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一種谷氨酸棒狀桿菌的基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):12056457閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種谷氨酸棒狀桿菌的基因編輯系統(tǒng),所述谷氨酸棒狀桿菌中待編輯的目的基因具有5′-(N20)-NGG-3′結(jié)構(gòu),N為A、T、C或G,其特征在于:

所述基因編輯系統(tǒng)包括cas9表達(dá)載體和sgRNA表達(dá)載體;

所述cas9表達(dá)載體包括cas9序列和SD序列,所述cas9序列如SEQ ID No.1所示,所述SD序列如SEQ ID No.2所示、并連接在cas9序列的始密碼子ATG前;

所述sgRNA表達(dá)載體的包含sgRNA序列和同源修復(fù)序列,所述sgRNA序列為crRNA與trancrRNA 連接形成的復(fù)合體序列,所述trancrRNA序列如SEQ ID No.3所示,所述crRNA序列為20bp的引導(dǎo)序列、與目的基因的N20序列相同。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種谷氨酸棒狀桿菌的基因編輯系統(tǒng),其特征在于:所述cas9表達(dá)載體的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種谷氨酸棒狀桿菌的基因編輯系統(tǒng),其特征在于:所述cas9表達(dá)載體由以下方法制備得到:

a、合成由SD序列和cas9序列連接形成的復(fù)合體序列,并在復(fù)合體序列的兩端引入HindⅢ酶切識(shí)別序列、EcoRⅠ酶切識(shí)別序列;

b、將帶有酶切識(shí)別序列的復(fù)合體序列以及pXMJ19載體分別酶切、純化后進(jìn)行連接,得到所述cas9表達(dá)載體。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種谷氨酸棒狀桿菌的基因編輯系統(tǒng),其特征在于:所述同源修復(fù)序列由目的基因上游序列、目的基因編輯后形成的序列、目的基因下游序列依次連接形成,所述目的基因上游序列、目的基因下游序列長(zhǎng)度為300bp~1500bp。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種谷氨酸棒狀桿菌的基因編輯系統(tǒng),其特征在于:當(dāng)所述目的基因編輯為敲除時(shí),所述同源修復(fù)序列由目的基因上游序列和目的基因下游序列連接形成。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種谷氨酸棒狀桿菌的基因編輯系統(tǒng),其特征在于:所述sgRNA表達(dá)載體由以下方法制備得到:

a、合成sgRNA序列,并在sgRNA兩端引入EcoRⅠ酶切識(shí)別序列、XbaⅠ酶切識(shí)別序列;

b、將帶有酶切識(shí)別序列的sgRNA序列以及pECXK-99載體分別酶切、純化后進(jìn)行連接,得到pFST-1載體;

c、構(gòu)建同源修復(fù)序列,并在同源修復(fù)序列兩端引入BglⅡ酶切識(shí)別序列或者引入pFST-1載體位于BglⅡ酶切位點(diǎn)兩端的同源序列;

d、將帶有酶切識(shí)別序列的同源修復(fù)序列以及pFST-1載體分別酶切、純化后進(jìn)行連接或者同源重組組裝,得到所述sgRNA表達(dá)載體。

7.如權(quán)利要求1~6中任一所述的基因編輯系統(tǒng)在谷氨酸棒狀桿菌中的應(yīng)用,所述應(yīng)用包括基因敲除和基因替換。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用,其特征在于:所述應(yīng)用的具體操作如下:

a、將cas9表達(dá)載體和sgRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌;

b、培養(yǎng)、篩選,獲得轉(zhuǎn)化子。

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