為具有特異性的費城染色體（Philadephis，Ph）。該特異性費城染色體是由t (9；22)(q34；11)易位形成的。9號染色體原癌基因ABL易位至22號染色體的斷裂點簇集區(BCR)，發生重排，產生BCR/ABL融合基因。BCR/ABL融合基因轉錄為8.5kDa的bcr/abl融合蛋白（P210 bcr/abl），該蛋白具有異常增強的酪氨酸激酶（Tvrosine Kinases，TK）活性， 能使造血干細胞發生異常轉化而導致CML的突變。根據BCR斷裂點位置的不同分為3個主要類型：M-bcr、m-bcr、μ-bcr，分別編碼三種蛋白為：p210蛋白、p190蛋白、p230蛋白。其中95%以上的CML患者表達p210蛋白，急性前B細胞白血病具有BCR-ABL融合蛋白陽性患者中有30%以上表達p210蛋白。因此p210 蛋白不僅在CML患者中表達，也在急性髓系白血病患者中有表達。目前常用的實驗室檢測方法主要包括染色體核型分析、FISH、PCR檢測等。

Real-TimePCR技術是今年來發展迅速的一種核酸檢測技術，使用一種帶有核電偶聯裝置（CCD）的PCR擴增儀，通過檢測熒光信號的動態變化實時反映PCR的每個循環的擴增水平。CCD能夠按照一定的程序周期性地發出特定波長的激發光，收集檢測熒光信號，并通過軟件分析匯總到工作站得到擴增曲線。一步法Real-Time RT-PCR技術是Real-Time PCR的一種（參考文獻：Yuqi Z, Min Y, Johann WM et al., Quantification of human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral DNA by Using TaqMan Technology, J Cli Microbiol, 40（2）：675-678, 2002； Drosten C, Seifried E, Roth WK et al., TaqMan 5-nuclease human immunodeficiency virus type 1 PCR assay with phage-packaged competitive internal control for high-throughput blood donor screening, J Clin Microbiol, 39:4302-4308, 2001； Schuurman R, Descamps D, Weverling GJ, et al., Multicenter Comparison of three commercial methods for quantification of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J Clin Microbiol., 34(12):3016-22, 1996; Christopherson C, Kidane Y, Conway B, et al., PCR-Based assay to quantify human immunodeficiency virus type 1 DNA in peripheral blood mononuclear cells. J Clin Microbiol., 38(2):630-4, 2000.），它是一種直接快速檢測RNA的方法，與檢測DNA的Real-Time PCR相比，不同之處在于前者在反應體系中增加了逆轉錄酶，同時多了一個逆轉錄反應步驟；相同之處在于兩者在反應體系中均有一條兩端分別標記熒光報告基團和淬滅基團的探針，探針結構完整時，熒光報告基團發出熒光的能量轉移給淬滅基團，呈現淬滅效應。如果擴增過程中有靶序列的存在，擴增的過程中探針分子逐漸被水解切斷，熒光報告基團與淬滅基團相互解離，阻斷了二者間熒光共振能量轉移效應，熒光報告基團發出熒光信號。隨著擴增的進行，熒光信號隨著目的片段的擴增而呈現線性增強。

本試劑盒采用TaqMan熒光探針技術，選取融合基因BCR-ABL(P210）及內參基因ABL為靶區域，分別設計特異性引物及熒光探針，其中熒光探針5’端標記熒光發射基團FAM，3’端標記非熒光淬滅基團BHQ1，利用熒光PCR檢測儀可在FAM通道檢測熒光信號。由于內參基因ABL在細胞中的表達相對恒定，在本試劑盒中可作為內參對起始細胞量進行校正，用于整個核酸提取和反應體系的質量控制。通過簡單易操作的核酸提取系統，結合Real-Time PCR檢測系統運行一步法RT-PCR擴增程序，本試劑盒實現了檢測的高特異、高靈敏和高效率。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種Real-Time Q-PCR檢測融合基因BCR-ABL(P210）的mRNA試劑盒，特別是涉及以一步法實時熒光逆轉錄-聚合酶鏈反應（一步法Real-Time Q-PCR）技術快速、定量檢測融合基因BCR-ABL(P210） mRNA表達的試劑盒，以實現對外周血或骨髓樣本中融合基因BCR-ABL(P210） mRNA進行定量檢測，檢測慢性粒細胞白血病(CML)等血液系統腫瘤中融合基因BCR-ABL(P210） mRNA的表達水平，以有利于評價患者化療效果、預后及對微小殘留病變復發的監測。

為了實現本發明，所采取的技術方案為：

一種Real-Time Q-PCR檢測融合基因BCR-ABL(P210) mRNA表達的試劑盒，所述試劑盒包括：（1）BCR-ABL(P210)反應液、ABL反應液、一步法PCR酶系、BCR-ABL(P210)陽性定量參考品1-5、ABL陽性定量參考品1-4和陰性對照品，和（2）分隔并集中包裝這些試劑管的包裝盒；

其中，所述BCR-ABL(P210）反應液由正向引物、反向引物、寡核苷酸探針、PCR反應緩沖液等組成；所述BCR-ABL(P210)反應液中正向和反向引物分別是：

5’-TCCACAGCATTCCGCTGAC-3’（SEQ ID NO:1），

5’- CACTCAGACCCTGAGGCTCAAA-3’（SEQ ID NO:2）；

所述BCR-ABL(P210)反應液中寡核苷酸探針是：5’-X-GCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCT-Y-3’ （SEQ ID NO:3），其中X表示的是熒光報告基團，Y表示的是熒光淬滅基團；

所述ABL反應液由正向引物、反向引物、寡核苷酸探針、PCR反應緩沖液等組成；ABL反應液中正向和反向引物分別是：

5’-GACGTCTGGGCATTTGGAGTA-3’（SEQ ID NO:4），

5’-TCATACACCTGGGACAGGTCAA-3’（SEQ ID NO:5）；以上引物探針濃度均為2~10pmol/人份，優選引物濃度為5pmol/人份、更優選探針濃度為3pmol/人份。

所述ABL反應液中寡核苷酸探針是：

5’-X- ATGGCATGTCCCCTTACCCGGGA -Y-3’ （SEQ ID NO:6），其中X表示的是熒光報告基團，Y表示的是熒光淬滅基團；

所述BCR-ABL(P210)陽性定量參考品1-5均為含有BCR-ABL(P210)目的片段的重組質粒，其濃度為1×10³拷貝/5μL～1×10⁷拷貝/5μL；

所述ABL陽性定量參考品1-4均為含有ABL目的片段的重組質粒，其濃度為1×10³拷貝/5μl～1×10⁶拷貝/5μl。

其中，所述BCR-ABL(P210)反應液和ABL反應液中的PCR緩沖液包含10mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl和3.0mmol/L MgCl₂。

PCR反應體系包括BCR-ABL(P210）反應液、ABL反應液、一步法PCR反應酶系。

所述一步法PCR酶系包含逆轉錄酶（c-MMLV酶）、熱啟動Taq酶、RNasin、dNTPs、酶稀釋液組成。

所述c-MMLV酶用量為1.5~3.5U/人份、熱啟動Taq酶用量為3~7U/人份、RNasin用量為15~25U/人份、dNTPs濃度為0.20mmlo/L，酶稀釋液為一般市售的酶稀釋液。

所述BCR-ABL(P210）陽性定量參考品1-5均為含有BCR-ABL(P210）目的片段的重組質粒，濃度為10⁷copies/5ul~10³copies/5ul；ABL陽性定量參考品1-4均為含有ABL目的片段的重組質粒，濃度為10⁶copies/5ul~10³copies/5ul；質粒均由上下游引物擴增的PCR產物通過市售的載體克隆構建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5。

所述PCR擴增的最佳反應溫度和時間為：50℃ 15min，1個循環；95℃ 15min，1個循環；之后95℃ 15s，55℃ 45s，40～50個循環收集熒光信號。

所述陰性對照品為DEPC水；所述試劑盒的待檢樣品是外周血或骨髓。

用于靶多核苷酸擴增的引物探針濃度均為2~10pmol/人份，優選引物濃度為5pmol/人份、探針濃度為3pmol/人份。

本發明的試劑盒進行檢測的技術原理為：

（1）使用適當的核酸分析軟件分別對已知的融合基因BCR-ABL(P210）基因的核苷酸序列進行同源性比較，在找到同源區段的基礎上，進一步使用適當的引物設計軟件選擇并設計寡核苷酸引物和探針。由于所設計的引物和探針均具有互補于BCR-ABL(P210）基因的序列，而且與其他病原體的核苷酸序列沒有同源性，也不包括任何常見的核酸內切酶的酶切位點，所以避免了融合基因BCR-ABL(P210）檢測的假陰性和假陽性，提高了檢測的可靠性和準確度。同時設置了內參ABL基因作為相對定量標準，用于整個反應體系的質量控制，在本試劑盒中可作為內參對起始細胞量進行校正。

（2）使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物和探針，用分子篩和快速蛋白質液相層析法（FPLC）純化后進行氨解處理。同樣合成所需的探針序列，氨解處理后分別在其5’端標記作為熒光發生基團（報告基團）的6-FAM amidite，并在其3’端標記借助活性連接臂偶聯上作為熒光淬滅或抑制基團的BHQ1。以FPLC層析法純化熒光標記的探針。然后，使用變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠（20%）電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針。

（3）適宜于一步法Real-Time qPCR擴增的反應體系。反應體系包括逆轉錄酶、熱啟動Taq酶、2’-脫氧核苷三磷酸、RNA酶抑制劑（RNasin）、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結合的正向引物、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結合的反向引物、能夠與靶多聚核苷酸結合并且兩末端分別結合有熒光發生基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針、能夠與內標核苷酸結合并且兩末端分別結合有熒光發生基團和淬滅基團的檢測內標的寡核苷酸探針、含有鎂離子的緩沖液。

（4）從待測樣本中提取核酸mRNA，分別加入前述的反應體系中，直接經一步法Real-Time qPCR擴增，從熒光擴增曲線對未知樣本的核酸mRNA進行定量檢測。

本發明提供的一步法Real-Time qPCR試劑盒可以檢測出融合基因BCR-ABL(P210）的靈敏度為250 copies/5ul，說明本試劑盒具有非常好的靈敏度。

本發明針對融合基因BCR-ABL(P210）基因設計特異性引物和探針，檢測的線性范圍為5×10⁸copies/5ul~5×10²copies/5ul。

特別值得說明的是，為了確保本發明的基因mRNA檢測方法的準確性，我們還使用攜帶有BCR-ABL(P210）基因（cDNA）序列的重組質粒作為DNA陽性定量參考品。借助這些額外標準品，使用本發明的試劑盒在相同條件下進行平行檢測并制作所謂的外標定量標準曲線，以進一步驗證本發明試劑盒的檢測精密度和準確性，并作為生產本發明試劑盒附加的質量控制標準。

與基于擴增反應完成后進行單一終點檢測的傳統PCR試劑盒不同，Real-Time qPCR試劑盒可以在擴增反應的進程中隨時監測擴增產物的產生，從而大大提高了定量檢測的準確性和精密度。眾所周知，Real-Time qPCR是在PCR擴增體系中，同時加入引物和5’、3’末端分別標記有熒光報告基團（例如6-FAM amidite 羧基熒光素6）和熒光淬滅基團（例如6-羧基四甲基若丹明）的特異性寡核苷酸探針。如果探針沒有與靶序列互補結合，其序列保持完整，報告基團發射的熒光信號將被淬滅基團吸收，所以沒有熒光信號產生；而當PCR擴增反應進行時，DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性將降解熒光探針，導致熒光報告基團與熒光淬滅基團分離，因而熒光監測系統可接收并記錄到熒光信號。每擴增一條DNA鏈即有一個熒光分子產生，從而實現熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步，實時地監測整個PCR反應進程，并可借助標準曲線對未知靶多核苷酸（模板）進行定量分析。

利用已知起始拷貝數的標準品制作標準曲線，其中以靶多核苷酸起始拷貝數的對數為橫坐標，并以如上測得的Ct值為縱坐標。獲得未知量靶多核苷酸的Ct值后，即可從基于平行實驗得到的數據制作的標準曲線上得知其起始拷貝數的對數，然后計算出該靶多核苷酸的起始拷貝數（當擴增循環達到Ct值即初始進入指數擴增期時，Ct值得重現性極好，即同一靶多核苷酸在不同時間擴增或同一時間在不同管內擴增所得到的Ct值總是恒定的）。也就是說，基于上述的擴增反應結果推算出靶多核苷酸的量（起始拷貝數）。具體實現包括：（1）確定樣品中的靶多核苷酸經擴增后所產生的熒光達到基線以上的固定閾值時所需的閾循環次數；（2）將已確定的樣品中靶多核苷酸的閾循環次數與標準溶液中已知量靶多核苷酸的閾循環次數相比較，從而計算出樣品中靶多核苷酸的量。

本發明與現有技術相比，具有以下優點：

（1）通過檢測血液系統腫瘤中融合基因BCR-ABL(P210）的mRNA表達水平，有利于評價患者化療效果、預后及對微小殘留病變復發的監測。

（2）全封閉反應，提取RNA以后，直接用于Real-Time qPCR檢測，避免了污染發生。

（3）由于內參基因ABL在細胞中的表達相對恒定，因此，本試劑盒中選擇ABL作為內參對起始細胞量進行校正，用于整個核酸提取和反應體系的質量控制。

（4）同時使用攜帶有BCR-ABL(P210）基因和內參ABL基因序列的重組質粒作為陽性定量參考品，使用本發明的試劑盒在相同條件下進行相對定量的平行檢測，從而確保檢測結果的可靠性。

（5）本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過本發明的試劑盒實現對外周血或骨髓樣本中融合基因BCR-ABL(P210） mRNA進行定量檢測，檢測慢性粒細胞白血病(CML)等血液系統腫瘤中融合基因BCR-ABL(P210） mRNA的表達水平，以有利于評價患者化療效果、預后及對微小殘留病變復發的監測。其基本原理是利用熒光PCR技術，以融合基因BCR-ABL(P210）及內參基因ABL為靶區域，分別設計特異性引物及熒光探針，在樣本核酸純化之后，通過含有逆轉錄酶（c-MMLV酶）、熱啟動Taq酶、RNA酶抑制劑（RNasin）的一步法Real-Time Q-PCR對BCR-ABL(P210）基因的mRNA進行快速準確定量檢測。

附圖說明

圖1：實施例1 BCR-ABL(P210）陽性定量參考品1-5、陰性質控品的檢測結果。

圖2：實施例1 ABL陽性定量參考品1-4、陰性質控品的檢測結果。

圖3：實施例1 BCR-ABL(P210）基因的特異性實驗結果。

圖4：顯示8份白血病患者的樣品的檢測結果。

具體實施方式

下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發明。

實施例1：融合基因BCR-ABL(P210）試劑盒的檢測方法：

（1）標本采集、運送和保存

標本采集：抽取受檢者靜脈血或骨髓3-5ml，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）或枸櫞酸鈉抗凝劑的采血管，立即輕輕顛倒采血管混合5~10次，使抗凝劑與靜脈血或骨髓充分混勻，密閉送檢。

標本保存和運送：標本最好立即用于測試，在2-8℃條件下保存不應超過48小時；或者保存在-20±5℃待測，保存期為1個月；或者使用紅細胞裂解液處理全血或骨髓，獲得有核細胞沉淀后加入1ml RNA提取液，振蕩混勻，于-70±10℃保存1個月；避免反復凍融。

樣本運輸：0℃左右。

（2）核酸提取

1）在5×紅細胞裂解液瓶中加入24ml的無菌純化水稀釋成1×紅細胞裂解液；

2）取5ml潔凈離心管，加入抗凝血2ml;

3)加入2ml 1×紅細胞裂解液，蓋緊管蓋，漩渦振蕩15s以充分混勻，室溫放置3min。

4）室溫下，6,000rpm離心5min，去上清，保留沉淀；

5）重復步驟3~4一次，盡可能吸除殘存液體；

6）加入1ml RNA提取液，蓋緊管蓋，漩渦振蕩15s以充分混勻，再將其轉移至1.5ml離心管并靜置5min；

7）加入200μl氯仿，蓋緊管蓋，用力上下振搖15s（小心液體泄漏，有腐蝕性），靜置3min（15-30℃），4℃下12,000rpm離心15min，離心后離心管分三層，底層（酚-氯仿層），中間層及無色水相上層；

8）小心吸取400μl上層水相（勿吸出中間層及管壁上的白色絮狀物），轉移到另一潔凈離心管中，加入500μl異丙醇，蓋緊管蓋，上下顛倒3次，靜置10min（15-30℃）。然后4℃下12000rpm離心10min（注意固定離心管方向），離心前通?？床灰奟NA沉淀，離心后可見白色膠狀沉淀，去上清；

9）加入1ml 75%的DEPC乙醇洗滌RNA沉淀，混勻，4℃下12,000rpm離心5min（注意固定離心管方向），小心吸去大部分DEPC乙醇。短暫離心，再吸去剩余DEPC乙醇。將沉淀在室溫空氣中干燥5min（打開離心管蓋）以使痕量乙醇揮發（但過度干燥可能使RNA沉淀難以溶解）；

10）用50μl DEPC水溶解沉淀，室溫靜置2min。RNA溶液可立即進行PCR或存于-70±10℃備用。提取后的核酸RNA溶液建議立即使用，如需保存，置于-70±10℃。

（3）PCR檢測

a）配制體系

BCR-ABL(P210）反應體系：將3μl反應酶系，17μl BCR-ABL(P210）反應液，充分混合，然后分裝20μl至每個PCR反應管；

ABL反應體系：將3μl反應酶系，17μl ABL反應液，充分混合，然后分裝20μl至每個PCR反應管；

b）加樣

往上述BCR-ABL(P210）及ABL反應管中分別加入提取后的待測樣本核酸、直接加入陰性質控品和分別加入對應的陽性定量參考品5μl。蓋緊管蓋，8,000rpm離心數秒后轉移至PCR擴增儀；

c）擴增程序設置

ABI7300/7500熒光PCR擴增儀的參數設置如下：

Reporter Dyel:FAM

Quencher Dye:none

Passive Reference:none

LightCycler480熒光PCR擴增儀的參數設置如下：

“Customizes”模塊中選擇FAM（483-533）濾片

擴增溫度參數統一設置如下：

50℃ 15min；

95℃ 15min（一個循環）；94℃ 15s,55℃ 45s（40個循環），熒光檢測選擇在55℃ 45s這一環節；保存文件，運行程序。

d）結果分析

反應結束后保存檢測數據文件。按對應順序設置BCR-ABL(P210）的5個陽性定量參考品（Task中設為Standard，Quantity中設為對應的拷貝數）。根據分析后圖像調節Baseline的Start值、End值以及Threshold值（用戶可根據實際情況自行調整，start值可以在1~10、stop值可以在5~20、Threshold值可以在5K~50K范圍選擇），使“Standard curve”窗口下的標準曲線圖達到最佳，即R2值（correlation數值）≧0.97。最后到“Report”窗口下記錄儀器自動分析計算出的BCR-ABL(P210）未知標本的拷貝數（BCR-ABL(P210）-Qty），將該結果導出。重新按對應順序設置ABL的4個陽性定量參考品，步驟同前，將ABL未知標本的拷貝數（ABL-Qty）導出。

（4）結果判定

如果增長曲線不呈S型曲線或Ct值為空白，則判所檢測的基因表達量小于檢測限度。

如果增長曲線呈S型曲線且ABL的Ct值﹤35，則樣品的BCR-ABL(P210）/ABL表達量為BCR-ABL(P210）-Qty/ ABL-Qty。

（5）結果分析

融合基因BCR-ABL(P210）試劑盒中陽性定量參考品及質控品的使用

融合基因BCR-ABL(P210）試劑盒中陽性定量參考品及質控品包括BCR-ABL(P210）陽性定量參考品1-5，ABL陽性定量參考品1-4和陰性質控品，用于質量控制。

陰性質控品：BCR-ABL(P210）及ABL無熒光信號增長，無明顯S型擴增曲線。

陽性定量參考品：BCR-ABL(P210）及ABL有熒光信號增長，曲線呈S型曲線，Ct值﹤37，且R2≧0.97。

未知標本的ABL的Ct值必須﹤35。

以上要求需同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。

檢測結果（見附圖1和圖2）：陰性質控品的BCR-ABL(P210）及ABL均無熒光信號增長；BCR-ABL(P210）陽性定量參考品1-5 FAM檢測通路有熒光信號增長，曲線呈S型曲線，Ct值﹤37，且R2≧0.97；ABL陽性定量參考品1-4 FAM檢測通路有熒光信號增長，曲線呈S型曲線，Ct值﹤37，且R2≧0.97；均符合試劑盒的質控要求，因此待檢標本的檢測結果是有效的。

圖1實施例1BCR-ABL(P210）陽性定量參考品1-5、陰性質控品的檢測結果。BCR-ABL(P210）陽性定量參考品1-5有熒光信號增長，曲線成S型曲線，Ct值﹤37，且R²≧0.97，可明確判定為陽性；陰性質控品的BCR-ABL(P210）無熒光信號增長，無明顯S型擴增曲線，可明確判定為陰性。檢測結果均符合質量控制判斷標準。

圖2顯示實施例1ABL陽性定量參考品1-4、陰性質控品的檢測結果。ABL陽性定量參考品1-4有熒光信號增長，曲線成S型曲線，Ct值﹤37，且R²≧0.97；可明確判定為陽性，陰性質控品的ABL無熒光信號增長，無明顯S型擴增曲線，可明確判定為陰性。檢測結果均符合質量控制判斷標準。

圖3顯示實施例1BCR-ABL(P210）基因的特異性實驗結果。針對8例包括再生障礙性貧血、巨幼細胞遺傳性貧血等其他非白血病患者樣品進行Real-Time qPCR檢測分析，檢測結果顯示熒光擴增曲線無明顯指數增長，均可明確判定為陰性。

圖4顯示為8個樣品的Ct值分別是10.20，11.14，11.76，13.95，14.20，17.14，17.18，17.81，結合擴增曲線有明顯指數增長期，均能夠判定為陽性。

以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所做的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的保護范圍。