本發明屬于生物技術領域，涉及利用復雜的體系提取獲取金銀花中綠原酸粗品的方法。具體的，涉及離子液體超聲酶解提取金銀花中綠原酸的方法。
背景技術：
金銀花是忍冬科植物的花蕾，性味甘寒，具有清熱解毒、 抗菌消炎、 消癰散腫和保肝利膽之功效。金銀花在我國分布較廣，藥用歷史悠久，是國家衛生部首批頒布的既是食品又是藥品的60種中藥材之一。
金銀花中含有綠原酸、黃酮化合物和芳樟醇等活性成分，其中，綠原酸是金銀花中的主要活性成分，被國際公認為“植物黃金”。而且，綠原酸因具有抗菌消炎、保肝利膽、延緩衰老等多種作用，被廣泛應用到食品、醫藥、化妝品等行業，所以從植物中提取分離綠原酸具有重大意義。
離子液體是由無機酸根陰離子和體積較大的有機陽離子組成的液體。其具有優良的化學性質，如蒸汽壓低，在較寬的溫度范圍內熱穩定性好，可調的物理化學性質等，因為在室溫或接近室溫下呈現液態，又稱室溫離子液體，是近年來興起的一類綠色溶劑。
綠原酸的分子結構中有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚3個不穩定部分。在現有提取技術中，通常采用的提取技術手段為水提法與有機溶劑提取法。王茜等[王茜, 李智, 何琦, 等. 杜仲葉中綠原酸提取分離工藝條件的研究[J]. 離子交換與吸附, 2008, 24(1): 73-80.]將水作為提取溶劑，并對水提取條件進行了優化，結果表明，綠原酸的提取率為1.48%。肖文平等[肖文平, 李娟. 金銀花中綠原酸的提取和含量測定[J]. 安徽農業科學, 2011, 39(35): 21675-21676.]采用乙醇回流法考察影響金銀花中綠原酸提取率的因素，并優化了提取工藝參數，結果表明，綠原酸的提取率為3.81%。傳統的綠原酸提取法表現出了提取率較低的問題，另外，長時間相對較高的溫度有可能會導致綠原酸的分解，從而造成分離純化成本的增加。因此，新的提取分離方法也亟需出現，近年來新興起了各種新型的提取方法。例如，梅林等[梅林. 金銀花中綠原酸的酶法提取工藝優化[J]. 廣州化學, 2007, 32(4): 30-34.]采用酶法優化金銀花中的綠原酸的提取工藝并得出了最佳提取條件，結果顯示，綠原酸提取率為3.57%。劉亞敏等人[劉亞敏, 劉玉民, 李瓊, 等. 超聲波輔助提取山銀花綠原酸工藝及其抗氧化性研究[J]. Xu Wenjing等人[Xu W J, Zhai J W, Cui Q, et al. Ultra-turrax based ultrasound-assisted extraction of five organic acids from honeysuckle (Lonicera japonica Thunb.) and optimization of extraction process[J]. Separation and Purification Technology, 2016, 166: 73-82.]采用超聲輔助提取金銀花中的綠原酸，優化了提取提取工藝，并得出了最優參數，結果表明，綠原酸的提取率達到了5.26%。Zhang Lijin等人[Zhang L J, Liu J F, Zhang P P, et al. Ionic liquid-based ultrasound-assisted extraction of chlorogenic acid from Lonicera japonica Thunb[J]. Chromatographia, 2011, 73(1-2): 129-133.]利用親水性離子液體[BMIM][BF4]超聲提取金銀花中的綠原酸，考察了粒徑，[BMIM][BF4]濃度，pH，提取溫度，超聲功率，超聲時間等6個因素并得出最優工藝參數，結果表明：該方法下的綠原酸提取率為5.29%，較單一超聲法提高了37.9%，較乙醇回流法提高了18.8%。強極性的離子液體對天然產物具有較強的溶解和提取能力，而且很多種類的離子液體對酶具有穩定和活化作用，本發明將離子液體、酶與超聲三者結合，用于金銀花中綠原酸的提取，發展一種更加高效的提取新方法。
技術實現要素：
本發明需要解決的技術問題在于提升現有技術中金銀花提取綠原酸的提取率，降低提取的成本，降低提取過程中的污染。
為了解決該技術問題，本發明的技術方案為：
一種從金銀花中提取綠原酸的方法，其中，該方法的具體步驟為：
（1）將金銀花粉粹，加入離子液體中，混勻得到混合物；
（2）在混合物中加入乙醇、0.5-2%（占金銀花的比重）的酶，并調節混合物的pH值為3-5；
（3）超聲至提取結束；
（4）過濾獲取濾液；
（5）先減壓濃縮并回收乙醇，再用乙酸乙酯反萃取綠原酸并回收離子液體，濃縮得到綠原酸粗提物。
本發明所述的方法，其中，所述離子液體為甲基咪唑氯鹽，1-丁基-3-乙基咪唑氯鹽，1-丁基-3-乙基咪唑甲酸鹽，1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽中的一種。
本發明所述的方法，其中，所述離子液體在萃取體系中的濃度為0.1-1.5mol/L。
本發明所述的方法，其中，所述乙醇濃度為70%。
本發明所述的方法，其中，所述酶用量為金銀花干重的0.5%-2%。
本發明所述的方法，其中，所述的超聲溫度為45℃，超聲時間為30-60min，超聲功率為60-100W。
本發明所述的方法，其中，步驟（5）中，先減壓濃縮回收乙醇，再將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層之后分別回收處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮得綠原酸粗提物。
本發明所述的方法，其中，所述酶為果膠酶或者纖維素酶。
本發明所述的方法，其中，所述金銀花干重與乙醇體積的比為1:30-50。
在本發明的一個優選實施方案中：
采用離子液體超聲提取金銀花中綠原酸的方法，包括如下步驟：將金銀花粉碎成粉末放置平底燒瓶，加入料液比為1:30-1:50的體積濃度為70%的乙醇，質量濃度為0.5-2%（金銀花干重）的果膠酶或者纖維素酶，并加入離子液體，使得離子液體在最終的萃取體系中的濃度為0.1-1.5mol/L，調節體系pH為3-5；超聲溫度45℃，超聲功率為60-100 W的設備中超聲時間30min-60min，過濾提取液，濃縮回收乙醇，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層之后分別回收處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即得綠原酸粗提物。
本發明的有益效果在于
（1）本發明采用離子液體輔助超聲酶法提取金銀花中的綠原酸，提取時間較短，提取效率較已報道文獻有所提高。
（2）本發明工藝簡單、條件溫和、節能環保、溶劑可回收利用。
具體實施方式
實施例1：超聲法提取綠原酸
金銀花經粉碎機粉碎后，過篩，烘干，稱取金銀花粉末2g，在料液比為1:50，乙醇濃度為70%，體系pH為5，超聲溫度為45℃，超聲功率為180W，超聲時間為60min的條件下提取綠原酸。然后過濾，濾渣為提取后的金銀花粉末，濾液經減壓蒸餾回收乙醇后，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層后分別處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即為綠原酸粗提物，用0.45μm的微孔濾膜過濾綠原酸粗提物，在HPLC下進行檢測，結果顯示該條件下綠原酸提取率可以達到4.73%。
實施例2：果膠酶法提取綠原酸
金銀花經粉碎機粉碎后，過篩，烘干，精密稱取金銀花粉末2g，在料液比為1:50，乙醇濃度為70%，果膠酶用量為1%，體系pH為5，加熱溫度為50℃的條件下回流60min提取綠原酸。然后過濾，濾渣為提取后的金銀花粉末，濾液經減壓蒸餾回收乙醇后，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層后分別處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即為綠原酸粗提物，用0.45μm的微孔濾膜過濾后，在HPLC下進行檢測，結果顯示該條件下綠原酸提取率可以達到4.20%。
實施例3超聲-纖維素酶法提取綠原酸
金銀花經粉碎機粉碎后，過篩，烘干，精密稱取金銀花粉末2g，控制乙醇濃度為70%，超聲溫度為45℃，在料液比為1:50，纖維素酶用量為0.8%，體系pH為5，超聲功率為150W，超聲時間為50min的條件下提取綠原酸。然后過濾，濾渣為提取后的金銀花粉末，濾液經減壓蒸餾回收乙醇后，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層后分別處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即為綠原酸粗提物，用0.45μm的微孔濾膜過濾后，在HPLC下進行檢測，結果顯示該條件下綠原酸提取率可以達到5.73%。
實施例4 超聲-果膠酶酶法提取綠原酸
金銀花經粉碎機粉碎后，過篩，烘干，精密稱取金銀花粉末2g，控制乙醇濃度為70%，超聲溫度為45℃，在料液比為1:50，果膠酶用量為1.2%，體系pH為4，超聲功率為120W，超聲時間為40min的條件下提取綠原酸。然后過濾，濾渣為提取后的金銀花粉末，濾液經減壓蒸餾回收乙醇后，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層后分別處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即為綠原酸粗提物，用0.45μm的微孔濾膜過濾綠原酸粗提物，在HPLC下進行檢測，結果顯示該條件下綠原酸提取率可以達到6.01%。
實施例5 超聲-果膠酶法提取綠原酸（甲基咪唑氯鹽）
金銀花經粉碎機粉碎后，過篩，烘干，精密稱取金銀花粉末2g，控制乙醇濃度為70%，超聲溫度為45℃，在離子液體甲基咪唑氯鹽為0.6mol/L，料液比為1:40，果膠酶用量為0.5%，體系pH為4，超聲功率為90W的條件下，超聲50min。然后過濾，濾渣為提取后的金銀花粉末，濾液經減壓蒸餾回收乙醇后，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層后分別處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即為綠原酸粗提物，用0.45μm的微孔濾膜過濾綠原酸粗提物，在HPLC下進行檢測，結果顯示，該條件下綠原酸提取率可以達到6.51%。重復使用離子液體3次，綠原酸提取率均值為6.23%。
實施例6 超聲-果膠酶法提取綠原酸（1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽）
金銀花經粉碎機粉碎后，過篩，烘干，精密稱取金銀花粉末2g，控制乙醇濃度為70%，超聲溫度為45℃，在離子液體1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽為0.5mol/L，料液比為1:50，果膠酶用量為0.8%，體系pH為4，超聲功率為80W的條件下，超聲40min。然后過濾，濾渣為提取后的金銀花粉末，濾液經減壓蒸餾回收乙醇后，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層后分別處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即為綠原酸粗提物，用0.45μm的微孔濾膜過濾后，在HPLC下進行檢測，結果顯示，在該條件下，綠原酸提取率可以達到6.42%。重復使用離子液體3次，綠原酸提取率均值為6.39%。
實施例7 超聲-果膠酶法提取綠原酸（1-丁基-3-乙基咪唑甲酸鹽）
金銀花經粉碎機粉碎后，過篩，烘干，精密稱取金銀花粉末2g，控制乙醇濃度為70%，超聲溫度為45℃，在離子液體1-丁基-3-乙基咪唑甲酸鹽為0.6mol/L，料液比為1:40，果膠酶用量為0.5%，體系pH為4，超聲功率為90W的條件下，超聲40min。然后過濾，濾渣為提取后的金銀花粉末，濾液經減壓蒸餾回收乙醇后，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層后分別處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即為綠原酸粗提物，用0.45μm的微孔濾膜過濾綠原酸粗提物，在HPLC下進行檢測，結果顯示，在該條件下綠原酸提取率可以達到6.50%。重復使用離子液體3次，綠原酸提取率均值為6.48%。
實施例8 超聲-果膠酶法提取綠原酸（1-丁基-3-乙基咪唑氯鹽）
金銀花經粉碎機粉碎后，過篩，烘干，精密稱取金銀花粉末2g，控制乙醇濃度為70%，超聲溫度為45℃，在離子液體1-丁基-3-乙基咪唑氯鹽為0.9mol/L，料液比為1:30，果膠酶用量為1.0%，體系pH為4，超聲功率為70W的條件下，超聲30min。然后過濾，濾渣為提取后的金銀花粉末，濾液經減壓蒸餾回收乙醇后，將乙酸乙酯加入濾液中，待體系分層后分別處理，取下層減壓濃縮回收離子液體，取上層減壓濃縮即為綠原酸粗提物，用0.45μm的微孔濾膜過濾綠原酸粗提物，在HPLC下進行檢測，結果顯示，該條件下原酸提取率可以達到6.83%。重復使用離子液體3次，綠原酸提取率均值為6.82%。