1.一種土霉素降解菌株的篩選方法,特征在于,包括以下過程:
1)土霉素降解菌株的分離
采集菌肥,將菌肥加入到蒸餾水中,混合,提取菌肥浸出液;
吸取菌肥浸出液,涂布于土霉素含量不同的無機鹽固體培養基平板上,置于30℃條件下遮光培養2天,得到菌落;
2)菌株純化
將步驟1)分離得到的菌落,在含有土霉素的無機鹽固體培養基平板上劃線,進一步分離和純化;此步驟重復2-3次,直至得到單一菌落;然后將單菌落接入含有土霉素的無機鹽液體培養基中,置于30℃,150r/min震蕩條件下,遮光培養2天,得到單一菌落培養液;
3)菌株降解功能驗證
將步驟2)得到的培養液,在土霉素為唯一碳源且土霉素濃度不同的無機鹽固體培養基平板上劃線,在30℃避光培養2天;能夠生長的菌株即為能夠以土霉素為唯一碳源的降解菌株;
4)菌株降解活性測定
將步驟3)得到的能在土霉素為唯一碳源生長的菌株,轉接到細菌活化培養基上進行活化;然后將活化的菌液按1%的接種量。轉接到以土霉素為唯一碳源且濃度適宜的無機鹽液體培養基中,30℃,150r/min震蕩培養7天,最后用高效液相色譜法測定菌株對土霉素的降解率;試管斜面保存不同濃度降解率高的菌株,4℃儲存。
2.根據權利要求1所述的一種土霉素降解菌株的篩選方法,其特征在于:步驟1)中菌肥和蒸餾水的添加比例為1g:10ml,吸取菌肥浸出液的體積為100ul。
3.根據權利要求1所述的一種土霉素降解菌株的篩選方法,其特征在于:步驟1)中中所述的無機鹽固體培養基中土霉素含量為25mg/l-100mg/l。
4.根據權利要求1所述的一種土霉素降解菌株的篩選方法,其特征在于:步驟1)中無機鹽固體培養基的組成為:氯化銨1g,磷酸二氫鉀0.5g,磷酸氫二鉀1.5g,硫酸鎂0.2g,氯化鈉1g,瓊脂20g,蒸餾水1000ml,調節pH至7.0,高壓滅菌;在倒平板前,在培養基中添加土霉素,添加濃度依次為25、50、100mg/l,搖勻。
5.根據權利要求1所述的一種土霉素降解菌株的篩選方法,其特征在于:步驟2)中無機鹽固體培養基的組成為:氯化銨1g,磷酸二氫鉀0.5g,磷酸氫二鉀1.5g,硫酸鎂0.2g,氯化鈉1g,瓊脂20g,蒸餾水1000ml,調節pH至7.0,高壓滅菌;在倒平板前,在培養基中添加土霉素,添加濃度依次為25mg/l,搖勻。
6.根據權利要求1所述的一種土霉素降解菌株的篩選方法,其特征在于:步驟2)中無機鹽液體培養基的組成為:氯化銨1g,磷酸二氫鉀0.5g,磷酸氫二鉀1.5g,硫酸鎂0.2g,氯化鈉1g,蒸餾水1000ml,調節pH至7.0,高壓滅菌;在冷卻到室溫后,在培養基中添加土霉素,添加濃度為25mg/l,搖勻。
7.根據權利要求1所述的一種土霉素降解菌株的篩選方法,其特征在于:步驟3)中無機鹽固體培養基的組成為:氯化銨1g,磷酸二氫鉀0.5g,磷酸氫二鉀1.5g,硫酸鎂0.2g,氯化鈉1g,瓊脂20g,蒸餾水1000ml,調節pH至7.0,高壓滅菌;在倒平板前,在培養基中添加土霉素,添加濃度依次為50mg/l、100mg/l,搖勻。
8.據權利要求1所述的一種土霉素降解菌株的篩選方法,其特征在于:步驟4)中細菌活化培養基為牛肉膏蛋白胨培養基,其配方為:牛肉膏3g,蛋白胨5g。氯化鈉5g,瓊脂18g,蒸餾水定容至1000ml,用1mol/l氫氧化鈉調節pH至7.0-7.2后滅菌。
9.據權利要求所述的一種土霉素降解菌株的篩選方法,其特征在于;所述的步驟1)和步驟2)包括以下過程:
a)菌種富集
采集菌肥,稱取菌肥10g,加至裝有100ml滅菌蒸餾水的三角瓶中,三角瓶中含玻璃珠,在恒溫搖床上以30℃,200r/min震蕩30min,取出后靜置;吸取1ml菌肥浸出液裝入100ml富集培養基的500ml的三角瓶中,30℃,150r/min震蕩條件下,暗培養2天;然后取10ml培養液轉入新的相同的培養基中,在相同的條件下繼續富集培養一次;
無機鹽液體富集培養基組成為:氯化銨1g,磷酸二氫鉀0.5g,磷酸氫二鉀1.5g,硫酸鎂0.2g,氯化鈉1g,瓊脂20g,蒸餾水1000ml,調節pH至7.0,分裝到250ml三角瓶中,高壓滅菌,在超凈工作臺中添加土霉素,添加濃度依次為25、50、100mg/l,搖勻;
b)菌株分離
吸取100ul上述富集培養液,分別一一對應涂布于上面所述3種不同土霉素濃度的無機鹽固體培養基平板上,置于30℃條件下遮光培養2天;
無機鹽固體培養基的組成為:氯化銨1g,磷酸二氫鉀0.5g,磷酸氫二鉀1.5g,硫酸鎂0.2g,氯化鈉1g,瓊脂20g,蒸餾水1000ml,調節pH至7.0,高壓滅菌;在倒平板前,在培養基中添加土霉素,添加濃度與無機鹽液體富集培養基相同。