本發明涉及農業微生物領域，具體涉及一種類芽孢桿菌QBJP-F4及其在制備功能型蔬菜育苗生物基質中的應用。

背景技術：

隨著我國現代農業的發展，蔬菜工廠化育苗越來越受到人們的重視，穴盤育苗是當前工廠化育苗的主要措施。據不完全統計，我國需要育苗的作物面積非常大，其中水稻種植面積就超過3億畝/年，經濟作物超過5億畝次/年。目前國內一般以富含有機質的材料(如泥炭、腐熟植物殘體等)為主，再配以適當比例的輕質無機材料，如蛭石、膨脹珍珠巖等制成育苗基質。由于材料來源受地區和成本的限制，且泥炭為不可再生資源，限制著基質無土育苗的可持續發展，現已成為草炭匱乏地區蔬菜工廠化育苗發展的瓶頸。國外工廠化育苗發展很快，進口基質保水性明顯優于國產泥炭基質，進口基質中有機質和速效磷、鉀含量明顯高于國產泥炭基質。因此提升國內育苗基質的整體水平變得尤為迫切。將促進作物生長的根際微生物與不同腐熟廢棄物料(普通完全或部分替代泥炭物料研制成的基質)相結合，研制成有機活性育苗生物基質，將打破傳統育苗基質的配方及工藝，成為提升我國育苗基質整體水平的一個重大突破。目前，國內已有部分專家在嘗試此方面工作，主要集中在利用AM菌根接種現有基質進行育苗，雖取得一些成果，但研究均不夠系統深入，也沒有形成大規模推廣并被廣大農民認可的產品，因而本專利的研究變得尤為重要。

植物根際促生菌是指定殖于植物根際系統，并能促進植物生長的一類微生物總稱。能依靠直接產生信號物質，或者提高植物抗性、加速土壤養素循環等方式促進植物生長、提高防病能力、增加作物的產量。因而成為許多學者研究的熱點。

植物根際(rhizosphere)是一個非常特殊的生態環境，是土壤-植物生態系統物質交換的活躍界面，植物進行光合作用，將光合產物運至地下，促進根際微生物的生長和代謝，而根際微生物將有機態養分轉化為無機形態，利于植物吸收，同時，很多根際微生物能分泌促進根系生長的促生物質、拮抗土傳病原菌的拮抗物質。植物根際形成了根際微生物的生境，特定作物根系分泌物造就了特定的土壤細菌和真菌的群落結構。與動物不同，植物生長位點是固定的，植物與其他生物的互作主要依靠分泌的各種化學信號物質。植物通過根系分泌能被土壤微生物識別的信號分子啟動微生物與植物根系的對話，這種對話又反過來使微生物產生一些信號來啟動微生物在根部的定殖。自然條件下，特定作物的根系分泌物被某些有益微生物所愛好，如果我們在育苗的時候能夠將這些特定的針對不同作物根際的功能微生物，保活添加到基質中，研制成具有不同功能的活性微生物育苗基質，從而進一步育出根際帶有大量活性功能微生物的優質種苗，必定能夠提高該類作物在大田種植中的產量。

技術實現要素：

本發明第一方面，提供了一種類芽孢桿菌QBJP-F4，分離之江蘇省南京市六合區橫梁街道鐘林村南京秦邦吉品農業開發有限公司土壤內，該類芽孢桿菌QBJP-F4已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏日期為2016年8月22日；保藏號為CGMCC NO.12887。

菌株QBJP-F4在LB平板上菌落周邊規則，不透明，表面不起皺，白色，在營養瓊脂上無可溶性色素。生長初期為半透明狀光滑菌落，不粘稠，易挑取；隨著培養時間的延長菌落逐漸變成不透明狀，白色沉淀物明顯，水分含量明顯減少，易挑取。菌體革蘭氏染色陽性，呈桿狀，兩端略尖。pH 5.6和50℃的生長也可變，最適pH為7，最適的溫度28～30℃。10％NaCl可抑制生長，而在5％NaCl條件能生長，在含0.001％溶菌酶中不能生長。

菌株16S rRNA序列構建的系統發育樹分析表明，菌株QBJP-F4與飼料類芽孢桿菌Paenibacillus pabuli HSCC492^T(AB045094)相似性在99.93％以上，結合生理生化試驗將QBJP-F4鑒定為飼料類芽孢桿菌。

本發明的第二方面，提供了上述類芽孢桿菌QBJP-F4在制備功能型蔬菜育苗生物基質中的應用。

進一步地，將類芽孢桿菌QBJP-F4進行液體發酵，將發酵液接種至普通育苗基質中，混合均勻得到功能型蔬菜育苗生物基質。

本發明的第三方面，提供了一種功能型蔬菜育苗生物基質，普通育苗基質中添加類芽孢桿菌QBJP-F4的發酵液所得，其中，類芽孢桿菌QBJP-F4保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.12887。

進一步地，普通育苗基質中含有機質(基質干重，下同)≥20％，總養分(N+P₂O₅+K₂O)1.5％～7％，水分≤55％，pH值5.5～7.5，Ec≤2.5ms/cm。只要滿足上述標準的蔬菜育苗基質均適用于本發明。

進一步地，類芽孢桿菌QBJP-F4的發酵液通過以下發酵方法制備：

將類芽孢桿菌QBJP-F4接種到PDA培養液中，進行液體發酵生產，發酵生產的條件為：pH6.0～7.0，發酵溫度30～35℃，攪拌速度為170～200rpm/min，發酵中后期形成芽孢，發酵時間為43～50h，使發酵液中含菌或芽孢量≥1×10¹⁰個/ml；

其中所用PDA培養基配制方法為，以配制1L培養基為例：200g土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min后過濾，濾液中加20g普通蔗糖后定容至1000ml，pH值自然，121℃滅菌20min。

進一步地，所述功能型蔬菜育苗生物基質中類芽孢桿菌QBJP-F4活菌數≥2.0×10⁷CFU/g基質干重。

進一步地，所述蔬菜包括西瓜、黃瓜、辣椒或番茄。

本發明的第四方面，提供了上述功能型蔬菜育苗生物基質的制備方法，包括如下步驟：

步驟1、制備保藏號為CGMCC NO.12887的類芽孢桿菌QBJP-F4發酵液；

步驟2、將步驟1制備的發酵液按基質干重的2～10v/w％接種到普通育苗基質，混合均勻，使其中類芽孢桿菌QBJP-F4活菌數≥2.0×10⁷CFU/g基質干重，得到功能型蔬菜育苗生物基質。

進一步地，類芽孢桿菌QBJP-F4的發酵液通過以下發酵方法制備：

將類芽孢桿菌QBJP-F4接種到PDA培養液中，進行液體發酵生產，發酵生產的條件為：pH6.0～7.0，發酵溫度30～35℃，攪拌速度為170～200rpm/min，發酵中后期形成芽孢，發酵時間為43～50h，使發酵液中含菌或芽孢量≥1×10¹⁰個/ml；

其中所用PDA培養基配制方法為，以配制1L培養基為例：200g土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min后過濾，濾液中加20g普通蔗糖后定容至1000ml，pH值自然，121℃滅菌20min。

本發明的有益效果：

本發明分離出了一種類芽孢桿菌QBJP-F4，該菌株能夠有效地在種苗根際定殖，菌株具有較強的促生功能，能夠增強所育種苗后期盆栽及田間種植中的生長。將類芽孢桿菌QBJP-F4的發酵液添加到普通育苗基質中得到功能型蔬菜育苗生物基質，由于基質的良好通透性和優質保水性，普通基質與功能菌QBJP-F4結合后，能夠大幅度促進QBJP-F4的存活能力，從而確保所育種苗根際帶有大量活性功能菌，產品中穩定含有2.0×10⁷CFU/g(基質干重)以上的活性功能微生物，對蔬菜苗期的促生效果好，能夠顯著促進多種蔬菜苗期生長，能夠得到根際帶有大量活性功能微生物的優質種苗，能夠顯著促進所育種苗后期栽培過程中的生長。

附圖說明

圖1為QBJP-F4在LB平板上的菌落形態。

圖2為基于菌株QBJP-F4的16S rRNA基因序列采用鄰接法建立的系統發育樹。

圖3為生物基質育黃瓜苗的促生效果圖(第一季)。

圖4為生物基質育黃瓜苗的促生效果圖(第二季)。

生物材料保藏信息

QBJP-F4，分類命名為類芽孢桿菌Paenibacillus sp.；保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC；保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏日期為2016年8月22日；保藏號為CGMCC NO.12887。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖對本發明做更進一步地解釋。下列實施例僅用于說明本發明，但并不用來限定本發明的實施范圍。

實施例1、菌株的分離及鑒定

取5g土壤于盛有45ml無菌水的三角瓶內，在30℃，170r/min條件下的搖床中振蕩20min，制成土壤懸浮液，80度水浴20min后，稀釋成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5等不同梯度稀釋液后涂平板，培養箱中黑暗培養1d～2d，后挑取單菌落，經平板純化后，共挑選12株，分別測定各菌株產植物生長素吲哚乙酸(IAA)的能力(方法參考文獻：Glickmann E,Dessaux Y.A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria.[J].Applied and environmental microbiology,1995,612)。采用同樣的方法，結果初篩和復篩，獲得一株促生能力優異的菌株QBJP-F4，保存留待進一步研究。

如圖1所示，菌株QBJP-F4在LB平板上菌落周邊規則，不透明，表面不起皺，白色，在營養瓊脂上無可溶性色素。生長初期為半透明狀光滑菌落，不粘稠，易挑取；隨著培養時間的延長菌落逐漸變成不透明狀，白色沉淀物明顯，水分含量明顯減少，易挑取。菌體革蘭氏染色陽性，呈桿狀，兩端略尖。pH 5.6和50℃的生長也可變，最適pH為7，最適的溫度28～30℃。10％NaCl可抑制生長，而在5％NaCl條件能生長，在含0.001％溶菌酶中不能生長。

如圖2所示，菌株16S rRNA序列構建的系統發育樹分析表明，菌株QBJP-F4與飼料類芽孢桿菌Paenibacillus pabuli HSCC492^T(AB045094)相似性在99.93％以上，結合生理生化試驗將QBJP-F4鑒定為飼料芽孢桿菌。將QBJP-F4保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2016年8月16日，保藏號為CGMCC NO.12887。

實施例2、功能菌發酵液的生產

將菌株QBJP-F4(CGMCC NO.12887)接種至PDA培養液中液體發酵生產，發酵生產的條件為：pH7.0，發酵溫度為30℃，攪拌速度為170rpm/min，發酵中后期形成芽孢，發酵時間為48h，使發酵液中含菌或芽孢量≥1×10¹⁰個/ml；

其中所用PDA培養液配制方法為，以配制1L培養基為例：200g土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min后過濾，濾液中加20g普通蔗糖后定容至1000ml，pH值自然，121℃滅菌20min。

實施例3、功能型生物基質研發

以菌株QBJP-F4為功能菌的生物基質育苗效果

基質的研發：將實施例2制備的菌株QBJP-F4發酵液接種(按基質干重的5v/w％接菌，下同)至普通育苗基質中，混合均勻。基質中功能菌株QBJP-F4采用選擇性培養基計數，選擇性培養基的配方為：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，瓊脂2.0％，去離子水1000mL，pH 7.2-7.4，121℃高壓滅菌20min。1％多粘菌素2mL，1％放線菌酮4mL(抗生素在培養基倒前冷卻后加入)。功能菌QBJP-F4菌落數以每克基質干重計算。經計數，生物基質中含功能菌數約為3×10⁷CFU/g。

育苗試驗處理如下：1)普通育苗基質(CK2)；2)添加未接菌空白培養液的育苗基質(CK1)；3)添加菌株QBJP-F4發酵液(按基質干重的5v/w％接菌，下同)的育苗生物基質(QBJP-F4)。將黃瓜種子消毒浸種催芽，露白后，埋入三個處理的基質中，每個處理30個重復。30天左右分別測定相關生長指標：株高、莖粗、SPAD、地上部鮮重、地上部干重、地下部鮮重和地下部干重(表1)。并稀釋涂布計數各處理中功能菌QBJP-F4在根際的定殖數量。

同樣的處理，重復做第二季(表2)。

綜上所述，兩季苗盤育苗試驗中：相比于普通育苗基質(CK2)及添加未接菌空白培養液的育苗基質(CK1)，添加功能菌研制成的育苗生物基質(QBJP-F4)對黃瓜苗的生長有明顯的促生效果。在功能菌方面，兩季苗盤育苗實驗中，添加菌株QBJP-F4發酵液的育苗生物基質所育黃瓜種苗30天左右根際含有功能菌的數量分別為3.56×10⁷CFU/g、2.27×10⁷CFU/g(根際基質干重)。

表1第一季生物基質育苗30天對黃瓜苗期生長的影響

表2第二季生物基質育苗30天對黃瓜苗期生長的影響