本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用領(lǐng)域，特別是涉及一種新型紫花苜蓿根瘤菌包埋固定化顆粒劑型的制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豆科植物和根瘤菌共生體系是自然界存在的最重要的生物固氮體系之一，也是農(nóng)業(yè)中應(yīng)用最廣、經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益最好的一個(gè)方面。目前的根瘤菌接種劑類型較多。常用的有普通草炭吸附劑型、液體劑型、瓊脂斜面培養(yǎng)物劑型、液體礦油劑型、冷凍干燥劑型和顆粒劑型。其中最常用的就是草炭吸附菌劑，它是用草炭吸附發(fā)酵液制成的。由于含有大量的有機(jī)質(zhì)，微生物在合適的溫度下能夠增殖，但是這種方法也有缺點(diǎn)，一是不宜機(jī)播，二是不利于人工接種的根瘤菌到土壤中與土著根瘤菌群體競爭結(jié)瘤。然而，近幾年美國的研究表明，蛭石可以作為草炭替代物的首選，由于蛭石質(zhì)輕、孔隙度大、吸附力強(qiáng)，可能在含菌數(shù)上超過草炭。但蛭石沒有有機(jī)質(zhì)，是致命的缺點(diǎn)。固定化細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展為農(nóng)業(yè)微生物的高效利用指明了方向。所謂固定化細(xì)胞技術(shù)，即是將微生物細(xì)胞固定于某些特殊材料(如海藻酸鈉等)內(nèi)，制成顆粒后形成有限空間，以使菌體在一定時(shí)間內(nèi)保持其生物活性并得到增殖的方法。目前，在醫(yī)藥、食品、發(fā)酵工業(yè)及廢水處理等領(lǐng)域已得到了廣泛應(yīng)用，在大豆根瘤菌包埋方面也有初步研究，而苜蓿根瘤菌包埋固定化顆粒的制備和應(yīng)用目前還是空白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是研制新型苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒，使苜蓿種植企業(yè)更加方便地添加苜蓿根瘤菌，在復(fù)配、加工、造粒和運(yùn)輸貯藏過程中不損失菌劑的活性，使種植戶更加簡便地使用苜蓿根瘤菌菌肥。突破了高耐受、高活力的苜蓿根瘤菌肥種子包被技術(shù)的主要技術(shù)瓶頸難點(diǎn)，解決苜蓿根瘤菌保護(hù)劑活力難以保持和添加使用不方便的技術(shù)難題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型的制備方法，包括如下步驟：

步驟1、培養(yǎng)紫花苜蓿根瘤菌：利用YMA液體培養(yǎng)基或YMA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)苜蓿根瘤菌，至活菌數(shù)達(dá)1×10⁹個(gè)/ml以上，制成紫花苜蓿根瘤菌菌液；

步驟2、離心分離紫花苜蓿根瘤菌菌液：將步驟1制備的紫花苜蓿根瘤菌菌液分成每份10ml的菌液，進(jìn)行離心，首次分離后去掉分離上清液后，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液第二次添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液第三次添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，得到離心分離后的紫花苜蓿根瘤菌菌液；

步驟3、制備紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑：向步驟2制得的離心分離后的紫花苜蓿根瘤菌菌液加入10ml無菌海藻酸鈉溶液，向混合均勻后的溶液內(nèi)加入5～20mL滅菌脫脂乳，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笾频米匣ㄜ俎８鼍潭ɑ窬鷦?/p>

步驟4、制備紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型：將步驟3制備的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑抽入到10mL無菌注射器中，將10mL無菌注射器中的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑緩慢勻速地滴入到20ml的CaCl₂溶液中，滴入速度50～200滴/min，滴入后制成紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒，將得到的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒在4℃下固定18h，得到紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型。

本發(fā)明所述的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型的制備方法，步驟1中YMA液體培養(yǎng)基是稱量甘露醇10g、酵母粉0.4g、NaCl0.1g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.2g加入1000蒸餾水中，121℃滅菌后降溫至28℃，得到Y(jié)MA液體培養(yǎng)基，溶液pH值為6.8～7；步驟1中YMA固體培養(yǎng)基是在YMA液體培養(yǎng)基中加入18～20g/l瓊脂粉。

本發(fā)明所述的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型的制備方法，步驟2中離心分離的轉(zhuǎn)速為5000～10000轉(zhuǎn)/min,離心時(shí)間1～10min。

本發(fā)明所述的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型的制備方法，步驟3中無菌海藻酸鈉溶液的濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)3％～6％。分別稱取海藻酸鈉1.5g，2g，2.5g，3g溶解于50ml的蒸餾水中，配制成3％，4％，5％，6％的海藻酸鈉溶液。

本發(fā)明所述的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型的制備方法，步驟4中無菌注射器的針頭型號(hào)是4號(hào)、6號(hào)或9號(hào)；步驟4中CaCl₂溶液的濃度為0.15～0.3mol/l；步驟4中制得的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型在無菌條件下貯存。

本發(fā)明所述的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型的制備方法，利用所述的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型的制備方法制備的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型在苜蓿種植中的應(yīng)用。

檢測本發(fā)明制備的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型的活菌數(shù)存活量方法是：本發(fā)明制備的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型傾去CaCl₂溶液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85％的無菌生理鹽水清洗顆粒三遍。稱取1g顆粒溶解到10ml濃度為0.2mol/l的檸檬酸鈉溶液里，震蕩溶解顆粒，然后采用稀釋平板法對(duì)根瘤菌計(jì)數(shù)。選取菌落數(shù)在30～300個(gè)之間的為準(zhǔn)。其中無菌生理鹽水的制備是通過稱取8.5g的NaCl溶于1000ml蒸餾水中，即為0.85％的生理鹽水。

本發(fā)明利用YMA液體培養(yǎng)基或YMA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)苜蓿根瘤菌，培養(yǎng)時(shí)間5～7天，活菌數(shù)能夠達(dá)1×10⁹個(gè)/ml以上。

本發(fā)明所述的滅菌脫脂乳為市售的脫脂乳，通過121℃高溫滅菌即為滅菌脫脂乳。

本發(fā)明所述的新型苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒，使苜蓿種植企業(yè)更加方便地添加苜蓿根瘤菌，在復(fù)配、加工、造粒和運(yùn)輸貯藏過程中不損失菌劑的活性，使種植戶更加簡便地使用苜蓿根瘤菌菌肥。突破了高耐受、高活力的苜蓿根瘤菌肥種子包被技術(shù)的主要技術(shù)瓶頸難點(diǎn)，解決苜蓿根瘤菌保護(hù)劑活力難以保持和添加使用不方便的技術(shù)難題。本發(fā)明所述的新型苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒，結(jié)瘤個(gè)數(shù)為菌液拌種的兩倍，平均株高達(dá)到7cm，菌液拌種的苜蓿平均株高只有5cm，而且包埋顆粒中的活菌數(shù)活性半年后單克所述的新型苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒中的活菌數(shù)能夠達(dá)到上萬級(jí)別。

附圖說明

圖1為本發(fā)明不同接種方式的紫花苜蓿結(jié)瘤個(gè)數(shù)對(duì)比圖；

圖2為本發(fā)明不同接種方式的紫花苜蓿株高對(duì)比圖；

圖3為本發(fā)明紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值與天數(shù)曲線。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式中紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型的制備方法是按下述步驟進(jìn)行的：

步驟1、培養(yǎng)紫花苜蓿根瘤菌：利用YMA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)苜蓿根瘤菌，至活菌數(shù)達(dá)1×10⁹個(gè)/ml以上，制成紫花苜蓿根瘤菌菌液；

步驟2、離心分離紫花苜蓿根瘤菌菌液：將步驟1制備的紫花苜蓿根瘤菌菌液分成每份10ml的菌液，進(jìn)行離心，離心分離機(jī)的轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/min,離心時(shí)間5min，首次分離后去掉分離上清液后，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液第二次添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液第三次添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，得到離心分離后的紫花苜蓿根瘤菌菌液；

步驟3、制備紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑：向步驟2制得的離心分離后的紫花苜蓿根瘤菌菌液分別加入10ml的無菌海藻酸鈉溶液，無菌海藻酸鈉溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3％、4％、5％、6％，向混合均勻后的溶液內(nèi)加入10mL滅菌脫脂乳，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笾频米匣ㄜ俎８鼍潭ɑ窬鷦?/p>

步驟4、制備紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型：將步驟3制備的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑抽入到10ml無菌注射器中，將10ml無菌注射器中的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑緩慢勻速地滴入到20ml的CaCl₂溶液中，CaCl₂溶液的濃度為0.15mol/l,滴入后制成紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒，將得到的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒在4℃下固定18h，得到紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型。

將本實(shí)施方式制備的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型進(jìn)行活菌數(shù)存活量實(shí)驗(yàn)，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示：從表1中能夠看出，隨著海藻酸鈉濃度的升高，苜蓿根瘤菌的有效活菌數(shù)逐漸降低，使用3％的海藻酸鈉進(jìn)行包埋能夠保證根瘤菌有效活菌數(shù)在較高的水平，達(dá)到1.68×109CFU/g。

表1海藻酸鈉濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響

具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式中紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型的制備方法是按下述步驟進(jìn)行的：

步驟1、培養(yǎng)紫花苜蓿根瘤菌：利用YMA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)苜蓿根瘤菌，至活菌數(shù)達(dá)1×10⁹個(gè)/ml以上，制成紫花苜蓿根瘤菌菌液；

步驟2、離心分離紫花苜蓿根瘤菌菌液：將步驟1制備的紫花苜蓿根瘤菌菌液分成每份10ml的菌液，進(jìn)行離心，離心分離機(jī)的轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/min,離心時(shí)間5min，首次分離后去掉分離上清液后，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液第二次添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液第三次添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，得到離心分離后的紫花苜蓿根瘤菌菌液；

步驟3、制備紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑：向步驟2制得的離心分離后的紫花苜蓿根瘤菌菌液加入10ml的無菌海藻酸鈉溶液，無菌海藻酸鈉溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％，向混合均勻后的溶液內(nèi)加入10ml滅菌脫脂乳，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笾频米匣ㄜ俎８鼍潭ɑ窬鷦?/p>

步驟4、制備紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型：將步驟3制備的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑分別抽入到不同型號(hào)的10ml無菌注射器中，10ml無菌注射器的型號(hào)分別為4號(hào)、6號(hào)、9號(hào)，將10ml無菌注射器中的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑緩慢勻速地滴入到20ml的CaCl₂溶液中，CaCl₂溶液的濃度為0.15mol/l,滴入后制成紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒，將得到的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒在4℃下固定18h，得到紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型。

將本實(shí)施方式制備的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型進(jìn)行活菌數(shù)存活量實(shí)驗(yàn)，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示：從表2中能夠看出，針頭的型號(hào)決定包埋顆粒大小，針頭型號(hào)越大，包埋顆粒的直徑也越大。從表2中可以看出，采用4號(hào)針頭制備包埋顆粒，其中的根瘤菌數(shù)量最高。而采用9號(hào)針頭制備包埋顆粒，其中的苜蓿根瘤菌有效活菌數(shù)最低，說明越大的包埋顆粒越不利于苜蓿根瘤菌有效活菌的保持。

表2針頭型號(hào)對(duì)細(xì)胞活性的影響

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式中紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型的制備方法是按下述步驟進(jìn)行的：

步驟1、培養(yǎng)紫花苜蓿根瘤菌：利用YMA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)苜蓿根瘤菌，至活菌數(shù)達(dá)1×10⁹個(gè)/ml以上，制成紫花苜蓿根瘤菌菌液；

步驟2、離心分離紫花苜蓿根瘤菌菌液：將步驟1制備的紫花苜蓿根瘤菌菌液分成每份10ml的菌液，進(jìn)行離心，離心分離機(jī)的轉(zhuǎn)速為5000轉(zhuǎn)/min,離心時(shí)間10min，首次分離后去掉分離上清液后，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液第二次添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液第三次添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，得到離心分離后的紫花苜蓿根瘤菌菌液；

步驟3、制備紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑：向步驟2制得的離心分離后的紫花苜蓿根瘤菌菌液加入10ml的無菌海藻酸鈉溶液，無菌海藻酸鈉溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％，向混合均勻后的溶液內(nèi)加入10ml滅菌脫脂乳，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笾频米匣ㄜ俎８鼍潭ɑ窬鷦?/p>

步驟4、制備紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型：將步驟3制備的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑抽入到不同型號(hào)的10ml無菌注射器中，將10ml無菌注射器中的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑緩慢分別勻速地滴入到20ml的CaCl₂溶液中，CaCl₂的濃度分別為0.15mol/l，0.2mol/l，0.25mol/l，0.3mol/l,滴入后制成紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒，將得到的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒在4℃下固定18h，得到紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型。

將本實(shí)施方式制備的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型進(jìn)行活菌數(shù)存活量實(shí)驗(yàn)，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示：從表3中能夠看出，在苜蓿根瘤菌包埋固定化過程中，CaCl₂溶液所起的作用主要是與海藻酸根離子螯合成不溶于水的海藻酸鈣凝膠，從而將細(xì)胞固定。而從表3數(shù)據(jù)中可見，越高濃度的CaCl₂溶液導(dǎo)致苜蓿根瘤菌活菌數(shù)降低與高CaCl₂溶液濃度的鹽高滲作用有關(guān)，致使細(xì)胞脫水死亡。因此，苜蓿根瘤菌包埋固定化過程中最適CaCl₂濃度為0.15mol/l。

表3 CaCl₂濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響

具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式中紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型的制備方法是按下述步驟進(jìn)行的：

步驟1、培養(yǎng)紫花苜蓿根瘤菌：利用YMA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)苜蓿根瘤菌，至活菌數(shù)達(dá)1×10⁹個(gè)/ml以上，制成紫花苜蓿根瘤菌菌液；

步驟2、離心分離紫花苜蓿根瘤菌菌液：將步驟1制備的紫花苜蓿根瘤菌菌液分成每份10ml的菌液，進(jìn)行離心，離心分離機(jī)的轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/min，離心時(shí)間3min，首次分離后去掉分離上清液后，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液第二次添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液第三次添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，得到離心分離后的紫花苜蓿根瘤菌菌液；

步驟3、制備紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑：向步驟2制得的離心分離后的紫花苜蓿根瘤菌菌液加入10ml的無菌海藻酸鈉溶液，無菌海藻酸鈉溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％，向混合均勻后的溶液內(nèi)分別加入5ml、10ml、20ml的滅菌脫脂乳，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笾频米匣ㄜ俎８鼍潭ɑ窬鷦?/p>

步驟4、制備紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型：將步驟3制備的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑抽入到不同型號(hào)的10ml無菌注射器中，將10ml無菌注射器中的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑緩慢分別勻速地滴入到20ml的CaCl₂溶液中，CaCl₂的濃度為0.15mol/l滴入后制成紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒，將得到的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒在4℃下固定18h，得到紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型。

將本實(shí)施方式制備的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型進(jìn)行活菌數(shù)存活量實(shí)驗(yàn)，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示：從表4中能夠看出，脫脂乳是一種保護(hù)劑，有利于微生物的增殖。但是脫脂乳的添加量與成本和顆粒形態(tài)保持有著密切的關(guān)系，通過脫脂乳比例試驗(yàn)，從表4中可見，使用10ml的脫脂乳為苜蓿根瘤菌包埋顆粒有效增殖并保持形態(tài)穩(wěn)定起到了關(guān)鍵作用。

表4脫脂乳體積對(duì)細(xì)胞活性的影響

具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式中紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型的制備方法是按下述步驟進(jìn)行的：

步驟1、培養(yǎng)紫花苜蓿根瘤菌：利用YMA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)苜蓿根瘤菌，至活菌數(shù)達(dá)1×10⁹個(gè)/ml以上，制成紫花苜蓿根瘤菌菌液；

步驟2、離心分離紫花苜蓿根瘤菌菌液：將步驟1制備的紫花苜蓿根瘤菌菌液分成每份10ml的菌液，進(jìn)行離心，離心轉(zhuǎn)速8000rpm，離心時(shí)間5min，首次分離后去掉分離上清液后，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液第二次添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，分離后的紫花苜蓿根瘤菌底液第三次添加新鮮的YMA液體培養(yǎng)基至10ml后混勻，再次離心分離，得到離心分離后的紫花苜蓿根瘤菌菌液；

步驟3、制備紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑：向步驟2制得的離心分離后的紫花苜蓿根瘤菌菌液分別加入10ml的無菌海藻酸鈉溶液，無菌海藻酸鈉溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％，向混合均勻后的溶液內(nèi)加入10mL滅菌脫脂乳，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笾频米匣ㄜ俎８鼍潭ɑ窬鷦?/p>

步驟4、制備紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型：將步驟3制備的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑抽入到10ml無菌注射器中，將10ml無菌注射器中的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋菌劑緩慢勻速地滴入到20ml濃度為0.15mol/l的CaCl₂溶液中，滴入后制成紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒，將得到的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒在4℃下固定18h，無菌條件下貯存，得到紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型。

利用本具體實(shí)施方式五制備的紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型與使用SD101菌液進(jìn)行拌種和不接種不施肥兩種情況進(jìn)行對(duì)比，

表5三種不同接種方式

苜蓿品種：敖漢。

苜蓿根瘤菌：苜蓿中華根瘤菌SD101

盆栽基質(zhì)：采用滅菌蛭石。

處理數(shù)：3個(gè)接種處理*8個(gè)平行＝24盆

接種方式：ab.使用SD101菌液進(jìn)行拌種：YMA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)SD101至活菌數(shù)在×10⁹個(gè)/ml以上。使用羧甲基纖維素鈉與菌液混合均勻，再與種子混合并晾干再進(jìn)行播種；a.播撒SD101包埋顆粒：將包埋顆粒埋在苜蓿種子附近，接種后，在種子表面再覆蓋一層無菌蛭石。

研究結(jié)果如圖1、圖2、圖3所示：

圖1為本發(fā)明不同接種方式的紫花苜蓿結(jié)瘤個(gè)數(shù)對(duì)比圖。從圖1中可以看出，接種紫花苜蓿是一種提高紫花苜蓿結(jié)瘤數(shù)的最佳方法，并且不同接種方式對(duì)紫花苜蓿結(jié)瘤數(shù)的提高程度不一。因?yàn)楦鼍ǔ６际乔秩靖珜?dǎo)致根毛卷曲內(nèi)陷形成侵染線再發(fā)展成根瘤。因此根毛的產(chǎn)生與有效根瘤菌的定殖時(shí)期有著密切的聯(lián)系。使用根瘤菌拌種，僅僅是在紫花苜蓿主根形成過程中保證苜蓿根瘤菌的有效侵染，在后期大量次生根的形成過程中就已經(jīng)徹底消亡了，對(duì)利用次根形成根瘤幾乎沒有任何作用。而包埋顆粒可以緩慢釋放有效根瘤菌，在次生根的形成過程中也能夠與次生根互相作用形成大量有效根瘤，對(duì)苜蓿植株的生長產(chǎn)生較大的貢獻(xiàn)，圖2為本發(fā)明不同接種方式的紫花苜蓿株高對(duì)比圖，從圖2中可以看出本發(fā)明大大增加了植株的生物量及株高。

圖3為本發(fā)明紫花苜蓿根瘤菌固定化包埋顆粒劑型的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值與天數(shù)曲線。在苜蓿根瘤菌包埋顆粒制作好后的第1天，第30天，第60天，第90天，第120天，第150天和第180天取樣采用稀釋平板法進(jìn)行活菌數(shù)測定，結(jié)果如圖3所示。隨著時(shí)間的推移，包埋顆粒中的活菌數(shù)逐漸下降，但是即使半年后單克顆粒中的活菌數(shù)仍能達(dá)到上萬級(jí)別，說明將苜蓿根瘤菌制成包埋固定化顆粒是一種有效促進(jìn)根瘤菌長效利用的辦法。