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一種生產低聚木糖和抗菌肽的益生飼用釀酒酵母的制作方法

文檔序號:11145401閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種能生產低聚木糖和抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體,其特征在于:該載體中含有β-1,4-內切木聚糖酶基因、β-1,4-木糖苷酶基因、抗菌肽基因;

所述β-1,4-內切木聚糖酶基因的堿基序列如SEQ ID NO:1所示;

所述β-1,4-木糖苷酶基因的堿基序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根據權利要求1所述的一種能生產低聚木糖和抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體,其特征在于:所述抗菌肽基因選自東方鈴蟾抗菌肽BLP-2突變體BLP-2-T、異色瓢蟲抗菌肽Haxy-Col1突變體Haxy-Col1-T、鯰魚抗菌肽突變體、脆皮蛙抗菌肽突變體Lf-cath-T;

所述東方鈴蟾抗菌肽BLP-2突變體BLP-2-T的堿基序列如SEQ ID NO:3所示;

所述異色瓢蟲抗菌肽Haxy-Col1突變體Haxy-Col1-T的堿基序列如SEQ ID NO:4所示;

所述鯰魚抗菌肽突變體的堿基序列如SEQ ID NO:5所示;

所述脆皮蛙抗菌肽突變體Lf-cath-T的堿基序列如SEQ ID NO:6所示。

3.根據權利要求1所述的一種能生產低聚木糖和抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體,其特征在于:所述抗菌肽基因上游存在α-信號肽基因序列,α-信號肽基因的堿基序列如SEQ ID NO:7所示。

4.根據權利要求1所述的一種能生產低聚木糖和抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體,其特征在于:所述β-1,4-內切木聚糖酶基因的啟動子為pgk1-1,其堿基序列如SEQ ID NO:8所示,終止子為pgkt1-1,其堿基序列如SEQ ID NO:9所示;

所述β-1,4-木糖苷酶基因的啟動子為pgk1-2,其堿基序列如SEQ ID NO:10所示,終止子為pgkt1-2,其堿基序列如SEQ ID NO:11所示;

所述抗菌肽基因的啟動子為pgk1-3,其堿基序列如SEQ ID NO:12所示,終止子為pgkt1-3,其堿基序列如SEQ ID NO:13所示。

5.根據權利要求1所述的一種能生產低聚木糖和抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體,其特征在于:該載體的篩選基因中含有G418抗性基因。

6.根據權利要求1所述的一種能生產低聚木糖和抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體,其特征在于:所述載體的骨架為pGAPZaA質粒。

7.根據權利要求1所述的一種能生產低聚木糖和抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體,其特征在于:該載體中含有釀酒酵母菌的25s rDNA基因片段,其堿基序列如SEQ ID NO:15所示。

8.一種能生產低聚木糖和抗菌肽的釀酒酵母,其特征在于,該重組釀酒酵母基因組中插入有權利要求1~7任一所述的多基因共表達載體。

9.權利要求1~6任一所述一種能生產低聚木糖和抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達載體的構建方法,其特征在于:包括以下步驟:

S1 整合表達載體pTEGC-BsmBI構建:

S1.1 將G418抗性基因連入pGAPZaA質粒載體的多克隆位點Msc I和EcoR V之間,獲得載體pGAPZaA-G418;

S1.2 將堿基序列如SEQ ID NO:15所示的rDNA基因序列的連入載體pGAPZaA-G418多克隆位點BamHI和EcoRI之間,獲得載體pGAPZaA-G418-rDNA;

S1.3 將載體pGAPZaA-G418-rDNA經Bgl II和EcoRI雙酶切后,回收大片段產物,得到線性化載體pTEGC,將堿基序列如SEQ ID NO:16所示的BsmBI-2片段與線性化載體pTEGC連接,得整合表達載體pTEGC-BsmBI;

S2 啟動子、終止子的擴增

S2.1啟動子的擴增:以釀酒酵母基因組DNA為模板,分別用引物對PGK1F1-BsmBI和PGK1R1-BsmBI、PGK1F2-BsmBI和PGK1R2-BsmBI、PGK1F3-BsmBI和PGK1R3-BsmBI分別擴增出pgk1-1、pgk1-2、pgk1-3啟動子片段;

S2.2終止子的擴增:以釀酒酵母基因組DNA為模板,分別用引物對PGKT1F1-BsmBI和PGKT1R1-BsmBI、PGKT1F2-BsmBI和PGKT1R2-BsmBI、PGKT1F3-BsmBI和PGKT1R3-BsmBI分別擴增出pgkt1-1、pgkt1-2、pgkt1-3終止子片段;

S3 α-信號肽基因、α-淀粉酶基因、糖化酶基因、抗菌肽基因的獲得

S3.1 含BsmBI酶切位點的β-1,4-內切木聚糖酶基因的獲得:以含β-1,4-內切木聚糖酶基因序列的T載體為模板,通過引物xynF-BsmBI以及xynR-BsmBI進行擴增,得xynA1基因片段,即含有β-1,4-內切木聚糖酶基因的片段;

S3.2含BsmBI酶切位點的β-1,4-木糖苷酶基因的獲得:以含β-1,4-木糖苷酶基因序列的T載體為模板,通過引物xylF-BsmBI以及xylR-BsmBI進行擴增,得xyl-1基因片段,即含有β-1,4-木糖苷酶基因的片段;

S3.3 α-信號肽-抗菌肽基因的獲得:分別以含α-信號肽基因序列的T載體、含抗菌肽的T載體為模板,通過重疊延伸PCR將α-信號肽序列定向連入無信號肽的抗菌肽基因的5’端,擴增出mfa-amp基因片段,即含有α-信號肽基因序列和抗菌肽基因序列的片段;所述重疊延伸PCR過程中,通過引物將擴增產物mfa-amp的兩端引入切割方向相反的BsmBI的切割序列;

S4 釀酒酵母多基因共表達載體的構建

將上述獲得的β-1,4-內切木聚糖酶基因表達盒元件pgk1-1、xynA1、pgkt1-1;β-1,4-木糖苷酶基因表達盒元件pgk1-2、xyl-1、pgkt1-2;抗菌肽基因表達盒元件pgk1-3、mfa-amp、pgkt1-3利用IIs型限制性內切酶BsmBI進行酶切,純化回收;同時,利用IIs型限制性內切酶BsmBI切割上述整合表達載體pTEGC-BsmBI,將其線性化;將所用這些片段通過一步法定向連入線性化的整合表達載體pTEGC-BsmBI中,即得釀酒酵母多基因共表達載體;

上述所述引物的堿基序列如下:

PGK1F1-BsmBI:CGTCTCAgatc GAAGTACCTTCAAAG

PGK1R1-BsmBI:CGTCTCGgctaTATATTTGTTGTAAA

PGK1F2-BsmBI:CGTCTCAgtcaGAAGTACCTTCAAAG

PGK1R2-BsmBI:CGTCTCGgcatTATATTTGTTGTAAA

PGK1F3-BsmBI:CGTCTCAtgcaGAAGTACCTTCAAAG

PGK1R3-BsmBI:CGTCTCGtcgaTATATTTGTTGTAAA

PGKT1F1-BsmBI:CGTCTCAtgtacGATCTCCCATCGTCTCTACT

PGKT1R1-BsmBI:CGTCTCGgtcaAAGCTTTTTCGAAACGCAG

PGKT1F2-BsmBI:CGTCTCAtacgGATCTCCCATCGTCTCTACT

PGKT1R2-BsmBI:CGTCTCGtgcaAAGCTTTTTCGAAACGCAG

PGKT1F3-BsmBI:CGTCTCAatcgGATCTCCCATCGTCTCTACT

PGKT1R3-BsmBI:CGTCTCGagtcAAGCTTTTTCGAAACGCAG

xynF-BsmBI :CGTCTCAgcta ATGAAGGTTACTGCTGCT

xynR-BsmBI:CGTCTCAgtac TTAAGAAGAGATAGTAACA

xylF-BsmBI:CGTCTCAgcatATGCCAGGTGCTGCTTCTATCGTTGCT

xylR-BsmBI:CGTCTCAtacg TTATTGTGGAGCGATCAATTGTTCT。

10.一種能生產低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母的構建方法,其特征在于,將權利要求9構建的釀酒酵母多基因共表達載體轉化釀酒酵母宿主,篩選出陽性單克隆菌落,并測序驗證正確,即得能生產低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母。

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