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一種嗜溫高溫放線菌及用途的制作方法

文檔序號:12248553閱讀:1487來源:國知局

本發明屬于生物技術領域,具體來說涉及嗜溫高溫放線菌,同時還涉及該嗜溫高溫放線菌在產土味素類物質中的用途。



背景技術:

大曲是釀酒用的一種糖化劑和發酵劑,大曲的制作具有生料制作、開放制作、機械化程度低和操作簡單四個特點,開放式制曲最大限度網羅了環境中的微生物,以增加大曲培養過程中微生物的總量;其培養具有自然培養、堆積升溫、季節性強、易培養、周期長、菌酶共存等特點。

目前申請人采用第二代高通量測序的方法對貴州省白酒企業的醬香大曲的微生物多樣性進行了分析,采用免培養的方法分析發現高溫放線菌屬的相對含量占大曲中原核微生物的34.30%,高于芽孢桿菌屬(Bacillus sp.),目前其分類地位屬于細菌域( Domain Bacteria),厚壁菌門( Phylum Firmicutes),芽孢桿菌綱( Class Bacilli) ,芽孢桿菌目(Order Bacillales),高溫放線菌科( Thermoactinomycetaceae)。貴州的醬香型白酒是典型的高溫固態發酵體系,發酵工藝有三高的特點。長期以來通過純培養方法對芽孢桿菌屬(Bacillus)的種類、功能及代謝途徑進行大量研究,并確定芽孢桿菌在白酒發酵過程中的產酶、產醬香風味物質等重要作用。但是高溫放線菌屬目前僅在芝麻香型白酒的高溫大曲中分離鑒定到一株Thermoactinomyces vulgaris 。目前在醬香高溫大曲中高溫放線菌的發現及其功能探究方面研究較少,沒有相關文章或專利。



技術實現要素:

本發明的目的在于提供的一種產土味素類物質的嗜溫高溫放線菌。

本發明的另一目的在于提供該嗜溫高溫放線菌在產土味素類物質中的用途。

本發明的一種嗜溫高溫放線菌,其形態特征:該菌株在ISP2培養基上,50℃培養3d,菌落直徑6~7mm,菌落圓形,基內菌絲淡黃色,氣生菌絲白色,菌落凸起、干燥致密,菌落不易挑起,不透明,有皺褶,孢子白色,無可溶性色素產生,掃描電鏡觀察菌絲體上形成單個孢子,孢子無柄或直接著生在菌絲體上,孢子單個側生于菌絲體兩側。該菌種于2016年5月30日保藏在中國典型培養物保藏中心(地址:中國 武漢 武漢大學),保藏號:CCTCC M2016296,名稱為:嗜溫高溫放線菌FBKL4.005(Thermoactinomyces thalpohillus strain FBKL4.005)。

(一)嗜溫高溫放線菌(Thermoactinomyces thalpohillus strain)FBKL4.005的分離步驟:

從貴州某酒廠酒曲中,稱取保存曲粉樣品10g,按照樣品與CaCO3質量比為10:1的比例在無菌燒杯混合,添加2ml無菌水,空氣濕度30%,在28℃富集培養1周;將富集后的大曲樣品放入盛90ml無菌CMC水溶液(2.5g/L)并帶有玻璃珠的三角燒瓶中,50℃、200r/min振蕩30min;將大曲樣品懸液在50℃水浴鍋中熱處理10min,取1ml樣品懸液進行10倍梯度稀釋分別由10-4、10-5、10-6和10-7稀釋度的樣品懸液中各取0.2ml涂布于分離培養基上,50℃靜止培養3d,挑取單菌落進一步篩選,斜面培養基上保藏。

(二)培養嗜溫高溫放線菌采用的培養基:

分離篩選培養基:

GTY培養基(g/L):葡萄糖10.0g、胰蛋白胨0.5g、酵母浸粉2.0g、CaCO3 1.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000ml、pH7.2-7.4,115℃滅菌20min,放置培養基冷卻到50℃加入經0.22um的無菌濾膜過濾的新生霉素(30mg/L)和制霉菌素(20mg/L)混勻倒平板;

保藏培養基:

ISP2培養基(g/L):酵母膏4g、麥芽汁10.0g、葡萄糖4.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000ml、pH7.0-7.2。

固態發酵培養基:

高粱麥粒培養基:高粱與小麥質量比為1:1,小麥高粱的粉碎顆粒與整粒比為1:1,加90℃熱水(加水量40%)攪拌均勻,潤糧1d,200g/瓶裝瓶,121℃滅菌20min。

(三)菌種的保種和傳代:

1、菌種保藏培養基:

ISP2培養基(g/L):酵母膏4g、麥芽汁10.0g、葡萄糖4.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000ml、pH7.0-7.2。

2、保存方法有4種:

①傳代培養高溫放線菌菌種保存法:將高溫放線菌接種于ISP2斜面培養基上,置恒溫箱50℃培養3d后,將橡膠塞用滅菌固體石蠟熔封,移至4℃冰箱保存,一般高溫放線菌在4℃冰箱內可以保存一個月,需定期移植。

②砂土管高溫放線菌菌種保存法:取清潔的海沙,用1mol/L的氫氧化鈉溶液清洗,然后再用1mol/L的鹽酸溶液清洗,在后用流水沖洗。分裝試管,約2-3厘米深,干熱滅菌,加入高溫放線菌培養液1mL左右與砂土混勻,置真空干燥管內干燥,待完全干燥后熔封保存。

③真空冷凍干燥高溫放線菌菌種保存法:將待保存的微生物細胞或者孢子懸浮在合適的保護劑中,預先將細胞冷凍,使水凍結,然后在真空條件下,使冰升華以除去大部分水,殘留的一些不凍結的水分,再通過蒸發從細胞中除去。

④液體石蠟法:亦稱礦物油保藏法,將高溫放線菌菌種接種在適宜的斜面培養基上,最適條件下培養至待得到健壯的菌體后注入滅菌的液體石蠟,使其覆蓋整個斜面,再直立放置于低溫(4℃)干燥處進行保存的一種菌種保藏方法,是定期移植保藏法的輔助方法。

(四)菌種的生態特征:

該菌形成的菌落在ISP2培養基上,50℃培養3d,菌落直徑6~7mm,菌落圓形,基內菌絲淡黃色,氣生菌絲白色,菌落凸起、干燥致密,菌落不易挑起,不透明,有皺褶,孢子白色,無可溶性色素產生,掃描電鏡觀察菌絲體上形成單個孢子,孢子無柄或直接著生在菌絲體上,孢子單個側生于菌絲體兩側。

(五)菌種的培養特性

(1)培養溫度45℃~55℃,最適溫度45℃~50℃;

(2)培養pH 6~8;最佳范圍為7~7.2。

基內菌絲由有分支的長菌絲組成,菌絲直徑約為500nm;氣生菌絲由長菌絲及長度為1um~2um的短菌絲組;孢子單個無柄,多為圓形,表面光滑,多直接著生在菌絲體兩側;偶見著生在很短孢子梗頂端。根據根據伯杰細菌鑒定手冊描述,綜合形態特征及 16S rDNA系統發育分析,嗜溫高溫放線菌FBKL4.005(Thermoactinomyces thalpohillus strain FBKL4.005)。

本發明的嗜溫高溫放線菌在產土味素類物質中的用途。

本發明與現有技術相比,具有明顯的有益效果,從以上技術方案可知:本發明的嗜溫高溫放線菌FBKL4.005對溫度、pH等自然環境條件的適應范圍廣,對不良環境的耐受力強,容易培養和保存及工業化生產,生產成本低,不污染環境,不破壞生態平衡。

具體實施方式

實施例:

本發明的嗜溫高溫放線菌(Thermoactinomyces thalpohillus)分離方法:

從貴州某酒廠酒曲中,稱取保存曲粉樣品10g,按照樣品與CaCO3質量比為10:1的比例在無菌燒杯混合,添加2ml無菌水,空氣濕度30%,在28℃富集培養1周;將富集后的大曲樣品放入盛90ml無菌CMC水溶液(2.5g/L)并帶有玻璃珠的三角燒瓶中,50℃、200r/min振蕩30min;將大曲樣品懸液在50℃水浴鍋中熱處理10min,取1ml樣品懸液進行10倍梯度稀釋分別由10-4、10-5、10-6和10-7稀釋度的樣品懸液中各取0.2ml涂布于分離培養基上,50℃靜止培養3d, 挑取單菌落進一步篩選,斜面培養基上保藏。

該菌形成的菌落在ISP2培養基上,50℃培養3d,菌落直徑6~7mm,菌落圓形,基內菌絲淡黃色,氣生菌絲白色,菌落凸起、干燥致密,菌落不易挑起,不透明,有皺褶,孢子白色,無可溶性色素產生,掃描電鏡觀察菌絲體上形成單個孢子,孢子無柄或直接著生在菌絲體上,孢子單個側生于菌絲體兩側。

試驗例:產香能力測定

將菌株接種于GTY液體培養基,50℃振蕩培養1d,取10ml接種于盛有200g高粱麥粒培養基的三角瓶中,50℃恒溫靜置培養5d,進行感官評定,土味較濃。

通過GC-MS對發酵產物的易揮發性物質進行分析,發酵試驗后,實驗組物質成分與對照組差距明顯,產物增多。其中土味素類物質含量為38.83%。

以上所述,僅是本發明的較佳實施例而已,并非對本發明作任何形式上的限制,任何未脫離本發明技術方案內容,依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾,均仍屬于本發明技術方案的范圍內。

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