本發(fā)明涉及一種聯(lián)產(chǎn)丙酮酸和α-酮戊二酸的重組光滑球擬酵母，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

酮酸是分子中同時含有羧基和酮基的化合物。根據(jù)分子中羧基和酮基的相對位置可分為α、β-酮酸，它們是一類在生物體內(nèi)擁有重要作用的有機酸，同時目前社會對其需求量也不斷在增加，其廣泛應(yīng)用于日化，食品，醫(yī)療，農(nóng)業(yè)等行業(yè)。其中α酮酸是羧基在α碳原子上的的酮酸，丙酮酸是最簡單的α酮酸。丙酮酸作為生物代謝的中間產(chǎn)物，處于各代謝途徑的中間環(huán)節(jié)，是糖酵解的終產(chǎn)物；通過脫氫脫羧反應(yīng)轉(zhuǎn)化為TCA循環(huán)的起始物質(zhì)乙酰-CoA；在丙酮酸羧化酶作用下生成TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物草酰乙酸；通過轉(zhuǎn)氨基作用生成丙氨酸等。同樣，α-酮戊二酸作為例外一種重要的酮酸，是細胞內(nèi)氮代謝的主要調(diào)控者。α-酮戊二酸作為谷氨酸的前體，與脯氨酸、精氨酸、鳥氨酸、多巴胺的分泌緊密相關(guān)，能有效維持胞內(nèi)的“谷氨酸池”(glutamine pools)，并在中間代謝過程中決定著氮代謝流走向合成或者分解，有效的維持體內(nèi)氮代謝平衡。α-酮戊二酸還與蛋白質(zhì)、脂類、維生素合成以及能量代謝緊密相關(guān)。

目前對其上述兩種重要的酮酸的生產(chǎn)主要是化學合成法和微生物發(fā)酵法兩大類。其中微生物發(fā)酵法相對于其化學合成有更多的優(yōu)點，如原料的轉(zhuǎn)化率高、污染小、成本低等優(yōu)點。但其兩種酮酸的微生物發(fā)酵采用的是獨立的發(fā)酵操作。由于微生物合成目標產(chǎn)物時，不可避免的存在副產(chǎn)物的積累，而兩種酮酸在生物體的轉(zhuǎn)化是極其容易，因而其單獨發(fā)酵生產(chǎn)其中的某一種酮酸時，不可避免的要消除例外一種酮酸的存在，但是消除副產(chǎn)物的努力通常會顯著降低轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度，從而影響整個發(fā)酵過程的經(jīng)濟性。

如何將其兩種酮酸在一種微生物中進行聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵，將對整個酮酸工業(yè)的發(fā)展有這重要的作用。聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵技術(shù)作為一種高效、經(jīng)濟的發(fā)酵技術(shù)成為了國內(nèi)外研究的熱門。通過微生物聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵獲得高產(chǎn)丙酮酸和α-酮戊二酸，其最關(guān)鍵是要有一株高產(chǎn)丙酮酸和α-酮戊二酸的菌株。目前其兩種酮酸的聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵鮮有文獻報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明通過在高產(chǎn)丙酮酸的光滑球擬酵母菌株中過量表達丙酮酸激酶，加強丙酮酸和α-酮戊二酸合成的共同合成途徑，從而對其兩種酮酸進行高效率聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種聯(lián)產(chǎn)丙酮酸和α-酮戊二酸的重組菌，所述重組菌是以光滑球擬酵母為宿主，以pY26-TEF-GPD為載體，過表達丙酮酸激酶CDC19基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述CDC19基因是NCBI上Gene ID為851193的CDC19基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組菌是以缺失了URA3基因的光滑球擬酵母T.glabrata CCTCC M202019為宿主，表達NCBI上Gene ID:851193的CDC19。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述CDC19基因是以釀酒酵母菌株S288c基因組為模板擴增得到的。

本發(fā)明的第二個目的是提供所述重組菌的構(gòu)建方法，是以缺失了URA3基因的光滑球擬酵母T.glabrata CCTCC M202019為宿主，以pY26-TEF-GPD為載體，表達NCBI上Gene ID為851193的CDC19基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組菌按如下方法構(gòu)建：

(3)將目的片段CDC19經(jīng)過限制性內(nèi)切酶Not I和Pac I雙酶切消化后，并將CDC19定向克隆到表達質(zhì)粒pY26-TEF-GPD中，得到重組酵母表達質(zhì)粒pY26-CDC19；

(4)重組質(zhì)粒pY26-CDC19電轉(zhuǎn)化受體菌T.glabrata CCTCC M202019(TgU^-)，在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基中進行篩選，得到重組菌TgU^-(pY26-CDC19)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述酵母表達質(zhì)粒pY26-TEF-GPD為大腸桿菌-酵母之間的穿梭載體，在大腸桿菌中選擇標記為Amp^r，而在酵母中選擇標記為尿嘧啶缺陷型互補。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種聯(lián)產(chǎn)丙酮酸和α-酮戊二酸的方法，是將所述重組菌應(yīng)用于丙酮酸和α-酮戊二酸的生產(chǎn)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是應(yīng)用所述重組菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃，200～220rpm條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組菌經(jīng)過活化。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基每L中含有：葡萄糖50-120g，尿素0-5g，MgSO₄.7H₂O 0-1g，KH₂PO₄0-5g，CH₃COONa 0-5g，微量元素液10ml，維生素液10ml，初始pH＝5.5；所述微量元素液每L含有MnCl₂·4H₂O 0-12g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0-2g，CaCl₂·2H₂O 0-2g，CuSO₄·5H₂O 0-0.1g，ZnCl₂0-1g；所述維生素液每L含有：生物素0-0.01g，硫胺素0-2mg，吡哆醇0-0.2g，煙酸0-2g。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述微量元素液的配制方法為：將MnCl₂·4H₂O 0-12g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0-2g，CaCl₂·2H₂O 0-2g，CuSO₄·5H₂O 0-0.1g，ZnCl₂0-1g用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述維生素液的配制方法為：將生物素0-0.01g，硫胺素0-2mg，吡哆醇0-0.2g，煙酸0-2g用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述接種的接種量按體積比為5-10％。

本發(fā)明還要求保護所述方法在日化、食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域生產(chǎn)含丙酮酸和/或α-酮戊二酸的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

有益效果：

本發(fā)明的方法可對其丙酮酸和α-酮戊二酸進行高效的聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵；由于要想同時獲得其2種酮酸，其共同的合成途徑通量必須足夠大，本發(fā)明通過過量表達其2種酮酸共同合途徑上的關(guān)鍵酶-丙酮酸激酶，加強其二者的合成效率和通量，來達到對其2種酮酸進行高效聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵的目的?？偹岙a(chǎn)量(丙酮酸和α-酮戊二酸)、總酸轉(zhuǎn)化率和總酸生產(chǎn)強度分別提高了112.2％、115.6％和155.6％，最重要的是重組菌TgU^-(pY26-CDC19)的α-酮戊二酸產(chǎn)量從其改造之前的0g/L增加到了30.1g/L。此外，相對于解脂亞洛酵母WSH-Z06(甘油84h耗盡，α-酮戊二酸和丙酮酸濃度達到32.8，30.4g/L，底物轉(zhuǎn)化率為63％，生產(chǎn)強度為0.75g/L·h)，本發(fā)明的聯(lián)產(chǎn)方法使丙酮酸和α-酮戊二酸生產(chǎn)周期縮短了24h，總酸量提高了31.6％，生產(chǎn)強度提高了84.0％。

具體實施方式

菌株和質(zhì)粒：光滑球擬酵母(T.glabrata CCTCC M202019，TgU^-)其為煙酸、生物素、硫胺素、鹽酸吡哆醇，尿嘧啶5種營養(yǎng)缺陷型菌株(即在T.glabrata CCTCC M202019的基礎(chǔ)上敲除了Ura基因)，已進行保藏。酵母表達質(zhì)粒pY26-TEF-GPD為大腸桿菌-酵母之間的穿梭載體，在大腸桿菌中選擇標記為amp^r，而在酵母中選擇標記為尿嘧啶缺陷型互補。

細胞干重的測定：取一定量的菌懸液于10mL容量瓶中，加入2mL鹽酸(2mol/L)溶解懸液中的碳酸鈣，加去離子水定容到10mL，充分混勻，用UV 7500型可見光分光光度計，于660nm處測定OD值，利用細胞干重標準曲線計算出細胞干重。

丙酮酸、α-酮戊二酸和葡萄糖的測定：高效液相色譜(HPLC)。儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀(配紫外可見檢測器、示差折光檢測器和工作站)，色譜條件：色譜柱：Aminex HPX-87H ion exchange column，流動相：5mM H₂SO₄，流速：0.6mL/min，柱溫：40℃，進樣量：10μL，紫外檢測器波長：210nm(檢測丙酮酸)，示差折光檢測器：檢測葡萄糖，樣品制備：1mL發(fā)酵液于12,000rpm下離心5min，上清經(jīng)過適當?shù)南♂屘幚砗徒?jīng)0.22μL濾膜過濾后，進行高效液相色譜分析。

培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30g，植物蛋白胨10g，磷酸二氫鉀1.0g，七水硫酸鎂0.5g，固體培養(yǎng)基添加20g瓊脂。115℃滅菌15min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖120g，尿素3.86g，MgSO₄.7H2O 0.8g，KH₂PO₄2g，CH₃COONa 3g，微量元素液(過濾除菌)10ml，維生素液(過濾除菌)10ml，于115℃下滅菌15min。40g/L的碳酸鈣(單獨滅菌)被添加用來調(diào)節(jié)pH。微量元素液：MnCl₂·4H₂O 12g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 2g，CaCl₂·2H₂O 2g，CuSO₄·5H₂O 0.05g，ZnCl₂0.5g，用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。維生素液：生物素0.004g，硫胺素0.75mg，吡哆醇0.04g，煙酸0.8g，用2mol/L的HCl溶解后定容至1L。

實施例1：釀酒酵母CDC19的擴增與表達質(zhì)粒的構(gòu)建

以釀酒酵母S288c基因組為模板，PCR擴增得到目的基因CDC19片段，通過瓊脂糖凝膠電泳得到約1500bp的特異片段，目的基因CDC19經(jīng)過限制性內(nèi)切酶Pac I和Not I雙酶切消化后，濃縮純化，將CDC19基因定向克隆到表達質(zhì)粒pY26-TEF-GPD中，得到重組酵母表達質(zhì)粒pY26-CDC19，將上述重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞JM109并涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上。PCF引物如下：

CDC19(F)-1：TCCCCCGGGATGTCTAGATTAGAAAGATTGACCTCATTA

CDC19(R)-1：CCCAAGCTTTTAAACGGTAGAGACTTGCAAAGTG

實施例2：重組菌的構(gòu)建與鑒定

由于上述重組質(zhì)粒pY26-CDC19上帶有Ura3基因，將重組酵母質(zhì)粒pY26-CDC19)電擊轉(zhuǎn)化到受體菌TgU^-(即缺失了Ura基因的T.glabrata CCTCC M202019)，得到在不加尿嘧啶的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上正常生長的重組菌TgU^-(pY26-CDC19)。

實施例3：重組菌與對照菌對照發(fā)酵實驗

挑取重組菌TgU^-(pY26-CDC19)和含有空質(zhì)粒pY26-TEF-GPD的TgU、和解脂亞洛酵母WSH-Z06^-(作為對照菌)的單菌落分別于種子培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)18-24h，以5-10％(體積比)的接種量，將上述活化培養(yǎng)好的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃，400-600rpm條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)果如表1所示，相對于對照菌TgU^-(pY26-TEF-GPD)，總酸產(chǎn)量(丙酮酸和α-酮戊二酸)、總酸轉(zhuǎn)化率和總酸生產(chǎn)強度分別提高了112.2％、115.6％和155.6％，最重要的是重組菌TgU^-(pY26-CDC19)的α-酮戊二酸產(chǎn)量從其改造之前的0g/L增加到了30.1g/L。相對于解脂亞洛酵母WSH-Z06(甘油84h耗盡，α-酮戊二酸和丙酮酸濃度達到32.8，30.4g/L，底物轉(zhuǎn)化率為63％，生產(chǎn)強度為0.75g/L·h)，聯(lián)產(chǎn)周期縮短了24h，總酸量提高了31.6％，生產(chǎn)強度提高了84.0％。

表1重組菌TgU^-(pY26-CDC19)與對照菌TgU^-(pY26)的發(fā)酵對比

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學

<120> 一種聯(lián)產(chǎn)丙酮酸和α-酮戊二酸的重組光滑球擬酵母

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtctagat tagaaagatt gacctcatta aacgttgttg ctggttctga cttgagaaga 60

acctccatca ttggtaccat cggtccaaag accaacaacc cagaaacctt ggttgctttg 120

agaaaggctg gtttgaacat tgtccgtatg aacttctctc acggttctta cgaataccac 180

aagtctgtca ttgacaacgc cagaaagtcc gaagaattgt acccaggtag accattggcc 240

attgctttgg acaccaaggg tccagaaatc agaactggta ccaccaccaa cgatgttgac 300

tacccaatcc caccaaacca cgaaatgatc ttcaccaccg atgacaagta cgctaaggct 360

tgtgacgaca agatcatgta cgttgactac aagaacatca ccaaggtcat ctccgctggt 420

agaatcatct acgttgatga tggtgttttg tctttccaag ttttggaagt cgttgacgac 480

aagactttga aggtcaaggc tttgaacgcc ggtaagatct gttcccacaa gggtgtcaac 540

ttaccaggta ccgatgtcga tttgccagct ttgtctgaaa aggacaagga agatttgaga 600

ttcggtgtca agaacggtgt ccacatggtc ttcgcttctt tcatcagaac cgccaacgat 660

gttttgacca tcagagaagt cttgggtgaa caaggtaagg acgtcaagat cattgtcaag 720

attgaaaacc aacaaggtgt taacaacttc gacgaaatct tgaaggtcac tgacggtgtt 780

atggttgcca gaggtgactt gggtattgaa atcccagccc cagaagtctt ggctgtccaa 840

aagaaattga ttgctaagtc taacttggct ggtaagccag ttatctgtgc tacccaaatg 900

ttggaatcca tgacttacaa cccaagacca accagagctg aagtttccga tgtcggtaac 960

gctatcttgg atggtgctga ctgtgttatg ttgtctggtg aaaccgccaa gggtaactac 1020

ccaatcaacg ccgttaccac tatggctgaa accgctgtca ttgctgaaca agctatcgct 1080

tacttgccaa actacgatga catgagaaac tgtactccaa agccaacctc caccaccgaa 1140

accgtcgctg cctccgctgt cgctgctgtt ttcgaacaaa aggccaaggc tatcattgtc 1200

ttgtccactt ccggtaccac cccaagattg gtttccaagt acagaccaaa ctgtccaatc 1260

atcttggtta ccagatgccc aagagctgct agattctctc acttgtacag aggtgtcttc 1320

ccattcgttt tcgaaaagga acctgtctct gactggactg atgatgttga agcccgtatc 1380

aacttcggta ttgaaaaggc taaggaattc ggtatcttga agaagggtga cacttacgtt 1440

tccatccaag gtttcaaggc cggtgctggt cactccaaca ctttgcaagt ctctaccgtt 1500

taa 1503

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcccccggga tgtctagatt agaaagattg acctcatta 39

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccaagcttt taaacggtag agacttgcaa agtg 34