本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種抗肥胖十七肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

生物活性肽是對機體的功能或狀態(tài)具有積極作用并最終影響機體健康的特殊蛋白質(zhì)片段。相較于蛋白質(zhì)而言，小分子肽片段的優(yōu)越性主要體現(xiàn)在：更易被人體吸收利用；活性高，在較小濃度下即可發(fā)揮其特有的生理作用；分子量小，易于修飾和改造，能夠通過人工化學(xué)合成等。而相較于單一的氨基酸而言，小分子肽除了具有特殊的生理活性外，在吸收通道和吸收速度上也具有氨基酸無可比擬的優(yōu)越性。已有研究證實，人體小腸存在專門的低聚肽吸收通道，人體攝入的蛋白質(zhì)經(jīng)過多種消化酶的水解，主要以低肽的形式被吸收。許多研究表明，各種來源的生物活性肽具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降壓、降血糖等多種作用，成為生物醫(yī)藥和保健品開發(fā)的熱點。肥胖增加動脈粥樣硬化，冠心病，高血壓，糖尿病，痛風(fēng)，脂肪肝等疾病的發(fā)病危險。因此，對具有減肥降脂作用而安全無害的生物活性肽的開發(fā)研究，變得尤為重要。目前，具有減肥降脂作用的多肽包括利拉魯肽，鱸魚活性肽，蠶蛹肽等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明選取小鼠前脂肪細胞3T3-L1為研究對象，使用MTT法測定合成肽的體外抑制活性。本發(fā)明的目的是提供一種具有體外抗肥胖活性的合成多肽，可應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域。

本發(fā)明合成的抗肥胖十七肽縮寫為LNNPSVCDCDCMMKAAR，分子量1871.24，序列為：Leu-Asn-Asn-Pro-Ser-Val-Cys-Asp-Cys-Asp-Cys-Met-Met-Lys-Ala-Ala-Arg。其中，

Leu表示英文名稱為Leucine，中文名稱為亮氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Asn表示英文名稱為Asparagine，中文名稱為天冬酰胺酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Asn表示英文名稱為Asparagine，中文名稱為天冬酰胺酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Pro表示英文名稱為Proline，中文名稱為脯氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；

Ser表示英文名稱為Serine，中文名稱為絲氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Val表示英文名稱為Valine，中文名稱為纈氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Cys表示英文名稱為Cysteine，中文名稱為半胱氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Asp表示英文名稱為Aspartic acid，中文名稱為天冬氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Cys表示英文名稱為Cysteine，中文名稱為半胱氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Asp表示英文名稱為Aspartic acid，中文名稱為天冬氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Cys表示英文名稱為Cysteine，中文名稱為半胱氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Met表示英文名稱為Methionine，中文名稱為甲硫氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Met表示英文名稱為Methionine，中文名稱為甲硫氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Lys表示英文名稱為Lysine，中文名稱為賴氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Ala表示英文名稱為Alanine，中文名稱為丙氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Ala表示英文名稱為Alanine，中文名稱為丙氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基;

Arg表示英文名稱為Arginine，中文名稱為精氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基。

本發(fā)明所述的氨基酸序列采用標(biāo)準(zhǔn) Fmoc 方案，通過樹脂的篩選，合理的多肽合成方法。將目標(biāo)多肽的 C-端羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以這個氨基酸的氨基作為起點，與另一分子氨基酸的羧基作用形成肽鍵。不斷重復(fù)這一過程，即可以得到目標(biāo)多肽產(chǎn)物。合成反應(yīng)完成后，去除保護基，將肽鏈與樹脂分離，即得到目標(biāo)產(chǎn)物。多肽合成是一個重復(fù)添加氨基酸的過程，固相合成順序從C端向N 端合成。

本發(fā)明將終濃度為0.125-2 mg/mL 的合成多肽與3T3-L1混勻，孵育48 h后，經(jīng)MTT法檢測，對脂肪細胞抑制率達到9.77%-33.96%,可在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和技術(shù)效果：

本發(fā)明首次合成了該肽，并且采用MTT方法檢測了合成多肽的體外脂肪細胞增殖抑制活性，所述合成多肽具有一定的脂肪細胞抑制能力。

附圖說明

圖1a為合成多肽Leu-Asn-Asn-Pro-Ser-Val-Cys-Asp-Cys-Asp-Cys-Met-Met-Lys-Ala-Ala-Arg 的HPLC圖。

圖1b為合成多肽Leu-Asn-Asn-Pro-Ser-Val-Cys-Asp-Cys-Asp-Cys-Met-Met-Lys-Ala-Ala-Arg 的MS圖。

圖2為合成多肽Leu-Asn-Asn-Pro-Ser-Val-Cys-Asp-Cys-Asp-Cys-Met-Met-Lys-Ala-Ala-Arg對脂肪細胞3T3-L1的抑制活性柱狀圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的實施和保護范圍不限于此。

多肽固相合成

選用高分子樹脂（中肽生化有限公司），按照氨基酸序列Leu-Asn-Asn-Pro-Ser-Val-Cys-Asp-Cys-Asp-Cys-Met-Met-Lys-Ala-Ala-Arg的特征，先將Arg的羧基以共價鍵的形式與一個樹脂相連，然后Ala的氨基和Arg 的羧基縮水反應(yīng)，處理后，再添加Ala，Ala的氨基和Ala的羧基反應(yīng)，依次從右到左添加氨基酸，加好最后一個Leu氨基酸后，再切除樹脂即得到目標(biāo)多肽。采用高效液相色譜進行純化，色譜柱型號為Phenomenex C₁₈，尺寸 4.6*150mm，流動相A:含有0.1%三氟乙酸（TFA）的水；流動相B:含有0.09%TFA 的溶液 (80%乙腈+20%水)；20 min內(nèi)B相由14.0%上升到24.0%，流速1.0 mL/min，檢測波長220nm。液氮速凍，冷凍干燥，得到最后的產(chǎn)品，要求純度達到98.06%以上，并經(jīng)MS 鑒定結(jié)構(gòu)（如圖1 所示）。

合成多肽的體外抑制活性

通過 MTT 比色法分析肽組分對3T3-L1的生長抑制作用。具體操作步驟如下：

1）取對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)0.25%（體積）的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入相應(yīng)的完全培養(yǎng)基終止消化并重懸細胞，血球平板計數(shù)后，調(diào)整細胞懸液的濃度至5×10⁴個/mL，加至96孔板中，每孔100 μL, 于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

2）培養(yǎng)24 h后細胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為200 μL的含有不同濃度待測樣品的新鮮完全培養(yǎng)基，并以完全培養(yǎng)基為陰性對照，于37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

3）48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮完全培養(yǎng)基180 μL；于37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；

4）4 h后，棄去含有MTT的培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長處測定光密度值并計算抑制率:

脂肪細胞生長抑制率(%)=((對照組OD-空白組OD)-(給藥組OD-空白組OD ))/((對照組OD-空白組OD ) )×100

應(yīng)用實施例1

脂肪細胞3T3-L1 100 μL 細胞懸液(5×10⁴個/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 24 h后細胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為100 μL的125 μg/mL的多肽樣品的新鮮完全培養(yǎng)基，并以完全培養(yǎng)基為陰性對照，于37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮完全培養(yǎng)基180 μL；于37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；4 h后，棄去含有MTT的培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長處測定光密度值并計算抑制率。由圖2可知，125 μg/mL的多肽對脂肪細胞3T3-L1的抑制率是9.77%。

應(yīng)用實施例2

脂肪細胞3T3-L1 100 μL 細胞懸液(5×10⁴個/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 24 h后細胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為100 μL的250 μg/mL的多肽樣品的新鮮完全培養(yǎng)基，并以完全培養(yǎng)基為陰性對照，于37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮完全培養(yǎng)基180 μL；于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；4 h后，棄去含有MTT的培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長處測定光密度值并計算抑制率。由圖2可知，250 μg/mL的多肽對脂肪細胞3T3-L1的抑制率是24.26%。

應(yīng)用實施例3

脂肪細胞3T3-L1 100 μL 細胞懸液(5×10⁴個/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后細胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為100 μL的500 μg/mL的多肽樣品的新鮮完全培養(yǎng)基，并以完全培養(yǎng)基為陰性對照，于37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮基完全培養(yǎng)基180 μL；于37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；4 h后，棄去含有MTT的培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長處測定光密度值并計算抑制率。由圖2可知，500 μg/mL的多肽對脂肪細胞3T3-L1的抑制率是28.24%。

應(yīng)用實施例4

脂肪細胞3T3-L1 100 μL 細胞懸液(5×10⁴個/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 24 h后細胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為100 μL的1000 μg/mL的多肽樣品的新鮮完全培養(yǎng)基，并以完全培養(yǎng)基為陰性對照，于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮完全培養(yǎng)基180 μL；于37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；4 h后，棄去含有MTT的培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長處測定光密度值并計算抑制率。由圖2可知，1000 μg/mL的多肽對脂肪細胞3T3-L1的抑制率是27.93%。

應(yīng)用實施例5

脂肪細胞3T3-L1 100 μL 細胞懸液(5×10⁴個/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后細胞貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為100 μL的2000 μg/mL的多肽樣品的新鮮完全培養(yǎng)基，并以完全培養(yǎng)基為陰性對照，于37 ℃恒溫CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮完全培養(yǎng)基180 μL；于37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；4 h后，棄去含有MTT的培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長處測定光密度值并計算抑制率。由圖2可知，2000 μg/mL的多肽對脂肪細胞3T3-L1的抑制率是33.96%。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南理工大學(xué)

<120> 一種抗肥胖十七肽LNNPSVCDCDCMMKAAR

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Asn Asn Pro Ser Val Cys Asp Cys Asp Cys Met Met Lys Ala Ala

1 5 10 15

Arg