本發(fā)明涉及海洋微生物，尤其是涉及科爾維爾氏菌屬嗜冷新菌種及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

科爾維爾氏菌屬由Deming等人在1988年提出建立的，模式菌種為Colwellia psychrerythraea。目前科爾維爾氏菌屬共包括14個(gè)種，全部分離自海水環(huán)境。菌屬特征為桿狀或曲桿狀細(xì)胞，革蘭氏陰性，不產(chǎn)生孢子，具運(yùn)動(dòng)性，兼性厭氧，大部分生活于低溫海水環(huán)境。

多相分類的概念最初由Colwell于1970年提出，是指利用微生物多種不同的信息，包括表型的、基因型的和系統(tǒng)發(fā)育的信息，綜合起來(lái)研究微生物分類和系統(tǒng)進(jìn)化的過(guò)程。其中DNA同源性分析是確定正確的分類地位的最直接的方法，而DNA-DNA雜交可以在總體水平上研究微生物間的關(guān)系，用于種水平上的分類學(xué)研究。1987年，國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)委員會(huì)規(guī)定，DNA同源性≥70％為細(xì)菌種的界限。

低溫酶由于其低溫催化活性以及熱不穩(wěn)定性在工業(yè)應(yīng)用上具有中溫酶無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)：可以通過(guò)溫和的熱處理使低溫酶失活，快速而經(jīng)濟(jì)地終止反應(yīng)；生產(chǎn)過(guò)程在低溫或室溫下進(jìn)行，無(wú)需加熱和冷卻，可以降低成本。在食品、醫(yī)藥以及化工等行業(yè)較中溫酶具有較大的優(yōu)越性。科爾維爾菌屬中大部分微生物都為嗜冷微生物，而且可以產(chǎn)生豐富的低溫蛋白酶、淀粉酶和酯酶，在食品、醫(yī)療以及化工等行業(yè)顯示出很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1。

本發(fā)明的目的之二在于提供科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的16S rRNA基因序列。

本發(fā)明的目的之四在于提供科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1在液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫蛋白酶、酯酶和淀粉酶中的應(yīng)用。

所述科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1，已于2016年10月27日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，郵編：430072，保藏中心保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2016597。

所述科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的培養(yǎng)方法如下：

將科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1接種于培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度4～25℃，pH 6.4～9.7，質(zhì)量百分濃度為1％～6％的NaCl條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

所述培養(yǎng)基可采用海洋細(xì)菌常規(guī)培養(yǎng)基，優(yōu)選2216E培養(yǎng)基。

所述培養(yǎng)溫度優(yōu)選10～13℃，pH優(yōu)選7.0～9.7，NaCl質(zhì)量百分濃度優(yōu)選2％～3％。

所述培養(yǎng)可在需氧條件下進(jìn)行，培養(yǎng)可以是各種微生物的培養(yǎng)方式，可采用液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、半固體培養(yǎng)、搖床培養(yǎng)或發(fā)酵罐發(fā)酵。

所述培養(yǎng)的接種量為常規(guī)，按體積百分比優(yōu)選1％～2％。

所述科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的16S rRNA基因序列為SEQ所示的堿基序列。

所述科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1可在液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫蛋白酶、酯酶和淀粉酶中應(yīng)用。

在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

本發(fā)明所用試劑盒及原料均市售可得。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供了科爾維爾氏菌屬的一個(gè)嗜冷新菌種，該菌株的分類地位是Colwellia sp.。該新種的發(fā)現(xiàn)和其潛在的利用價(jià)值豐富了我們的可利用海洋微生物資源，對(duì)以后更好地利用海洋細(xì)菌有一定的貢獻(xiàn)。本發(fā)明的科爾維爾氏菌，可以提取低溫蛋白酶、酯酶和淀粉酶，在食品、醫(yī)藥以及化工等行業(yè)將具有廣泛應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1透射電鏡照片。

圖2為科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1在溫度10℃、13℃、16℃下的生長(zhǎng)曲線。

圖3為科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1在溫度19℃、22℃、25℃、28℃下的生長(zhǎng)曲線。

圖4為科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1 16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

圖5為科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1對(duì)干酪素與淀粉的降解。a，科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1降解干酪素產(chǎn)生透明圈；b，科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1降解淀粉，革蘭氏碘液染色出現(xiàn)透明圈。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明局限在所述的實(shí)例范圍之內(nèi)，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件和方法，或按照商品說(shuō)明書(shū)。

實(shí)施例1、本發(fā)明科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的分離純化

取第六次北極考察所采集海水沉積物樣品，利用稀釋涂平板法，將其稀釋后涂布于2216E固體培養(yǎng)基平板上，置于10℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7天，挑取單菌落，然后劃線純化。

實(shí)施例2、本發(fā)明科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的表觀特征

1、菌落特征

取科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的單菌落，轉(zhuǎn)接到2216E固體培養(yǎng)基上，于10℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60h，觀察其菌落的大小、顏色、邊緣、凸起、光滑度、粘性、透明度等特點(diǎn)。結(jié)果顯示，科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1在2216E固體培養(yǎng)基上形成邊緣整齊，光滑，濕潤(rùn)，不透明，白色的菌落，直徑約為2mm。

2、細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征

細(xì)胞為桿狀，具端生鞭毛，革蘭氏染色陰性，單生(如圖1所示)。

實(shí)施例3、本發(fā)明新科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的生長(zhǎng)特性

挑取在2216E固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)60h的新鮮培養(yǎng)物，接種到2216E液體培養(yǎng)基，13℃搖床培養(yǎng)大約24h，作為種子。

1、生長(zhǎng)溫度

將所培養(yǎng)的科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1種子按1％接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的2216E液體培養(yǎng)基中并混勻。置于10℃、13℃、16℃、19℃、22℃、25℃、28℃搖床培養(yǎng)，每個(gè)溫度梯度做三個(gè)平行，分別測(cè)定生長(zhǎng)曲線。4℃下的生長(zhǎng)情況通過(guò)固體平板上的培養(yǎng)來(lái)檢測(cè)，將科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1接種至2216E固體培養(yǎng)基，置于4℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，兩天后有明顯的菌落出現(xiàn)。以上顯示科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的生長(zhǎng)溫度范圍為4～25℃，最適生長(zhǎng)溫度約為13℃(如圖2和3所示)。

2、NaCl耐受性

將所培養(yǎng)的科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1種子按1％接種量轉(zhuǎn)接NaCl濃度分別為0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％和8％的2216E培養(yǎng)基，13℃下?lián)u床培養(yǎng)，并分別測(cè)定其生長(zhǎng)的最大生物量，結(jié)果顯示科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1可以在NaCl濃度范圍為1％～6％的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)NaCl濃度為2％～3％，沒(méi)有NaCl的情況下檢測(cè)不到生長(zhǎng)。

3、生長(zhǎng)pH范圍

將2216E培養(yǎng)基用1M HCl和1M NaOH分別調(diào)整pH至3.4、4.4、5.4、6.4、7.0、7.8、8.8、9.8和10.8，并將所培養(yǎng)的NB09701種子按1％接種量接入，13℃下?lián)u床培養(yǎng)，檢測(cè)其生長(zhǎng)的最大生物量，結(jié)果顯示科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1生長(zhǎng)的pH范圍為6.4～9.8，最適生長(zhǎng)pH為7.8～9.8。

實(shí)施例4、本發(fā)明科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的生理生化特性

利用API ZYM、API20NE和API20E鑒定系統(tǒng)以及常規(guī)的生理生化測(cè)定方法對(duì)科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1以及相關(guān)的同屬菌株進(jìn)行生理生化性質(zhì)測(cè)定。

科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的主要生理生化特征：好氧生長(zhǎng)，接觸酶陽(yáng)性，可以降解明膠、干酪素、淀粉、Tween 20，40，60，80；堿性磷酸鹽酶、酸性磷酸酶、酯酶和白氨酸芳胺酶陽(yáng)性，類脂酯酶、纈氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖苷酶、β-巖藻糖苷酶陰性；脲酶陽(yáng)性，可以還原硝酸鹽至亞硝酸鹽，不產(chǎn)生吲哚，VP反應(yīng)陰性。

實(shí)施例5、本發(fā)明科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定以及系統(tǒng)發(fā)育特征

1、提取基因組DNA

將科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1以1％接種量接種至2216E培養(yǎng)基，于13℃下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，收集生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中后期的菌體，用革蘭氏陰性細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根)按照操作說(shuō)明提取基因組DNA。

2、16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序

以科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的基因組DNA為模板，27F與1492R為引物通過(guò)PCR擴(kuò)增16S rRNA基因。27F與1492R的堿基序列分別為5’-AGAGTTTGCTCMTGGCTCAG-3’，5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR產(chǎn)物連接于載體pMD-18T后委托生工生物工程有限公司進(jìn)行全長(zhǎng)序列的測(cè)定，其16S rRNA基因的核苷酸如SEQ所示。

3、16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育特征

將科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的16S rRNA基因序列在Genbank以及EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源比對(duì)分析，其序列與Colwellia aestuarii的16S rRNA基因序列最接近，序列相似性為97.8％。

將上述的16S rRNA基因序列使用軟件MEGA繪制進(jìn)化關(guān)系樹(shù)，采用neighbor-joining計(jì)算，并以maximum-parsimony和maximum-likelihood進(jìn)行驗(yàn)證計(jì)算，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見(jiàn)，通過(guò)對(duì)16S rRNA基因的進(jìn)化樹(shù)分析，科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1可以歸入到Colwellia菌屬，與Colwellia aestuarii，Colwellia polaris，Colwellia chukchiensis親緣關(guān)系最近。科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1與Colwellia aestuarii，Colwellia polaris，Colwellia chukchiensis的16s rRNA基因序列一致性分別為97.8％，97.2％，96.8％。

實(shí)施例6、本發(fā)明科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的脂肪酸含量特征

科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的總脂肪酸含量測(cè)定，以其近緣菌株Colwellia aestuarii，Colwellia polaris和Colwellia chukchiensis作為參比對(duì)照。

配制如下溶液：

試劑1：45g NaOH溶于150ml甲醇以及150ml雙蒸水；

試劑2：325ml鹽酸與275ml甲醇混合均勻；

試劑3，200ml正己烷與200ml甲基叔丁基醚混合均勻；

試劑4：10.8g NaOH溶于900ml雙蒸水；

試劑5：飽和NaCl溶液。

具體步驟如下：

1)將科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1接種至2216E固體培養(yǎng)基平板上，13℃避光培養(yǎng)60h左右，挑取0.2g菌體；

2)加入1mL試劑1于測(cè)定管內(nèi)，充入氮?dú)?-10s后將管蓋擰緊，渦旋振蕩20s；將測(cè)定管放入超聲破碎儀內(nèi)超聲處理10min，再充分振蕩后放入100℃水浴鍋內(nèi)加熱處理25min；每隔5min取出振蕩5～10s；處理結(jié)束后放入涼水中快速冷卻；

3)在測(cè)定管內(nèi)加入2ml試劑2，迅速將管蓋擰緊，渦旋振蕩20s；80℃水浴10min；處理結(jié)束后放入涼水中快速冷卻；

4)在測(cè)定管內(nèi)加入1.25ml的試劑3，將管蓋擰緊，渦旋振蕩10min，使萃取更充分，靜置3～5min待溶液分層后，用干燥潔凈的玻璃吸管將下層溶液吸取掉，保留上層液相；

5)在上述溶液中加入3ml試劑4和500μl試劑5，擰緊管蓋，渦旋振蕩3～5min，靜置10～15min使溶液分層，吸取約2/3的上清得脂肪酸樣品。

HP 6890氣相色譜儀，配備分流/不分流進(jìn)樣口，氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)及HP氣相色譜化學(xué)工作站(HP CHEMSTATION ver A 5.01)；色譜柱為Ultra-2柱，長(zhǎng)25m，內(nèi)徑0.2mm，液膜厚度0.33mm；爐溫為二階程序升溫：起始溫度170℃，每分鐘5℃升至260℃，隨后以40℃/min升至310℃，維持1.5min；進(jìn)樣口溫度250℃，載氣為氫氣，流速0.5ml/min，分流進(jìn)樣模式，分流比100:1，進(jìn)樣量2ml；檢測(cè)器溫度300℃，氫氣流速30ml/min，空氣流速216ml/min，補(bǔ)充氣(氮?dú)?流速30ml/min。

結(jié)果顯示，科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的主要細(xì)胞脂肪酸為不飽和脂肪酸C_16:1w7c or C_16:1w6c，C_17:1w8c，C_18:1w7c以及十六碳飽和脂肪酸C_16:0，含量分別為40.71％，10.91％，9.55％，15.98％。符合Colwellia菌屬主要的脂肪酸類型，而且同近緣菌株在脂肪酸種類與含量上均有一定差異，由此可以推斷科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1為不同于其近緣菌株的一個(gè)新種。

實(shí)施例7、本發(fā)明科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1與其近緣菌株的DNA-DNA雜交試驗(yàn)

參考16S rRNA的比對(duì)結(jié)果，對(duì)科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1與遺傳親緣關(guān)系最相近(16S rRNA基因序列相似性大于97％)的種Colwellia aestuarii和Colwellia polaris進(jìn)行DNA-DNA雜交試驗(yàn)。

采用液相復(fù)性率方法，所用儀器為Cary Series UV-Vi Spectrophotometer。溫度控制用Peltier temperature-controlling programmer數(shù)字控溫程序。

結(jié)果顯示科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1與Colwellia aestuarii和Colwellia polaris的DNA相關(guān)性分別為48.5％，40.2％，低于國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)委員會(huì)在1987年關(guān)于DNA相關(guān)性70％為細(xì)菌種的界限規(guī)定。結(jié)合實(shí)施例2～6的數(shù)據(jù)，可以判定科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1為Colwellia菌屬的一個(gè)新菌種，科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的分類地位是Colwellia sp.。

實(shí)施例8、本發(fā)明科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1的應(yīng)用價(jià)值

經(jīng)生理生化性質(zhì)測(cè)定，科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1在低溫(10℃)下可以降解干酪素產(chǎn)生透明圈，降解淀粉，經(jīng)革蘭氏碘液染色出現(xiàn)透明圈(如圖5所示)，說(shuō)明其具有低溫蛋白酶和淀粉酶活性。經(jīng)API ZYM檢定系統(tǒng)測(cè)定，科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1低溫(10℃)下酯酶(C4)活性以及對(duì)明膠的降解呈陽(yáng)性，說(shuō)明其具有低溫酯酶和蛋白酶的活性。該嗜冷菌來(lái)源的低溫蛋白酶、酯酶和淀粉酶將在食品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)顯示出良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明所述科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1分離自北極地區(qū)白令海域海水沉積物，保藏號(hào)為CCTCC M 2016597。依據(jù)多相分類學(xué)方法，該菌株是科爾維爾氏菌屬的一個(gè)新種，其分類地位是Colwellia sp.。本發(fā)明所提供的科爾維爾菌屬(Colwellia sp.)NB097-1低溫生長(zhǎng)(10～13℃)，易培養(yǎng)。該新種的發(fā)現(xiàn)及其潛在應(yīng)用價(jià)值豐富了可利用的低溫微生物資源。本發(fā)明所提供的科爾維爾氏菌嗜冷新菌種具有蛋白酶、酯酶和淀粉酶活性，為食品、醫(yī)藥以及化工等行業(yè)提供了產(chǎn)低溫蛋白酶、酯酶和淀粉酶的菌種資源。

序列表

<110> 國(guó)家海洋局第三海洋研究所

<120> 科爾維爾氏菌屬嗜冷新菌種及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1537

<212> DNA

<213> 科爾維爾氏菌種（Colwellia sp.）

<400> 1

gagtttgatc atggctcaga ttgaacgctg gcggcaggct taacacatgc aagtcgagcg 60

gtaacagaga tagcttgcta tctgctgaca agcggcggac gggtgagtaa tgcttgggaa 120

tatgcctttg agtgggggac aacagttgga aacgactgct aataccgcat aacgtctacg 180

gaccaaaggg ggggacgctt cggcacctct cgctcattga ttagcccaag tgagattagc 240

tagttggtaa ggtaatggct taccaaggcg acgatctcta gctggtttga gaggatgatc 300

agccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt 360

gcacaatggg cgaaagcctg atgcagccat gccgcgtgtg tgaagaaggc cttcgggttg 420

taaagcactt tcagcgagga ggaaaggtta gtagttaata actgctagct gtgacgttac 480

tcgcagaaga agcaccggct aacttcgtgc cagcagccgc ggtaatacga ggggtgcaag 540

cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgt gcgtaggtgg tttgttaagc aagatgtgaa 600

agccctgggc tcaacctggg aactgcattt tgaactggca agctagagtt ttgtagaggg 660

tagtggaatt tccagtgtag cggtgaaatg cgtagagatt ggaaggaaca tcagtggcga 720

aggcggctac ctggacaaag actgacactg aggcacgaaa gcgtggggag caaacaggat 780

tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgtcaacta gccgtctgta gacttgatct 840

gtgggtggcg tagctaacgc gctaagttga ccgcctgggg agtacggccg caaggttaaa 900

actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgatgca 960

acgcgaagaa ccttaccatc ccttgacatc cagagaagag actagagata gacttgtgcc 1020

ttcgggaact ctgtgacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgttgt gaaatgttgg 1080

gttaagtccc gcaacgagcg caacccctat ccttatttgc cagcgagtta tgtcgggaac 1140

tctaaggaga ctgccggtga taaaccggag gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgg 1200

cccttacggg atgggctaca cacgtgctac aatggcaagt acagagggca gcaataccgc 1260

gaggtggagc gaatcccaca aagcttgtcg tagtccggat tggagtctgc aactcgactc 1320

catgaagtcg gaatcgctag taatcgtaga tcagaatgct acggtgaata cgttcccggg 1380

ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggttgc aaaagaagtg gctagtttaa 1440

cccttcgggg aggacggtca ccactttgtg attcatgact ggggtgaagt cgtaacaagg 1500

taaccctagg ggaacctggg gttggatcac ctcctta 1537