本發明屬于醫藥技術領域，特別涉及一種抗腫瘤熒光化合物、其制備方法及用途。

背景技術：

腫瘤是一種涉及到細胞生長失控的復雜疾病，已經成為當今威脅人類健康、危及生命的重大疾病之一，更成為導致死亡的主要原因之一。長期以來，腫瘤治療都是醫學界研究專注的一大課題。腫瘤通常的醫療手段是手術治療、生物治療、放射治療和化學治療，其中化學治療是多種腫瘤的主要方式。

具有生物活性的一些天然/合成類抗生素化合物，比如紫杉醇、阿霉素等，一直是主流的腫瘤治療藥物，有的已經被廣泛地使用于臨床。然而，多數抗腫瘤藥物也顯示出嚴重的副作用：它們在殺死腫瘤細胞的同時對正常細胞也有一定毒性，比如：血小板減少癥和肝毒性，長期使用還會使腫瘤細胞產生耐藥性等。因此，開發新的具有毒性低、特異性好的抗腫瘤藥物已成為當今的有機和藥物化學中的一個重要方向。

烯二炔類抗腫瘤抗生素是天然腫瘤抗生素的一類，它們具有獨特的分子結構、新穎的作用機制和高效的抗腫瘤活性，是迄今為止已經發現的活性最強的抗腫瘤物質之一，具有良好的發展前景，并已經成為化學、生物和醫藥領域重點研究對象。許多天然烯二炔腫瘤抗生素具有很高的細胞毒性，在微摩爾濃度即可誘導腫瘤細胞的凋亡，例如Calicheamicin的半數殺傷濃度在pg/μL水平，比阿霉素強1000倍以上。目前發現的烯二炔類抗生素中Neocarzinostatin已經用于臨床實踐，主要治療白血病、胃癌、胰腺癌等。這類化合物通過發生Bergman Cyclization反應可以產生雙苯基自由基，與DNA直接作用奪取DNA分子鏈上的H原子，從而導致DNA鏈的斷裂，從分子水平促使腫瘤細胞凋亡。然而這些烯二炔類抗腫瘤抗生素依然無法識別和區分正常細胞和腫瘤細胞，因此對正常細胞具有一定的毒副作用。

目前為止大部分烯二炔引發上述Bergman環化的條件，要么是比較高的溫度加熱，要么是紫外光照；即使少數烯二炔靠金屬離子或者堿性條件引發，但這些條件在人體內都較難以實現。人體在正常的代謝過程中靠酸堿平衡維持細胞或組織處在一個偏中性的生理環境中；而一旦發生癌變，腫瘤細胞可以通過異常的能量代謝為自己的生存繁殖創造一個不適于正常細胞生存的酸性微環境。如果利用腫瘤細胞內的酸性微環境，來引發烯二炔的Bergman環化反應，那么烯二炔不僅能夠對腫瘤細胞產生毒性，而且只在腫瘤細胞的酸性微環境下發生反應，而在正常細胞的偏中性環境下并不發生Bergman環化反應，這樣就可以達到烯二炔正確的區分正常細胞和腫瘤細胞的目的，選擇性的殺死腫瘤細胞而對正常細胞不造成傷害，這為設計新型高選擇性的抗腫瘤烯二炔開拓了新的思路。

專利CN201410211924.6中設計和合成了含有三乙氧基基團的烯二炔，其在酸性條件下可以造成DNA鏈斷裂并且能夠導致腫瘤細胞的凋亡。但是三乙氧基基團對酸性條件比較敏感，只要是相對的酸性條件都可以引發反應，無法保證在人體內復雜的細胞微環境下適時在腫瘤細胞內發生反應產生細胞毒性；此外，該化合物因為沒有熒光也無法進行標記示蹤。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是：克服現有技術中抗腫瘤藥物對腫瘤細胞和正常細胞不具有選擇性的缺陷，提供了一種選擇性的殺死腫瘤細胞的抗腫瘤熒光化合物。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：一種抗腫瘤熒光化合物，結構式如下所示：

本發明要解決的第二個技術問題是：克服現有技術中抗腫瘤藥物對腫瘤細胞和正常細胞不具有選擇性的缺陷的不足，提供了選擇性的殺死腫瘤細胞的抗腫瘤熒光化合物的制備方法。

本發明解決第二個技術問題所采用的技術方案是：一種抗腫瘤熒光化合物的制備方法，包括如下步驟：

將3,4-二((2-乙氧基-1,3-二氧戊環-2-基)乙炔基)-1-(呋喃-2-基甲基)-1H-吡咯-2,5-二酮溶解于溶劑中，將熒光素-5-馬來酰亞胺在氮氣氣氛下加入反應容器中，攪拌溶解后，在40～100℃下密封反應0.5～10小時得到化合物b。

優選的，所述制備方法還包括如下步驟：

將1-(呋喃-2-基甲基)-3,4-碘-1H-吡咯-2,5-二酮，碘化亞酮，POPd 1，三苯基磷和碳酸銫依次加入到反應容器中，在氮氣氣氛下加入重蒸過的四氫呋喃和甲苯，攪拌溶解后，最后加入2-乙氧基-2-乙炔基-1,3-二氧戊環；將體系在氮氣保護下40～80℃攪拌反應0.5～10小時，得到化合物a。

優選的，所述制備方法還包括如下后處理步驟：

停止反應后冷卻至室溫，用二氯甲烷和飽和氯化鈉溶液萃取洗滌，收集有機層用無水硫酸鎂干燥，過濾后將濾液真空濃縮，得到化合物b。

優選的，由a為原料制備b的反應中所述溶劑為無水DMF。

本發明要解決的第三個技術問題是：克服現有技術中抗腫瘤藥物對腫瘤細胞和正常細胞不具有選擇性的缺陷的不足，提供了選擇性的殺死腫瘤細胞的抗腫瘤熒光化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。

本發明解決第三個技術問題所采用的技術方案是：化合物b在制備抗腫瘤藥物中的應用。

本發明的有益效果是，本發明提供的抗腫瘤熒光烯二炔化合物帶有熒光基團，能夠進行熒光標記示蹤；且該化合物能夠專屬性的在腫瘤細胞的酸性條件下發生Bergman環化反應，從細胞實驗結果可以看到，實現了對腫瘤細胞和正常細胞的高度選擇性。

附圖說明

圖1—化合物b在不同pH下對DNA的鏈裂解。

圖2—化合物b在不同濃度、不同時間下對A549腫瘤細胞的細胞毒性。

圖3—化合物b在不同濃度、不同時間下對L-02正常細胞的細胞毒性。

圖4—化合物b在不同濃度下對A549腫瘤細胞和L-02正常細胞的細胞毒性對比圖。

圖5—化合物b與細胞混合后的激光共聚焦顯微鏡成像。

具體實施方式

實施例1化合物e的合成

分別稱量丁二酸(0.1g，0.87mmol)、乙二醇(2.75g，44.2mmol)和3,3,3-三乙氧基-1-丙炔(3.34g，19.4mmol)加入到反應瓶中，加熱使之回流攪拌反應3小時，停止反應后冷卻至室溫，用乙酸乙酯和飽和碳酸氫鈉溶液萃取洗滌，收集有機層用無水硫酸鎂干燥、過濾，收集濾液旋蒸，得到的產物經乙酸乙酯/石油醚＝1/10層析柱分離后得到化合物e，產物經氫譜及質譜確證。

實施例2化合物d的合成

稱量二溴馬來酸酐(3g，12mmol)加入到圓底燒瓶中，加入80ml乙酸，室溫攪拌溶解。將2-呋喃甲胺(1.37g,14mmol)逐滴加入到燒瓶中，立即有白煙產生，室溫下攪拌至白煙消失，待2-呋喃甲胺滴加完畢白煙完全消失后加入碘化鉀(3.7g，22.4mmol)，將反應瓶轉移至120℃的油浴中攪拌回流反應24小時。反應結束后冷卻至室溫，除去乙酸后用乙酸乙酯和飽和碳酸氫鈉溶液進行萃取，收集有機層用無水硫酸鎂干燥，過濾后濾液旋蒸，得到的固體用乙酸乙酯/石油醚＝1/15經柱層析后得到化合物d，產物經氫譜及質譜確證。

實施例3化合物a的合成

將1-(呋喃-2-基甲基)-3,4-碘-1H-吡咯-2,5-二酮(0.556g，1.3mmol)，碘化亞酮(100mg，40mmol％)，POPd 1(121mg，10mmol％)，三苯基磷(68mg，20mmol％)和碳酸銫(1.3g，3.99mmol)依次加入到50ml的Schlenk瓶中，抽真空換氮氣三次，在氮氣下加入重蒸過的四氫呋喃(4ml)和甲苯(10ml)，攪拌溶解后，最后加入化合物e(0.74g，5.2mmol)。在氮氣保護下60℃攪拌反應4小時后停止反應，將產物后經過柱層析分離(正己烷/乙酸乙酯＝5/1)，得到化合物a，化合物a的氫譜和質譜數據如下：

¹H NMR(CDCl₃，400MHz,ppm)：δ7.27(s,-O-CH＝,1H),6.33-6.32(d,-CH＝CH-,1H),6.30-6.29(d,-C＝CH-,1H),4.71(s,-N-CH₂-,2H),4.11-4.06(qq,-O-CH₂-,8H),3.75-3.70(q,CH₃-CH₂-,4H),1.33-1.26(t,-CH₂-CH₃,6H)。HRMS(ESI):m/z cald.For C₂₃H₂₃NO₉Na(M+Na)⁺:480.1271；found:480.1276。

實施例4化合物b的合成

在10ml的封口瓶中將化合物a(32mg,0.069mmol)溶解在5ml無水DMF中，抽真空換氮氣三次后，稱量熒光素-5-馬來酰亞胺(33mg,0.072mmol)在氮氣氣氛下加入到封口瓶中，攪拌溶解后，將封口瓶置于80℃下密封反應8小時。停止反應后冷卻至室溫，用二氯甲烷和飽和氯化鈉溶液萃取洗滌，收集有機層用無水硫酸鎂干燥，過濾后將濾液真空濃縮，得到化合物b，化合物b的氫譜和質譜數據如下：

¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz,ppm)：δ6.43-8.22(m,-Ar-H,9H),6.05(s,-CH＝CH,1H),6.17(s,-CH＝CH,1H),4.63(t,-O-CH-,1H),4.11-4.06(qq,-O-CH₂-,8H),4.02(s,-N-CH₂-,2H),3.75-3.70(q,CH₃-CH₂-,4H),2.86(d,-CH-CH-,1H),2.76(s,-CH-CH-,1H),1.33-1.26(t,-CH₂-CH₃,6H)。HRMS(ESI):m/z cald.For C₄₇H₃₆N₂O₁₆Na(M+Na)⁺:907.1963；found:907.1978。

實施例5化合物b對DNA的裂解實驗

將化合物b配成50mM/L的丙酮溶液，取2μL加入到4μL的DNA TE緩沖液中，用不同濃度的對甲苯磺酸吡啶鹽(1mM/L，10mM/L，100mM/L，1M/L)分別調節不同組別的pH分別在pH＝3、pH＝4、pH＝5和pH＝6左右。混合均勻后將不同組放在37℃下恒溫孵育48小時后，取出溶液進行瓊脂糖凝膠電泳實驗。

如圖1所示，實驗結果表明，在pH＝6和pH＝5的組別下，DNA幾乎沒有變化；在pH＝4時DNA才開始發生變化，由FormⅠ形式轉化為FormⅡ形式，說明DNA發生了鏈斷裂；在pH＝3時，DNA的形態有了更明顯的變化，有更多的FormⅡ形式產生，說明DNA分子鏈大部分發生了鏈斷裂。

實施例6化合物b的細胞毒性實驗

使用MTT方法進行細胞毒性評價：

①將處于對數生長期的A549腫瘤細胞和L-02正常細胞進行接種后放在CO₂培養箱中貼壁培養；

②將化合物b配成200mM/L的丙酮溶液，用濾膜過濾消毒后，再用細胞培養液分別稀釋至100、50、25、12.5、6.25、3.1μM/L；

③取各個濃度的化合物b溶液200μL分別加入到培養中的腫瘤細胞和正常細胞孔板中，空白組實驗加入200μL的0.1％丙酮；將孔板放在CO₂培養箱中培養24小時、48小時以及72小時；

④培養結束后使用MTT方法進行測定評價細胞活性。

實驗結果表明，加入了化合物b的腫瘤細胞，在培養了24h后，細胞出現了明顯的凋亡，隨著時間的增長到48h、72h，細胞活性明顯降低，說明抗腫瘤化合物b對腫瘤細胞表現出強烈的細胞毒性，如圖2所示。而相反，化合物b對正常細胞的毒性明顯小很多，如圖3所示。

實施例7化合物b的熒光性

使用激光共聚焦顯微鏡觀察到了化合物b進入細胞的過程，其表現出明顯的黃綠色熒光。如圖5所示。

以上述依據本發明的理想實施例為啟示，通過上述的說明內容，相關工作人員完全可以在不偏離本項發明技術思想的范圍內，進行多樣的變更以及修改。本項發明的技術性范圍并不局限于說明書上的內容，必須要根據權利要求范圍來確定其技術性范圍。