本發明涉及熊果酸衍生物、熊果酸衍生物的制備方法及其在抗腫瘤領域的用途。
背景技術：
熊果酸(ursolicacid，ua)，又名烏索酸、烏蘇酸，屬五環三萜類化合物，化學名3(β)-3-hydroxyurs-12-en-28-oicacid，其相對分子量為456.68，分子式為c30h48o3，是一種廣泛分布于植物資源中的活性化合物。藥理學研究表明，ua具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗骨質疏松、抗氧化、抗炎、治療糖尿病和保肝等多種功效。ua水溶性差，缺乏靶標特異性，限制了其臨床應用。
熊果酸的化學結構：
ua具有廣譜的抗癌活性，研究表明，ua發揮抗腫瘤作用的機制包括：誘導腫瘤細胞凋亡和分化，抑制侵襲、擴增和血管生成，促進化療曾敏作用，誘導細胞周期阻滯和自噬等。文獻：(cn102558279b)、(孟艷秋等，齊墩果酸衍生物的合成及抗腫瘤活性的研究，藥學學報2011,46(10):1215-1220)和(ming-chuanliuetal,synthesisandcytotoxicityofnovelursolicacidderivativescontaininganacylpiperazinemoiety,eurjmedchem,2012,(58),128-135)報道了熊果酸或齊墩果酸與1,2-二溴乙烷或1,3-二溴丙烷反應生成溴代乙醇酯或丙醇酯衍生物，再與伯胺或腫胺經sn2反應得到一系列衍生物。1,2-二溴乙烷或1,3-二溴丙烷與ua的28-cooh反應時缺乏選擇性，會生成大量副產物，得到的溴代乙醇酯或溴代丙醇酯衍生物與伯胺或仲胺反應時，收率較低。孟艷秋等報道的文獻中，齊墩果酸溴代乙醇酯衍生物與仲胺反應收率均低于10％。
技術實現要素：
本發明目的在于，以熊果酸為先導化合物，設計合成出一系列具有更好抗腫瘤活性的新型熊果酸衍生物。
本發明以熊果酸得到的新化合物，其結構通式為ⅰ、ⅱ所示：
其中r1、r2和r3如表1、表2所示：
表1通式ⅰ所代表的化合物ⅰ-1～ⅰ-22
表2通式ⅱ所代表的化合物ⅱ-1～ⅱ-8
本發明的另一目的在于，提供通式為ⅰ、ⅱ的熊果酸衍生物的制備方法。本發明的反應流程是通過下列步驟完成的，其中，阿拉伯數字2～24代表反應的化合物，如2即為化合物2，代表3-乙酰氧基熊果酸，9代表3-氧代熊果酸，17代表2,3-二肟熊果酸，化合物2～24在下文中不再贅述解釋。
(1)熊果酸與乙酸酐反應得到3-乙酰氧基熊果酸(2)，化合物2分別與2-氯乙醇、3-氯-1-丙醇、4-氯-1-丁醇反應得到相應的化合物3～5；化合物3～5分別與甲基磺酰氯反應得到相應磺酸酯衍生物6～8；化合物6～8分別與哌嗪反應得到相應化合物ⅰ-1～ⅰ-3；化合物6～8分別與高哌嗪反應得到相應化合物ⅰ-4～ⅰ-6；
(2)化合物ⅰ-1分別與溴芐、4-氟溴芐反應得到化合物ⅰ-7和ⅰ-8；
(3)熊果酸與氯鉻酸吡啶鹽(pcc)反應得到3-氧代熊果酸(9)，化合物9分別與2-氯乙醇、3-氯-1-丙醇、4-氯-1-丁醇反應得到相應化合物10～12；化合物10～12分別與甲基磺酰氯反應得到相應磺酸酯衍生物13～15；化合物13～15分別與哌嗪反應得到相應化合物ⅰ-9～ⅰ-11；化合物13～15分別與高哌嗪反應得到相應化合物ⅰ-12～ⅰ-14；
(4)化合物ⅰ-9分別與溴芐和4-氟溴芐反應得到化合物ⅰ-15和ⅰ-16；
(5)化合物ⅰ-3、ⅰ-4、ⅰ-5、ⅰ-6、ⅰ-7、ⅰ-8經堿性條件水解后得到相應化合物ⅰ-17、ⅰ-18、ⅰ-19、ⅰ-20、ⅰ-21、ⅰ-22；
(6)分別將化合物ⅰ-9～ⅰ-14、ⅰ-17～ⅰ-20的粗品溶解在無水乙醇中，用濃鹽酸調節ph≤3制備成相應產物的鹽酸鹽，抽濾，濾餅經蒸餾水洗滌過濾后，再用乙醇或乙酸乙酯超聲浸漬洗滌1～3遍，抽濾即可得到相應產物的鹽酸鹽純品，將產物的鹽酸鹽分散在無水乙醇中，加堿調節至ph≥7，減壓濃縮，經萃取、干燥即可得到ⅰ-9～ⅰ-14、ⅰ-17～ⅰ-20純品；
(7)3-氧代熊果酸(9)與亞硝酸異戊酯反應得到2-肟-3-氧代熊果酸(16)，化合物16與鹽酸羥胺反應生成2,3-二肟熊果酸(17)，化合物17在乙醇中與氫氧化鈉和次氯酸鈉反應得到化合物18；化合物18分別與2-氯乙醇、3-氯-1-丙醇、4-氯-1-丁醇反應得到相應化合物19～21；化合物19～21分別與甲基磺酰氯反應得到相應磺酸酯衍生物22～24；化合物22～24分別與哌嗪反應得到相應化合物ⅱ-1～ⅱ-3；化合物22～24分別與高哌嗪反應得到相應化合物ⅱ-4～ⅱ-6；化合物ⅱ-1分別與溴芐和4-氟溴芐反應得到化合物ⅱ-7和ⅱ-8。
其中化合物3～15為合成通式ⅰ系列目標化合物過程的中間產物，如下所示，
其中，它們的相關基團r1、r2如表3所示：
表3通式ⅰ代表的中間體3～15
其中化合物16、17為通式ⅱ系列化合物合成過程中的中間產物，結構如下所示：
其中化合物18～24為通式ⅱ系列目標化合物合成過程中的中間產物，如下所示：
表4通式ⅱ代表的中間體18～24
本發明的再一目的在于，提供通式為ⅰ、ⅱ的熊果酸衍生物的用途。通式為ⅰ、ⅱ的熊果酸衍生物用于制備抗腫瘤藥物的用途；進一步優選，通式為ⅰ、ⅱ的熊果酸衍生物用于hela和mnk45腫瘤細胞的抑制用途。
本發明的優點在于通式i、ⅱ的一系列熊果酸新衍生物，藥理學實驗表明相比現有技術，它們對hela細胞和mnk45細胞具有更顯著的抗增殖能力，同時具有更高的收率，尤其重要的是本發明的熊果酸新衍生物水溶性好，適于臨床應用。
具體實施方式
按照上述內容，在不脫離本發明上述基本技術思想的前提下，根據本領域的普通技術知識和慣用手段，對其內容還可以有多種形式的修改、替換或變更。下面通過具體實施例，對本發明的實施內容再進一步詳細說明，但它們不是對本發明的限定。凡是基于本發明上述內容實現的技術均屬于本發明的范圍。
下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
實施例1
化合物ⅰ-1的合成：
于50ml茄形瓶中加入ua(2.0g,4.38mmol)，溶解于15ml吡啶中，控溫0℃～10℃，緩慢滴加乙酸酐(1.0ml,10.58mmol)，滴加完畢后室溫攪拌反應14h，tlc(環己烷/丙酮＝3:1)檢測顯示反應完全。將反應液倒入60ml冰水中，有固體析出，抽濾，濾餅以100ml乙酸乙酯溶解，并依此用1mol/l鹽酸、蒸餾水、飽和氯化鈉水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥過夜，減壓濃縮，真空干燥得3-乙酰氧基-ua(2)2.02g，收率92.5％。
于50ml茄形瓶中加入化合物2(1.16g,2.33mmol)，以15mldmf溶解，加入2-氯乙醇(0.58g,7.20mmol)，碳酸鉀(0.49g,3.55mmol)，60℃油浴中攪拌反應1h，tlc(環己烷/丙酮＝3:1)檢測顯示原料完全消失，停止反應。將反應液倒入50ml冰水中，有大量白色固體析出，抽濾，濾餅以100ml乙酸乙酯溶解，依此用蒸餾水、飽和氯化鈉水溶液洗滌(兩遍)，無水硫酸鈉干燥過夜，減壓濃縮、真空干燥得1.20g產物(3)，收率94.8％。
于50ml茄形瓶中加入化合物3(1.2g,2.21mmol)，以10ml吡啶溶解，控溫0～10℃，緩慢滴加甲基磺酰氯(0.52ml,6.72mmol)，室溫攪拌反應100min，tlc(環己烷/丙酮＝3:1)檢測顯示反應完全。將反應液倒入50ml冰水中，抽濾，濾餅以80ml乙酸乙酯溶解，并依次用1mol/l鹽酸、蒸餾水、飽和氯化鈉水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥過夜，減壓濃縮、真空干燥得1.28g產物(6)，收率98.3％。
于50ml茄形瓶中加入化合物6(0.5g,0.806mmol)，以8mldmf溶解，加入無水哌嗪(0.6g,6.97mmol)，無水碳酸鉀(0.16g,1.16mmol)80℃油浴中反應30min，tlc(環己烷/丙酮＝3:1或二氯甲烷/甲醇＝10:1)檢測顯示反應完全。將反應液倒入40ml冰水中，有白色固體析出，抽濾，濾餅用100ml乙酸乙酯溶解，并依次用蒸餾水、飽和氯化鈉水溶液洗滌(兩遍)，無水硫酸鈉干燥，硅膠柱層析純化，氯仿洗脫，得0.41g化合物ⅰ-1，為白色粉末，收率83.3％。mp:80.1-82.9℃。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.21(1h,s,h-12),4.52–4.44(1h,m,h-3),4.16–4.04(2h,m,ch2),3.10(4h,s,hinpiperazine),2.72(4h,s,hinpiperazine),2.63(2h,t,j＝5.6hz,ch2),2.18(1h,d,j＝12.5hz,h-18),2.04(3h,s,ch3),1.06(3h,s,ch3),0.93(6h,d,j＝5.8hz,2×ch3),0.85(9h,d,j＝4.9hz,3×ch3),),0.72(3h,s,ch3)。
hr-ms:calcdforc38h63n2o4[m+h]+611.47823；found611.47836。
實施例2
化合物ⅰ-4的合成：
參照實施例1中化合物ⅰ-1的合成方法，但是以高哌嗪替代無水哌嗪，得黃白色粉末，總收率70.2％。mp:76.5-78.0℃。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.22(1h,s,h-12),4.53–4.44(1h,m,h-3),4.16(2h,s,ch2),3.38(4h,s,hinhomopiperazine),3.20(2h,s,ch2),2.97(4h,d,j＝24.4hz,hinhomopiperazine),2.04(3h,s,ch3),1.06(3h,s,ch3),0.94(6h,d,j＝3.8hz,2×ch3),0.85(9h,d,j＝4.6hz,3×ch3),0.72(3h,s,ch3)。
hr-ms:calcdforc39h65n2o4[m+h]+625.49388；found625.49126。
實施例3
化合物ⅰ-8的合成：
于10ml雞心瓶中加入化合物ⅰ-1(60mg,0.098mmol)，以2mldmf溶解，加入碳酸鉀(17mg,0.123mmol)，4-氟溴芐(0.02ml,0.161mmol)，60℃油浴中反應30min，tlc(二氯甲烷/甲醇＝20:1)檢測顯示反應完全。自然冷卻后以50ml乙酸乙酯、30ml水萃取，有機相用飽和氯化鈉水溶液洗滌兩遍，無水硫酸鈉干燥，制備薄層板純化(二氯甲烷/甲醇＝20:1)，得產物29.8mg(ⅰ-8)，為黃白色粉末，收率42.3％，mp:140.0-141.8℃。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.76–7.58(2h,m,arh),7.12(2h,t,j＝8.2hz,arh),5.16(1h,s,h-12),4.51–4.43(1h,m,h-3),4.08(2h,s,ch2),2.73–3.90(10h,m,ch2and4×ch2inpiperazine),2.09(1h,d,j＝11.3hz,h-18),2.04(3h,s,ch3),1.04(3h,d,j＝7.4hz,ch3),0.92(6h,d,j＝10.4hz,2×ch3),0.88–0.81(9h,m,3×ch3),0.65(3h,d,j＝13.5hz,ch3)。
hr-ms:calcdforc45h68fn2o4[m+h]+719.51576；found719.51562。
實施例4
化合物ⅰ-9的合成：
于500ml茄形瓶中加入ua(10.0g,21.9mmol)，以300ml二氧六環溶解，加入pcc(11.8g,54.7mmol)室溫攪拌，反應5h后tlc(石油醚：乙酸乙酯＝1:2v/v)顯示原料消失，停止反應。加入含亞硫酸鈉(4.2g,33.3mmol)的水溶液35ml，攪拌1h反應體系變為墨綠色，將其倒入500ml冰水中，有固體析出，抽濾，濾餅以乙酸乙酯溶解，并依次用蒸餾水、飽和氯化鈉水溶液洗滌有機相，有機相用無水硫酸鈉干燥過夜，過濾，減壓濃縮，硅膠柱層析純化(石油醚(60-90℃)：乙酸乙酯＝3:1)，得白色粉末3-氧代熊果酸(化合物9)8.06g，收率81.0％。以化合物9為原料，參照化合物ⅰ-1的合成方法獲得化合物ⅰ-9，為白色粉末，總收率56.0％，mp:144.4-146.8℃。
1hnmr(400mhz,cdcl3)：δ5.24(1h,s,h-12),4.18–4.04(2h,m,ch2),3.19(4h,s,hinpiperazine),2.81(4h,s,hinpiperazine),2.65(2h,t,j＝5.4hz,ch2),2.59–2.47(1h,m,h-2),2.37(1h,d,j＝18.9hz,h-2),2.23–2.14(1h,m,h-18),1.08(6h,s,2×ch3),1.03(6h,s,2×ch3),0.94(3h,d,j＝5.5hz,ch3),0.85(3h,d,j＝6.3hz,ch3),0.77(3h,s,ch3)。
13cnmr(101mhz,cdcl3)δ218.04,177.42,138.33,125.48,61.20,56.39,55.33,53.06,49.91,48.20,47.52,46.82,43.72,42.27,39.60,39.38,39.15,38.95,36.83,36.77,34.29,32.65,30.70,28.06,26.67,24.30,23.56,21.62,21.24,19.69,17.23,17.13,15.36。
hr-ms:calcdforc36h59n2o3[m+h]+567.45202；found567.44977。
實施例5
化合物ⅰ-17的合成：
于100ml茄形瓶中，加入化合物ⅰ-3粗品1.5g，溶解于42ml甲醇/水(v/v＝5:1)中，加入氫氧化鈉(0.39g,9.75mmol)，30℃攪拌反應8h，tlc(二氯甲烷/甲醇＝10:1)檢測顯示原料完全消失。減壓濃縮，加入150ml無水乙醇溶解，滴加濃鹽酸并攪拌至ph≤3，有大量白色固體析出，抽濾，并用200ml蒸餾水沖洗，得白色濾餅。濾餅用100ml無水乙醇超聲浸漬洗滌后抽濾(3遍)，可得到白色粉末(化合物ⅰ-17的鹽酸鹽純品)，將其置于250ml茄形瓶中，加入150ml乙醇，超聲分散，滴加飽和氫氧化鈉溶液，并攪拌，至反應體系由渾濁變澄清透明，減壓濃縮，加入150ml乙酸乙酯，并依次用蒸餾水(兩遍)、飽和氯化鈉水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥過夜，減壓濃縮、真空干燥得白色粉末(ⅰ-17)1.0g，總收率約56％，mp:100.0-102.5℃。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.21(1h,s,h-12),4.06–3.91(2h,m,ch2),3.21(5h,m,h-3and4hinpiperazine),2.70(4h,s,hinpiperazine),2.41(2h,t,j＝7.0hz,ch2),2.20(1h,d,j＝11.2hz,h-18),1.07(3h,s,ch3),0.98(3h,sch3),0.93(3h,d,j＝5.8hz,ch3),0.90(3h,s,ch3),0.84(3h,d,j＝6.4hz,ch3),0.77(3h,s,ch3),0.73(3h,s,ch3)。
13cnmr(101mhz,cdcl3)δ177.08,137.70,125.01,78.49,63.27,56.99,54.68,52.38,49.31,47.56,47.00,43.16,41.55,39.02,38.55,38.37,38.24,38.10,36.45,36.26,32.55,30.15,27.65,27.47,26.70,25.81,23.72,23.04,22.79,22.66,20.69,17.80,16.63,16.54,15.17,14.99。
hr-ms:calcdforc38h65n2o3[m+h]+597.49897；found597.49693。
實施例6
化合物ⅰ-18的合成：
參照化合物ⅰ-17的合成方法，以ⅰ-4替代ⅰ-3，得黃白色粉末，總收率58.7％，mp:189.2-192.0℃。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.22(1h,s,h-12),4.14–4.02(2h,m,ch2),3.27–2.78(9h,h-3and4×ch2inhomopiperazine),2.18(1h,d,j＝12.5hz,h-18),1.07(3h,s,ch3),0.98(3h,s,ch3),0.93(3h,d,j＝5.7hz,ch3),0.91(3h,s,ch3),0.84(3h,d,j＝6.4hz,ch3),0.77(3h,s),0.73(3h,s)。
hr-ms:calcdforc37h63n2o3[m+h]+583.48332；found583.48116。
實施例7
化合物ⅱ-1的合成：
于50ml茄形瓶中加入化合物9(1.0g,2.2mmol)，以20ml叔丁醇溶解，加入叔丁醇鉀(1.23g,10.98mmol)、亞硝酸異戊酯(1.24g,10.58mmol)，室溫攪拌2.5h，tlc(環己烷/丙酮＝3:1)檢測，顯示原料完全消失。減壓濃縮，加入100ml乙酸乙酯溶解，有機相用飽和氯化鈉水溶液洗滌兩遍，無水硫酸鈉干燥過夜，過濾，減壓濃縮，硅膠柱層析純化(石油醚(60-90℃)：乙酸乙酯＝5:1)，得2-肟-3-氧代熊果酸(16)970mg，收率75.0％。
于25ml茄形瓶中加入化合物16(550mg,1.14mmol)，以6ml吡啶溶解，加入鹽酸羥胺(237mg,3.4mmol)，110℃反應2h。將反應液倒入50ml冰水中，有淡粉紅色固體析出，抽濾，濾餅用100ml乙酸乙酯溶解，并依次用1mol/l鹽酸、蒸餾水、飽和氯化鈉水溶液洗滌有機相，有機相用無水硫酸鈉干燥過夜，過濾，減壓濃縮、真空干燥得2,3-二肟熊果酸(17)550mg，為淡粉紅色粉末，收率96.8％。于100ml茄形瓶中加入化合物17(550mg,1.14mmol)，以40ml無水乙醇溶解，加入氫氧化鈉(120mg,3mmol)，滴加次氯酸鈉溶液2ml，室溫攪拌2min，tlc(環己烷/丙酮＝2.5:1)檢測顯示反應完全。減壓濃縮，殘余物用適量乙酸乙酯溶解，并依次用蒸餾水、飽和氯化鈉水溶液洗滌(兩遍)，無水硫酸鈉干燥過夜，過濾，濾液45℃下減壓濃縮，經真空干燥得白色粉末502mg(化合物18)，收率88.7％，以化合物18為原料，參照化合物ⅰ-1的合成方法獲得ⅱ-1，硅膠柱層析純化(二氯甲烷/甲醇＝15:1)得白色粉末，總收率49.2％。mp:134.1-136.8℃。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.29(1h,s,h-12),4.12(2h,t,j＝5.7hz,ch2),3.07(4h,d,j＝23.0hz,hinpiperazine),2.64(4h,d,j＝4.1hz,hinpiperazine),2.62(2h,d,j＝5.8hz,ch2),2.24(1h,d,j＝11.1hz,h-18),1.41(3h,s,ch3),1.33(3h,s,ch3),1.09(3h,s,ch3),0.94(3h,d,j＝5.7hz,ch3),0.91(3h,s,ch3),0.86(3h,d,j＝6.3hz,ch3),0.79(3h,s,ch3)。
hr-ms:calcdforc36h57o4n4[m+h+]609.43743；found609.43526。
實施例8
合成的熊果酸新衍生物的抗腫瘤活性
37℃、5％co2條件下常規培養hela和mnk45腫瘤細胞，用0.25％胰酶消化后，配制成一定濃度的單細胞懸液。根據細胞生長速度的差異，按4000個/孔接種于96孔板，每孔加入細胞懸液100μl。24h后，加入濃度為10μm的化合物和cisplatin及相應溶劑對照的完全培養基。每孔加100μl(dmso終濃度＜0.1％)，每組設3個平行孔，于37℃繼續培養72h后，棄上清。每孔加入100μl含0.5mg/mlmtt的完全培養基，繼續培養4h，棄上清后，每孔加入150μldmso溶解mtt甲瓚沉淀，微型振蕩器振蕩混勻后，酶標儀在參考波長450nm，檢測波長570nm條件下測定光密度值(od)，以溶劑對照處理的腫瘤細胞為對照組，用以下公式計算每種化合物作用下不同腫瘤細胞的抑制率。
取對數生長期的腫瘤細胞，用0.25％胰酶消化后，配制成一定濃度的單細胞懸液。根據細胞生長速度的差異，按4000個/孔接種于96孔板，每孔加入細胞懸液100μl。24h后，加入含不同濃度化合物及相應溶劑對照的完全培養基，每孔加100μl(dmso終濃度＜0.1％)，每種受試化合物設8個劑量組，每組設3個平行孔，于37℃繼續培養72h后，棄上清。每孔加入100μl含0.5mg/mlmtt的完全培養基，繼續培養4h，棄上清后，每孔加入150μldmso溶解mtt甲瓚沉淀，微型振蕩器振蕩混勻后，酶標儀在參考波長450nm，檢測波長570nm條件下測定光密度值(od)。以溶劑對照處理的腫瘤細胞為對照組，計算出不同濃度所對應的抑制率后，利用統計分析軟件graphpadprism6繪制細胞生長抑制率曲線，通過曲線擬合得到函數計算抑制率在50％時對應的化合物濃度即為其對該腫瘤細胞的半數抑制濃度(ic50)。相同條件下測定化合物對不同細胞的ic50值，每個細胞株重復三次取平均值。抗腫瘤活性結果見表5
表5熊果酸及其結構修飾物對hela和mnk45腫瘤細胞的抑制活性
表5中，a:化合物濃度為10μm時測得的抑制率；b:化合物的半數有效濃度；c:化合物的半數有效濃度大于10μm；d:順鉑為陽性對照藥。