本發明屬于微生物技術領域，尤其涉及一種嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法。

背景技術：

多環芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)由兩個或兩個以上苯環組成，具有結構穩定、難以生物降解的性質，是一類普遍存在于環境中的具有致癌、致畸、致突變的有機污染物，對生態環境和人類健康構成了巨大威脅，因此對PAHs的降解是人們關注的一項重要研究。

對于PAHs，主要是利用微生物如真菌、細菌、放線菌對其進行降解。PAHs是石油中芳香族化合物的主要成分，而石油污染常常伴隨著鹽堿化環境的存在，目前能降解PAHs的許多細菌真菌，在高鹽堿環境中代謝受到抑制，其降解PAHs的效率降低，因此，篩選出能夠在鹽堿環境中高效降解PAHs的微生物具有重要的現實意義。

蒽(An)、芘(Pyr)是典型的PAHs，在水中的溶解度為極小，其結構單元在致癌性苯并[a]蒽(Ba[a]A)和苯并[a]芘(Ba[a]P)中同樣存在，經常被用作微生物降解PAHs的模型化合物。因此，研究能夠在鹽堿環境中高效降解蒽、芘的微生物對于構建多環芳烴類物質生物降解模型極為重要。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法，旨在構建多環芳烴類物質生物降解模型，解決鹽堿環境中微生物活性受抑制，對蒽、芘的降解效率降低的問題。

本發明是這樣實現的，一種嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法，包括如下步驟：

1)菌種采集

a.從油田含油土壤中采集土壤樣品于無菌袋中，4℃冰箱密封保存；

b.將上述土壤樣品于選擇性的含蒽、芘的無機鹽培養基的錐形瓶中進行搖床培養，經五代(蒽、芘的初始質量濃度從5g·L^-1逐步提升至10g·L^-1)培養后，取適量培養液稀釋并涂布于選擇性固體平板；待有明顯菌落出現時，從中選擇形態特征相異的各種菌落作進一步的劃線純化工作，5個周期后得到純菌株；將所得各菌制備成菌懸液并重新接至選擇性的含蒽、芘無機鹽培養基進行復篩，選取降解率較高的菌株作為優勢菌株，進一步接種營養肉湯培養基進行富集培養24h后，保存于營養瓊脂斜面上，4℃冰箱保存備用。

c.將0.5mL菌懸液與0.5mL保護劑等體積加入5mL安培瓶中振蕩均勻后，置于-80℃下迅速冷凍6h后，用凍干機進行真空冷凍干燥，凍干后直接在凍干艙中壓蓋密封。

2)菌種復活

取凍干菌種，用75％的酒精棉消毒菌種接種管外壁后，用砂輪在安瓿瓶上三分之一處劃痕，用干燥的無菌紗布包裹安瓿瓶，將安瓿瓶掰開；用吸管將營養肉湯培養基0.3mL注入被開啟的菌種安瓿瓶中并振蕩，使安瓿瓶中的凍干菌種溶解成菌懸液。

將安瓿瓶中菌懸液吸出，接種到營養瓊脂斜面上，接種3管斜面，將接種后的營養瓊脂斜面置于培養箱中進行培養，觀察菌苔生長情況，后加入甘油保存備用。

3)菌種擴大

稱取營養肉湯培養基，加入蒸餾水，121℃下滅菌15min，后接種2接種環，37℃培養24h備用。

4)蒽、芘降解試驗

a.分別稱取0.5g蒽、芘于兩個反應瓶中，然后加入活性炭，加入10.0mL環己烷溶液溶解振蕩，并常溫揮發，待環己烷溶液揮發完后，加入菌種擴大懸液，塞上瓶塞，分多組試驗在一定溫度下恒溫震蕩培養，之后測定其脫氫酶活性。

b.分別稱取0.5g蒽、芘于兩個反應瓶中，然后加入活性炭，分多組試驗加入一定體積的2mol/L的NaCl溶液，并加入10.0mL環己烷溶液溶解振蕩，常溫揮發，待環己烷溶液揮發完后，加入菌種擴大懸液，塞上瓶塞，35℃溫度恒溫震蕩培養7天，之后測定其脫氫酶活性。

c.分多組稱取一定質量的蒽、芘，然后加入活性炭，并加入10.0mL環己烷溶解振蕩，并常溫揮發，待環己烷溶液揮發完后，加入菌種擴大懸液，塞上瓶塞，35℃溫度恒溫震蕩培養7天，之后測定其脫氫酶活性。

進一步地，所述步驟1)a中采集土壤樣品為距離地面深10cm，選取五個點均勻采樣，每個點的樣品采集范圍為1m²，每個點采集土壤為100g，采集后將五個采集點的土壤混勻，按照四分法將混合土壤逐漸的減少，留取250g的混合土壤樣品于無菌袋中。

進一步地，所述步驟1)b中所述無機鹽培養基：NH₄NO₃ 2g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.2g/L，CuSO₄ 0.1g/L，無水CaC1₂ 0.01g/L，Na₂EDTA·2H₂O 0.01g/L；無機鹽固體培養基中加入2％瓊脂；

所述含蒽、芘無機鹽培養基：分別用正己烷配制5g/L的蒽、芘溶液，濾膜過濾除菌，取一定量該溶液置于滅菌的錐形瓶中，待正己烷溶液揮發完畢后加入滅菌的無機鹽培養基；

所述富集培養：營養肉湯培養基(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉浸出粉5.0，氯化鈉5.0，pH：7.3±0.1；

所述保藏培養：營養瓊脂培養基(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉浸出粉5.0，氯化鈉5.0，瓊脂12.0，pH：7.3±0.1。

進一步地，所述步驟1)c中所述菌懸液是將嗜堿性假單胞桿菌接入富集培養基中37℃振蕩培養1天后的培養液，所述保護劑為無菌1.5％NaCl溶液、115℃滅菌30min后的明膠和糖溶液、煮沸滅菌的脫脂乳、經0.22μm濾膜過濾后的維生素C溶液。

進一步地，所述步驟1)c中所述冷凍干燥過程分為兩步，第一步冷凍干燥程序真空度為0.100mbar，凍干18h；第二步冷凍干燥程序真空度為0.034mbar，凍干2h。

進一步地，所述步驟2)中接種后的營養瓊脂斜面于培養箱中的培養溫度為37℃，培養時間為72小時。

進一步地，所述步驟4)a、b、c中加入活性炭的質量均為5.0g，加入菌種擴大懸液的體積均為5.0mL。

進一步地，所述步驟4)a中多組試驗恒溫震蕩的溫度分別為25℃、30℃、35℃、40℃，培養時間為7天。

進一步地，所述步驟4)b中多組試驗加入NaCl溶液的體積分別為200μL、250μL、300μL、350μL、400μL。

進一步地，所述步驟4)c中稱取蒽、芘的質量分別為0.3g、0.5g、0.7g、1.0g。

本發明的有益效果是：本發明提供的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法，從油田含油土樣中分離出的嗜堿性假單胞桿菌能夠在鹽度為0.65％-0.75％的環境中有效降解蒽、芘。降解蒽模型中優化試驗檢測表明，降解溫度為35.7℃，PAHs/活性炭百分數為3.89％，培養5天測定得到脫氫酶量值達140.353±6.43μg；降解芘模型中優化試驗檢測表明，降解溫度為34.8℃，PAHs/活性炭百分數為6.39％，培養5天測定得到脫氫酶量值達84.032±0.063μg；本發明在鹽堿環境中降解蒽、芘效率高，方法簡單。

附圖說明

圖1是本發明實施例提供的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽(An)、芘(Pyr)時溫度對降解產生的脫氫酶量的影響。

圖2是本發明實施例提供的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽(An)、芘(Pyr)時鹽度對降解產生的脫氫酶量的影響。

圖3是本發明實施例提供的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽(An)、芘(Pyr)時PAHs/活性炭百分數對降解產生的脫氫酶量的影響。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。

本發明實施例提供的嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的方法，包括：

1.實驗部分

1.1嗜堿性假單胞桿菌菌種的培養

1)菌種采集

a.以陜西濟源油田周邊被石油污染的土壤為實驗樣品。采集方法是：用小鐵鍬去掉土地層的土壤，選取五個點均勻采樣，采樣時采集距離地面深10cm處的土壤，每個點的樣品采集范圍為1m²,每個點采集土壤大約為100g，采集完成后將五個采集點的土壤混合在一起，充分混勻，按照四分法將混合土壤逐漸的減少，留取250g的混合土壤樣品裝入無菌袋中帶回實驗室，于4℃冰箱密封保存，用于后期的菌種分離。

b.向上述土壤樣品中加入適量蒸餾水，放置1天，靜止后，取10mL上清液于盛有100L選擇性的含蒽、芘的無機鹽培養基的錐形瓶中進行搖床培養，經5代(蒽、芘的初始質量濃度從5g·L^-1逐步提升至10g·L^-1)培養后，取適量培養液稀釋并涂布于選擇性固體平板；待有明顯菌落出現時，從中選擇形態特征相異的各種菌落作進一步的劃線純化工作，5個周期后得到純菌株；將所得各菌制備成菌懸液并重新接至選擇性的含蒽、芘無機鹽培養基進行復篩，選取降解率較高的菌株作為優勢菌株，進一步接種營養肉湯培養基進行富集培養24h后，保存于營養瓊脂斜面上，4℃冰箱保存備用。

無機鹽培養基：NH₄NO₃ 2g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.2g/L，CuSO₄ 0.1g/L，無水CaC1₂ 0.01g/L，Na₂EDTA·2H₂O 0.01g/L；無機鹽固體培養基中加入2％瓊脂；

含蒽、芘無機鹽培養基：分別用正己烷配制5g/L的蒽、芘溶液，濾膜過濾除菌，取一定量該溶液置于滅菌的錐形瓶中，待正己烷揮發完畢后加入滅菌的無機鹽培養基；

富集培養：營養肉湯培養基(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉浸出粉5.0，氯化鈉5.0，pH：7.3±0.1；

保藏培養：營養瓊脂培養基(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉浸出粉5.0，氯化鈉5.0，瓊脂12.0，pH：7.3±0.1。

c.將0.5mL菌懸液(將嗜堿性假單胞桿菌接入富集培養基中37℃振蕩培養1天后的吸取量)與0.5mL保護劑(溶劑為無菌1.5％NaCl溶液，115℃滅菌30min后的明膠和糖溶液，煮沸滅菌的脫脂乳，經0.22μm濾膜過濾后的維生素C溶液)等體積加入5mL安培瓶中振蕩均勻后，置于-80℃下迅速冷凍6h后，用凍干機進行真空冷凍干燥，冷凍干燥過程分為兩步，第一步冷凍干燥程序真空度為0.100mbar，凍干18h；第二步冷凍干燥程序真空度為0.034mbar，凍干2h，凍干后直接在凍干艙中壓蓋密封。

2)菌種復活

取凍干菌種，用75％的酒精棉消毒菌種接種管外壁后，用砂輪在安瓿瓶上三分之一處劃痕，用干燥的無菌紗布包裹安瓿瓶，將安瓿瓶掰開。用吸管將營養肉湯培養基0.3mL注入被開啟的菌種安瓿瓶中并振蕩，使安瓿瓶中的凍干菌種溶解成菌懸液。

將安瓿瓶中菌懸液吸出，接種到營養瓊脂斜面上，接種3管斜面，將接種后的營養瓊脂斜面置于培養箱中，37℃培養72小時，觀察菌苔生長情況，后加入甘油保存備用。

3)菌種擴大

稱取營養肉湯培養基，加入蒸餾水，121℃下滅菌15min，后接種2接種環，37℃培養24h備用。

1.2蒽單因子試驗

1)溫度單因子試驗

稱取0.5g蒽于反應瓶中，加入5.0g活性炭和10.0mL環己烷溶液溶解振蕩，并常溫揮發，待環己烷溶液揮發完后，加入5.0mL菌種擴大懸液，塞上瓶塞，并根據試驗設計溫度25℃、30℃、35℃、40℃恒溫震蕩培養7天，后測定其脫氫酶活性。

2)鹽度單因子試驗

稱取0.5g蒽于反應瓶中，加入5.0g活性炭，按照試驗設計加入200μL、250μL、300μL、350μL、400μL濃度為2mol/L的NaCl溶液，并加入10.0mL環己烷溶解振蕩，并常溫揮發，待環己烷溶液揮發完后，加入5.0mL菌種擴大懸液，塞上瓶塞。35℃溫度下恒溫震蕩培養7天，后測定其脫氫酶活性。

3)PAHs/活性炭百分數單因子試驗

分別稱取0.3g、0.5g、0.7g、1.0g蒽于反應瓶中，加入5.0g活性炭和10.0mL環己烷溶解振蕩，并常溫揮發，待環己烷溶液揮發完后，加入5.0mL菌種擴大懸液，塞上瓶塞。35℃溫度下恒溫震蕩培養7天，后測定其脫氫酶活性。

4)脫氫酶活性測定

稱取1.0g上述降解后的培養物離心洗滌后置于反應瓶中，加入3mL蒸餾水，2.0mL分析純HCl溶液，振蕩均勻后再加入0.5mL紅四氮唑溶液，37℃培養24h后立即取出，滴加2滴濃硫酸終止反應，振蕩再加入5.0mL甲苯振蕩分層，4000rpm/min離心，以甲苯為空白對照，取有機層于紫外分光光度計λ＝486nm處測定吸光度值，并與標準曲線對比計算其脫氫酶活性。

1.3芘單因子試驗

假單胞桿菌對芘的降解單因子試驗其操作與蒽單因子試驗類似，降解條件及各試驗參數相同。

1.4蒽、芘響應面試驗設計

以溫度、鹽度、PAHs/活性炭百分數百分數為自變量，分別以A、B、C(X1、X2、X3)表示，并以-1、0、+1分別表示自變量低、中、高水平，以脫氫酶活性為響應值，分別以Y1、f1表示。進行響應面試驗設計，試驗因素及因素水平見表1、表2。

表1蒽降解響應面試驗因素及水平

表2芘降解響應面試驗因素及水平

2.結果與討論

2.1蒽、芘單因子試驗

1)溫度單因子試驗結果

如圖1所示，蒽、芘溫度單因子試驗中，對于嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘溫度的影響具有同步性，溫度為30℃時，菌體的生長狀況最好，其次是溫度為35℃、37℃時，當溫度為25℃和40℃時，菌體的生長狀況較差；溫度為35℃時，試驗菌降解蒽、芘的脫氫酶量最大。

2)鹽度單因子試驗結果

如圖2所示，蒽、芘鹽度單因子試驗中，對于嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘鹽度的影響具有同步性，鹽度為0.7％時，試驗菌降解蒽、芘的脫氫酶量最大。

3)PAHs/活性炭百分數單因子試驗結果

如圖3所示，蒽、芘PAHs/活性炭百分數單因子試驗中，對于嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘物質質量百分數的影響存在差異性，降解蒽的最適的物質質量百分數因素條件是5％，降解芘的最適的質量百分數因素條件是7％，由蒽、芘化學結構以及溶解性比較可知，蒽為多環芳烴組成的三苯戒指表面張力(dyne/cm)為47.9、介電常數(F/m)為3.08、極化率(10-24cm³)為24.55；而芘為有并四苯結構極化率(10-24cm³)為28.72，非極性吸附劑中蒽被吸附效果較芘好，在較低百分含量的活性炭即可達到較好的吸附效果，而芘在同等條件下被活性炭吸附的效果好。

2.2響應面試驗

1)模型建立與分析

試驗采用三因素三水平響應面法優化嗜堿性假單胞桿菌降解蒽、芘的因素條件，試驗按照Design-Expert軟件中Box-Behnken Design，試驗設計與結果如表3、表4所示。

表3蒽響應面實驗方案及結果

表4芘響應面實驗方案及結果

按照Design-Expert軟件中Box-Behnken Design模型對試驗中脫氫酶量的進行回歸分析，得兩條回歸方程，其中蒽、芘物質的降解脫氫酶量回歸方程分別為：

Y＝140.35+10.43*A-1.58*B-5.37*C-12.77*A*B+15.19*A*C+9.67*B*C-34.19*A²-25.24*B²-18.97*C²

F＝84.03+5.13X₁+5.15X₂-8.12X₃-5.43X₁X₂-0.049X₁X₃-1.15X₂X₃-25.02X₁²-4.17X₂²-11.40X₃²

式中Y表示嗜堿性假單孢桿菌降解蒽物質過程中產生的脫氫酶量，F表示嗜堿性假單孢桿菌降解芘物質過程中產生的脫氫酶量，A、B、C、X₁、X₂、X₃分別為表1、表2所示的自變量編碼值，蒽降解回歸方程的R₁²＝0.8792，芘降解回歸方程的R₂²＝0.9675，通過模型的回歸系數顯著性檢驗分析可得，嗜堿性假單孢桿菌降解蒽過程產生脫氫酶量模型的F值為5.66(F-valμe pro＝0.0016<0.05)，意味著該模型擬合程度是顯著的，僅有1.62％可能模型是由于噪聲，且模型失擬系數1.584是不顯著的，由模型信噪比檢驗可知道，該模型精密度為6.821(精密度大于4是可取的)，即該模型可以用來設計空間試驗。同時在三個自變量以及兩兩之間的交互作用對于蒽的物質降解產生的脫氫酶量的影響效果不顯著，但在該模型中A²，B²，C²對于蒽的物質降解產生的脫氫酶量的影響效果是顯著的。此外該模型的主效應影響為：A>C>B。嗜堿性假單孢桿菌降解芘過程產生脫氫酶量模型的F值為23.15(F-Valμe pro＝0.0002<0.01)是極顯著的，該模型僅有0.02％的可能模型F-Valμe是由于噪聲。在該模型中X₁，X₂，X₃，X₁²，X₃²是顯著的模型參數，同時模型R-Sqμared＝0.9675，為更加準確的反映降解模型，將該模型的R-Sqμared調整為0.9257。模型失擬系數<0.01，可能存在噪聲因素的可能性較大，但是在模型信噪比檢測中精密度為13.837(精密度大于4是可取的)，即該模型可以用來設計空間試驗，在該模型的主效應影響中分別為X₃，X₂，X₁。

2)模型最優化試驗參數

根據Design-Expert Box-Behnken模型設計，得出嗜堿性假單胞桿菌對蒽的降解溫度為35.73℃、降解鹽度為0.69％、PAHs/活性炭百分數為3.89％，培養5天測定得到脫氫酶量值為140.353±6.43μg。嗜堿性假單胞桿菌對芘的降解溫度為34.78℃、降解鹽度為0.73％、PAHs/活性炭百分數為6.39％，培養5天測定得到脫氫酶量值為84.032±0.063μg。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。