本發明屬于微生物
技術領域：
，具體涉及一種具有抗腫瘤活性的白首烏內生菌、篩選方法及用途。
背景技術：
：傳統中藥白首烏，被歷代醫家視為養生防老的珍品。現代研究表明，白首烏具有顯著的抗腫瘤功效。然而市場上流通的藥材需通過大量采挖天然藥用植物的塊根而獲取，此舉受地理、季節和植物生長周期的限制。為保護現有野生藥物資源，我們期望能夠找到具有再生性，可持續發展，對其研究開發無“來源受限”、“采收過度”等問題的困擾的新藥用資源。白首烏內生菌與宿主長期共存，與宿主植物具有相同或相似的活性成分，是一種新穎微生物資源，在醫藥領域具有潛在的應用前景和研究價值。所以，有必要分離篩選出一種具有抗腫瘤活性的白首烏內生菌。技術實現要素：本發明的目的是提供所述具有抗腫瘤活性的白首烏內生菌，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為cgmccno.13176，保藏日期為2016年10月21日，該白首烏內生菌ycta-2-z1具有抗腫瘤活性。本發明還提供了一種具有抗腫瘤活性的白首烏內生菌ycta-2-z1的篩選方法，包括以下步驟：步驟1，取新鮮的白首烏根，自來水沖洗30min，吸水紙吸干白首烏根表面的水分，無菌水沖洗3次，每次沖洗2min，無菌濾紙吸干白首烏根表面的水分，得到干凈的根系，備用；步驟2，將干凈的根系用75％乙醇浸泡5min，然后無菌水沖洗3次，得到醇處理根系；步驟3，將醇處理根系用3g/100ml的naclo3溶液浸泡3min，無菌水沖洗5次，得到消毒根系；步驟4，將消毒根系切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊，放置于pda固體培養基上28℃培養3-7天；步驟5，當組織塊邊緣有菌絲長出后，用接種針挑取少許菌落邊緣的菌絲，劃線接入到新的pda固體培養基中，28℃培養，直至得到單一菌落；步驟6，將步驟5中挑取的單一菌落劃線接入到新的pda固體培養基中，28℃培養，直至得到單一菌落；步驟7，重復上一步驟5-6次，直至分離得到具有抗腫瘤活性的白首烏內生菌ycta-2-z1。本發明還提供了一種具有抗腫瘤活性的白首烏內生菌ycta-2-z1在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發明提供了一種具有抗腫瘤活性的白首烏內生菌ycta-2-z1對人肝癌細胞smmc-7721的增值有較好的抑制作用，對人肺癌細胞a549、人骨肉瘤細胞143b的增殖有一定抑制作用，在制備抗腫瘤藥物中具有良好的應用前景。生物材料保藏信息說明1、具有抗腫瘤活性的白首烏內生菌ycta-2-z1，已于2016年10月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13176，北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，分類命名為小不整球殼菌(plectosphaerellacucumerina)。附圖說明圖1為本發明內生菌ycta-2-z1菌落形態圖。具體實施方式下面結合附圖和具體實施方式對本發明進行詳細說明，但應當理解本發明的保護范圍并不受具體實施方式的限制。本發明以下實施例中，若沒有特殊說明，所用試劑皆可在市場上購買得到，若沒有特殊說明，所涉及的方法皆為常規方法。本發明提供了一種具有抗腫瘤活性的白首烏內生菌ycta-2-z1，所述具有抗腫瘤活性的白首烏內生菌ycta-2-z1在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為cgmccno.13176，保藏日期為2016年10月21日。基于同一種發明構思，本發明還提供了上述具有抗腫瘤活性的白首烏內生菌ycta-2-z1的篩選方法，包括以下步驟：步驟1，取新鮮的白首烏根，自來水沖洗30min，吸水紙吸干白首烏根表面的水分，無菌水沖洗3次，每次沖洗2min，無菌濾紙吸干白首烏根表面的水分，得到干凈的根系，備用；步驟2，將干凈的根系用75％(體積分數)乙醇浸泡5min，無菌水沖洗3次，得到醇處理根系；步驟3，將醇處理根系用3g/100ml的naclo3溶液浸泡3min，無菌水沖洗5次，得到消毒根系；步驟4，將消毒根系切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊，(切取的組織塊最好是存在于植物組織內部并除去暴露在外界環境的最外層組織)，放置于pda固體培養基上28℃培養3-7天；步驟5，當組織塊邊緣有菌絲長出后，用接種針挑取少許菌落邊緣的菌絲，劃線接入到新的pda固體培養基中(挑取的菌絲塊越小越好)，28℃培養，直至得到單一菌落；步驟6，將步驟5中挑取的單一菌落劃線接入到新的pda固體培養基中，28℃培養，直至得到單一菌落；步驟7，重復上一步驟5-6次，直至分離得到具有抗腫瘤活性的白首烏內生菌ycta-2-z1。需要說明的是，上述步驟4-7的任一步驟中，每升pda固體培養基中均加入150mg的青霉素和100mg的慶大霉素。下面結合相關實驗數據，說明本發明內生菌ycta-2-z1的菌落形態、基因結構特征以及其抗腫瘤活性。一、菌落形態特征將內生菌ycta-2-z1于pda培養基上培養，觀察其形態特征，結果如圖1所示，菌落較平坦，直徑4-5cm，菌落中心微凸，有絮狀緊密白絨及褶皺，菌絲呈白色，邊緣菌絲色淺。需要說明的是所述內生菌ycta-2-z1的培養條件如下：斜面培養基：pda培養基(1l)配方：馬鈴薯洗凈去皮，切成1cm×1cm×1cm小丁，稱取200g，煮沸半小時，八層紗布過濾取汁，加入20.0g葡萄糖，完全溶解后，加白首烏根的汁液200ml，最后蒸餾水定容至1000ml，再加入15-20g瓊脂，115℃滅菌20min，自然ph。其中白首烏根的汁液制備方法如下：用解剖刀將新鮮白首烏根50g，去皮，將內部的組織切成細小碎塊，置于研缽中，加入10倍體積的pbs和50-60g石英砂，研磨，靜置25-35min，取上清液，即得到白首烏根的汁液，備用。斜面培養方法：28℃培養3-7天。二、基因結構特征1、內生菌基因組dna的提取取約0.05g菌絲樣品，加入液氮后研磨致粉碎，加1ml尿素抽提緩沖液混勻后裝入2mldorf管，離心(12000rpm,5min)，取上清液，重復離心一次，取上清轉移至新dorf管中，加入等體積的酷：氯仿：異戊醇(25:24:1)混合液，用力震蕩數次，再次離心(12000rpm,5min)后轉移至新管中，加入等體積的異丙醇，-20℃放置20min以使核酸完全沉淀，然后離心(12000rpm,5min)，棄上清，倒置使管壁液體流盡，然后用70％酒精洗，室溫放置10min待酒精揮干后溶于20μl雙蒸水中，加rnase酶(10μg/μl)2μl使rna降解，37℃水浴30min，所提dna放入-20℃冰箱保存備用。2、its序列的pcr擴增及測序對所述內生菌ycta-2-z1菌株進行its序列的pcr擴增及測序，序列如下：：atacctgttgcttcggcggcgcccgcgagggtgcccgccggtctcatcagaatctctgttttcgaacccgacgatacttctgagtgttcttagcgaactgtcaaaacttttaacaacggatctcttggctccagcatcgatgaagaacgcagcgaaacgcgatatgtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacatggcgccttccagtatcctgggaggcatgcctgtccgagcgtcgtttcaaccctcgagcccccgtggcccggcgttggggatctgccacggcaggcccctaaaaccagtggcggacccgaaggccctctcctttgcgcagtagcatcagcctcgcattgggatccctcggcgtcctgcctctaaaccccccacaagtccgctccggcggcaccaaggttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaa測得的its全序列已向美國國家生物技術信息中心(ncbi)的genbank基因序列數據庫提交，登陸號為kx901797。將測得的序列于ncbi中http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi進行同源性搜索比對，并使用blastn2.2.31系統在genbank中進行同源性搜索，發現序列相似度最高的為plectosphaerellacucumerinaycta2z1菌株，序列相似度為100％，表明該菌株屬于小不整球殼菌屬。三、內生菌ycta-2-z1的抗腫瘤活性實驗：1、細胞株材料人肺癌a549細胞株，人肝癌smmc-7721，人骨肉瘤143b細胞，均購自中國科學院上海細胞生物學研究所。2、實驗方法2.1、菌株培養挑取斜面內生菌ycta-2-z1種子，接種于pda液體培養基中，用250ml錐形瓶培養，每升pda液體培養基中均加入150mg的青霉素和100mg的慶大霉素，培養液ph＝7.5，在28℃恒溫搖床(140rpm/s)培養3d，得到細胞發酵液。發酵液用正丁醇萃取，用旋轉蒸發儀于55℃蒸干萃取物，用時將萃取物分別用dmem培養基(購自南京凱基，kgm31600-500)和1640培養基(南京凱基，kgt525250)配制成濃度分別為200μg/ml、150μg/ml、100μg/ml、80μg/ml、75μg/ml、60μg/ml、50μg/ml、40μg/ml、25μg/ml、20μg/ml、10μg/ml的內生菌發酵液萃取物，備用，該利用旋轉蒸發儀于55℃蒸干得到的萃取物可以用于制備抗腫瘤藥物。2.2、細胞培養按常規方法制備對數期生長的人肺癌a549細胞，對數期生長的人肝癌smmc-7721細胞和對數期生長的人骨肉瘤143b細胞。2.3、細胞增殖抑制率的測定取對數生長期的人肺癌a549細胞、人肝癌smmc-7721細胞和人骨肉瘤143b細胞，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的dmem培養基調整細胞密度2×104個/ml，接種至96孔培養板中，每孔200μl細胞懸液，繼續培養24h后，吸棄培養液，選取其中一孔加入含0.1％dmso的dmem培養液作為人肺癌a549細胞和人骨肉瘤143b細胞的溶劑對照，選取另一孔加入含0.1％dmso的1640培養液作為人肝癌smmc-7721細胞的溶劑對照，其他孔分別加入不同濃度的內生菌發酵液萃取物，每個濃度設6個復孔，并設空白調零孔。分別繼續培養24h、48h和72h后，每孔加入20μlmtt(5g·l-1)，繼續培養4h(如果研究24h時間的影響，則培養24h后加入mtt；如果研究48h時間的影響，則培養48h后加入mtt；如果研究72h時間的影響，則培養72h后加入mtt)，吸棄上清，每孔加入150μldmso，振蕩10min，溶解結晶，用酶標免疫檢測儀測定570nm波長處的吸光度(a)，630nm為參考波長。實驗重復3次，取平均值。以溶劑處理為對照組，由吸光度計算生長抑制率，細胞生長抑制率(％)＝(a對照-a用藥)/a對照×100％。半數抑制濃度(ic50)是用probitanalysismethod計算的，通常為了得到ic50的值，我們需要做一系列的待測樣品濃度，得到這些濃度下的細胞生長抑制率，并通過spss軟件求出半數抑制濃度(ic50)。其中，計算對人肺癌a549細胞的抑制24h的ic50時，利用200μg/ml、150μg/ml、100μg/ml、75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml的內生菌發酵液萃取物檢測對細胞的生長抑制率；計算對人肺癌a549細胞抑制48h或者72h的ic50、以及計算對人肝癌smmc-7721細胞、人骨肉瘤143b細胞抑制24h、48h或者72h的ic50時，均利用200μg/ml、150μg/ml、100μg/ml、75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml的內生菌發酵液萃取物檢測對細胞的生長抑制率。3、實驗結果3.1、對三種細胞株增殖的影響將不同濃度的ycta-2-z1內生菌發酵液萃取物分別作用于人肝癌smmc-7721細胞、人肺癌a549細胞、人骨肉瘤143b細胞24h，48h和72h后，用mtt法檢測細胞的存活情況，ic50見下表。表1內生菌ycta-2-z1抑制三種細胞增殖的ic50(μgml-1,n＝3)24h48h72h人肝癌smmc-7721細胞28.82±6.5216.78±2.7112.30±4.46人肺癌a549細胞94.54±8.1278.01±6.3162.42±9.05人骨肉瘤143b細胞59.60±7.7843.52±5.6733.24±4.85實驗結論結果表明，ic50越小說明抑制作用越明顯，由表1可知，ycta-2-z1對人肝癌細胞smmc-7721的增值有較好的抑制作用，對人肺癌細胞a549、人骨肉瘤細胞143b的增殖有一定抑制作用，并且抑制率具有一定濃度、時間依賴性。盡管已描述了本發明的優選實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優選實施例以及落入本發明范圍的所有變更和修改。顯然，本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和范圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬于本發明權利要求及其等同技術的范圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。當前第1頁12