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一種用于單通道雙靶點核酸檢測的實時熒光PCR檢測方法與流程

文檔序號:11126308閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種用于單通道雙靶點核酸檢測的實時熒光PCR檢測方法,其特征在于,包括:

PCR體系中引入了與核酸模板互補的探針和特異性引物,設定PCR擴增程序,進行PCR擴增循環,所述PCR擴增循環的過程中,每個循環均在延伸步驟中進行實時的熒光信號強度采集,并通過對實時的熒光信號強度變化對目標靶序列一進行定性分析;所述探針的5’端標記熒光報告基團,所述探針的3’端標記猝滅基團;所述特異性引物標記引物猝滅基團和引物熒光報告基團;

所述PCR擴增循環結束后,通過采集的熒光信號強度變化繪制熔解曲線對檢測的目標靶序列二進行定性分析。

2.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述通過對實時的熒光信號強度變化對檢測的目標靶序列一進行定性分析的步驟包括:

通過酶水解所述探針產生熒光強度變化對檢測的目標靶序列一進行定性分析。

3.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述通過采集的熒光信號強度變化繪制熔解曲線對檢測的目標靶序列二進行定性分析的步驟包括:

采集所述特異性引物的擴增產物的熒光信號強度變化繪制熔解曲線對檢測的目標靶序列二進行定性分析。

4.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述特異性引物的5’端修飾標記引物猝滅基團,所述特異性引物中間位置標記引物熒光報告基團。

5.根據權利要求4所述的方法,其特征在于,所述引物猝滅基團與所述引物熒光報告基團之間的間距為15-25nt。

6.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述探針的Tm值高于所述特異性引物的Tm值5℃-10℃。

7.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述PCR擴增程序包括;

預變性和酶激活溫度為95℃,時間為1min;

逆轉錄溫度為60℃,時間為30min;

cDNA預變性溫度為95℃,時間為1min;

變性溫度為95℃,時間為15s;

退火溫度為60℃,時間為30s;

延伸及熒光采集的溫度為72℃,時間為30s;

熔解曲線分析的溫度為55℃-95℃。

8.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述特異性引物包括:目標靶序列一特異性引物和目標靶序列二特異性熒光引物;

所述目標靶序列一特異性引物的核酸序列為:SEQ ID NO:1AAGAACACAGATCTCGAGGCTCTC和SEQ ID NO:2GTCTCCATTTCCATTTAGGGCATTC;

所述目標靶序列二特異性引物的核酸序列為:SEQ ID NO:4[BHQ1]-TTCAAATATCAGACAAAAACAAAACCAA[T(FAM)]C C和SEQ ID NO:5TGTCTATTTTGTTGCTTTAATAATCGAG。

9.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述探針的核酸序列為:SEQ ID NO:3CTGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC。

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