本發明涉及一種玉米赤霉醇完全抗原的制備方法。
背景技術：
玉米赤霉醇(Zeranol，ZER)又名“右環十四酮酚”，是玉米赤霉菌在生長過程中產生的次生代謝產物玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)的還原產物。由于ZEN在玉米、小麥、高梁等重要農作物中廣泛存在，因而玉米赤霉醇可能污染糧食、飼料，最終導致其在動物產品中殘留。另外，由于ZER可以提高牛、羊飼料的轉化率，增加牛、羊胴體瘦肉率，曾一度作為牛、羊生長促進劑，以埋植形式被廣泛使用。雖然ZER在體內大部分會被代謝掉，但仍有一部分會殘留在埋植部位。ZER及其代謝產物具有類雌激素作用，能引發動物流產、死胎、甚至不育，還具有肝毒性、免疫毒性、細胞毒性、致畸性和致癌性等[4。6j。1998年，歐盟明確禁止在畜禽養殖過程中使用ZER。中國農業部也在2002年發布的第235號公告中明確規定：禁止在所有食品動物中使用ZER，并且在動物源性食品中不得檢出。目前，ZER的檢測方法主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)，由于這2種方法本身一些限制而不能被普及，TLC只能用來做定性分析；HPLC檢測盡管比較靈敏、準確，但存在檢測儀器貴重、檢測費用高、需要專業技術人員操作等缺點。免疫分析技術是當今應用最廣的檢測方法之一，因其具有快速、靈敏、簡便、特異等優點已被廣泛應用于食品和飼料中的真菌毒素檢測凹。
目前，ZER抗體制備及檢測報道較少，且檢測靈敏度不高。免疫學檢測方法的靈敏度主要決定于抗體質量，而要獲得高靈敏度抗體，免疫原的制備是關鍵。對于小分子物質而言，由于免疫原性較弱或沒有免疫原性，直接免疫動物不能刺激動物產生抗體。
技術實現要素：
本發明提出一種玉米赤霉醇完全抗原的制備方法。
一種玉米赤霉醇完全抗原的制備方法，包括以下步驟：
（1）稱取2mgZER溶于3mL丙酮，加過量碳酸鉀10mg和1微升4-溴丁酸乙酯，在60℃
下回流24h；
（2）反應完成后，室溫下避光靜置2d，抽濾去除沉淀，旋轉蒸發干濾液，用2mLΦ=20％的NaOH-甲醇溶液80攝氏度環境下堿解1h，旋轉蒸發干溶液；
（3）用2mL雙蒸水溶解，2mol／L的硫酸調pH3．5，再用2～3mL乙酸乙酯反復萃取5次，棄去水相，用飽和食鹽水過濾1次后加無水硫酸鈉干燥，抽濾后將溶液旋轉蒸發干，收集黃色油狀物即為改造好的半抗原，稱為ZERO；
（4）稱取2mgZERO溶于1mL二氧六環，加入1．2扯L三丁胺，4℃冷卻15min后加入0．5微升氯甲酸異丁酯，4℃下繼續攪拌20min。反應結束后將混合液緩慢滴加入含6mgBSA的溶液中，加入過程在20min內完成；
（5）反應1h后用0．5mol／LNaOH溶液將pH調至8．5后繼續反應2h；
（6）反應產物用2L蒸餾水透析3d，每天換透析液6～8次。透析后所得溶液即為免疫抗原ZERBSA；
（7）取2mg改造好的ZER半抗原溶于1mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入2mgEDC和1．2mgNHS，室溫下攪拌反應2h即為A液；
（8）將3mgOVA提前1d用0．5mL的1．3g／L碳酸氫鈉溶液溶解，4℃冷藏即為B液；
（9）將A溶液緩慢滴加至B液中，室溫攪拌2h后把合成產物在0．01mol／L的PBS溶液中透析3d，每天換透析液6～8次，透析后所得溶液即為免疫抗原ZER—OVA。
優選地，所述步驟（4）6mgBSA溶解在500微升CBS和500微升二氧六環的混合溶液中。
本發明所述抗原效價高，靈敏性強，且制備方法,操作簡單，可工業化生產，實用性強。
具體實施方式
實施例1。
一種玉米赤霉醇完全抗原的制備方法，包括以下步驟：
（1）稱取2mgZER溶于3mL丙酮，加過量碳酸鉀10mg和1微升4-溴丁酸乙酯，在60℃
下回流24h；
（2）反應完成后，室溫下避光靜置2d，抽濾去除沉淀，旋轉蒸發干濾液，用2mLΦ=20％的NaOH-甲醇溶液80攝氏度環境下堿解1h，旋轉蒸發干溶液；
（3）用2mL雙蒸水溶解，2mol／L的硫酸調pH3．5，再用2～3mL乙酸乙酯反復萃取5次，棄去水相，用飽和食鹽水過濾1次后加無水硫酸鈉干燥，抽濾后將溶液旋轉蒸發干，收集黃色油狀物即為改造好的半抗原，稱為ZERO；
（4）稱取2mgZERO溶于1mL二氧六環，加入1．2扯L三丁胺，4℃冷卻15min后加入0．5微升氯甲酸異丁酯，4℃下繼續攪拌20min。反應結束后將混合液緩慢滴加入含6mgBSA的溶液中，加入過程在20min內完成；
（5）反應1h后用0．5mol／LNaOH溶液將pH調至8．5后繼續反應2h；
（6）反應產物用2L蒸餾水透析3d，每天換透析液6～8次。透析后所得溶液即為免疫抗原ZERBSA；
（7）取2mg改造好的ZER半抗原溶于1mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入2mgEDC和1．2mgNHS，室溫下攪拌反應2h即為A液；
（8）將3mgOVA提前1d用0．5mL的1．3g／L碳酸氫鈉溶液溶解，4℃冷藏即為B液；
（9）將A溶液緩慢滴加至B液中，室溫攪拌2h后把合成產物在0．01mol／L的PBS溶液中透析3d，每天換透析液6～8次，透析后所得溶液即為免疫抗原ZER—OVA。
實施例2。
一種玉米赤霉醇完全抗原的制備方法，包括以下步驟：
（1）稱取2mgZER溶于3mL丙酮，加過量碳酸鉀10mg和1微升4-溴丁酸乙酯，在60℃
下回流24h；
（2）反應完成后，室溫下避光靜置2d，抽濾去除沉淀，旋轉蒸發干濾液，用2mLΦ=20％的NaOH-甲醇溶液80攝氏度環境下堿解1h，旋轉蒸發干溶液；
（3）用2mL雙蒸水溶解，2mol／L的硫酸調pH3．5，再用2～3mL乙酸乙酯反復萃取5次，棄去水相，用飽和食鹽水過濾1次后加無水硫酸鈉干燥，抽濾后將溶液旋轉蒸發干，收集黃色油狀物即為改造好的半抗原，稱為ZERO；
（4）稱取2mgZERO溶于1mL二氧六環，加入1．2扯L三丁胺，4℃冷卻15min后加入0．5微升氯甲酸異丁酯，4℃下繼續攪拌20min。反應結束后將混合液緩慢滴加入含6mgBSA的溶液中，加入過程在20min內完成；
（5）反應1h后用0．5mol／LNaOH溶液將pH調至8．5后繼續反應2h；
（6）反應產物用2L蒸餾水透析3d，每天換透析液6～8次。透析后所得溶液即為免疫抗原ZERBSA；
（7）取2mg改造好的ZER半抗原溶于1mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入2mgEDC和1．2mgNHS，室溫下攪拌反應2h即為A液；
（8）將3mgOVA提前1d用0．5mL的1．3g／L碳酸氫鈉溶液溶解，4℃冷藏即為B液；
（9）將A溶液緩慢滴加至B液中，室溫攪拌2h后把合成產物在0．01mol／L的PBS溶液中透析3d，每天換透析液6～8次，透析后所得溶液即為免疫抗原ZER—OVA。
優選地，所述步驟（4）6mgBSA溶解在500微升CBS和500微升二氧六環的混合溶液中。