本發(fā)明屬于食品發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一株可以用于醬油發(fā)酵增香的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種嗜熱、好氧、產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌，具有較好的蛋白酶及淀粉酶分泌能力，在發(fā)酵中能促進(jìn)原料中蛋白質(zhì)及淀粉的降解。醬油發(fā)酵主要原料是富含蛋白質(zhì)的大豆及淀粉質(zhì)原料小麥，枯草芽孢桿菌在大豆及小麥為原料的醬油發(fā)酵過程中添加將有利于原料中大分子物質(zhì)的降解。

人們對(duì)枯草芽孢桿菌的研究及應(yīng)用較早，但對(duì)其在發(fā)酵食品中的應(yīng)用報(bào)道較少。在醬香型白酒釀造中，枯草芽孢桿菌及其酶的作用可以產(chǎn)生香氣前體物質(zhì)，提高原料的利用率。枯草芽孢桿菌的利用對(duì)于發(fā)展高檔醬香型白酒、提高白酒質(zhì)量和產(chǎn)酒率具有重要意義。盡管枯草芽孢桿菌在釀酒行業(yè)中已有所應(yīng)用，但對(duì)于枯草芽孢桿菌菌種在發(fā)酵食品中的應(yīng)用研究基本還是空白，而枯草芽孢桿菌中具體菌株的研究應(yīng)用更是沒有。

另外，我國(guó)是醬油的第一生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，但目前隨著醬油發(fā)酵工藝封閉程度的提高，醬油發(fā)酵工程中自然接種的風(fēng)味菌越來越匱乏，從而影響醬油醬香風(fēng)味物質(zhì)的形成，導(dǎo)致醬油風(fēng)味單薄。因此，如何改善釀造醬油的不足和缺陷，已成為本領(lǐng)域人員關(guān)注的一個(gè)焦點(diǎn)，但迄今為止，本領(lǐng)域中還很少有人提及枯草芽孢桿菌在醬油釀制中的具體應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服以上背景技術(shù)中提到的不足和缺陷，提供一種可應(yīng)用于醬油發(fā)酵的枯草芽孢桿菌菌株以及該菌株在醬油發(fā)酵增香中的應(yīng)用，應(yīng)用后可以顯著提高醬油中的氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性風(fēng)味成分含量，使醬油醬香濃郁、品質(zhì)優(yōu)良。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一株枯草芽孢桿菌菌株，該枯草芽孢桿菌菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)，其命名為枯草芽孢桿菌CS1.03(Bacillus subtilis CS1.03)，其在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2015791。該枯草芽孢桿菌CS1.03的保藏日期為2015年12月29日，保藏單位的地址位于中國(guó)湖北武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)。

上述本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌CS1.03是從傳統(tǒng)的高鹽稀態(tài)發(fā)酵(曬露法)醬醪中分離篩選出一株獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)菌。該枯草芽孢桿菌CS1.03的鑒定過程包括：對(duì)枯草芽孢桿菌CS1.03進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化試驗(yàn)，初步確定為芽孢桿菌屬；再對(duì)枯草芽孢桿菌CS1.03進(jìn)行16S rDNA序列鑒定分析，確證此菌株為枯草芽孢桿菌種。

經(jīng)過我們的檢測(cè)分析，本發(fā)明的上述枯草芽孢桿菌CS1.03可以產(chǎn)高酶活的淀粉酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶以及乳酸等有機(jī)酸。我們創(chuàng)造性地將此菌株添加于醬油發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)可以有效改善發(fā)酵醬油的品質(zhì)問題，從而達(dá)到提升產(chǎn)品品質(zhì)、提高氨基氮含量及豐富醬油風(fēng)味的效果。

基于上述研究，作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述的枯草芽孢桿菌菌株在醬油發(fā)酵增香中的應(yīng)用。

更優(yōu)選的，所述的應(yīng)用具體包括以下步驟：

(1)將制醬油的成品曲與鹽水(食鹽溶液)按一定質(zhì)量比混合均勻，然后保溫發(fā)酵，制得醬醅；

(2)將所述枯草芽孢桿菌CS1.03的菌液噴灑到上述醬醅中，常溫下進(jìn)行一階段發(fā)酵；一階段發(fā)酵完成后開始用鹽水進(jìn)行淋澆發(fā)酵，最后得到生醬油。

上述的應(yīng)用中，優(yōu)選的，所述步驟(1)中，鹽水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16％～18％，所述制醬油的成品曲與鹽水的混合質(zhì)量比為1∶1.1～1.2。

上述的應(yīng)用中，優(yōu)選的，所述步驟(1)中，保溫發(fā)酵的溫度為40℃～42℃，保溫發(fā)酵的時(shí)間為7～10d。

上述的應(yīng)用中，優(yōu)選的，所述步驟(2)中，一階段發(fā)酵和淋澆發(fā)酵的溫度為35℃～38℃，淋澆發(fā)酵的時(shí)間為3～4d，一階段發(fā)酵和淋澆發(fā)酵的總共發(fā)酵時(shí)間為15～18d。

上述的應(yīng)用中，優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述枯草芽孢桿菌CS1.03的菌液的添加量為1.0～3.0×10⁹個(gè)/Kg成品曲。

上述的應(yīng)用中，優(yōu)選的，所述步驟(2)中，鹽水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22％～24％，所述制醬油的成品曲與用于淋澆的鹽水的混合質(zhì)量比為1∶0.8～1.0，且每天循環(huán)淋澆一次。

上述的應(yīng)用中，優(yōu)選的，所述枯草芽孢桿菌CS1.03的菌液的制備包括以下步驟：

準(zhǔn)備5～10g牛肉膏、10～15g蛋白胨、160～180g氯化鈉，5g磷酸氫二鉀，1000mL蒸餾水，pH 7.0～7.2；高溫滅菌(例如121℃滅菌30min)制得培養(yǎng)基；然后將所述枯草芽孢桿菌CS1.03的種子液接入培養(yǎng)基，34℃～38℃好氧培養(yǎng)38～45h。

在上述本發(fā)明的應(yīng)用中，我們通過對(duì)添加枯草芽孢桿菌CS1.03發(fā)酵的醬油和普通發(fā)酵醬油進(jìn)行氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性風(fēng)味成分含量進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)果均表明添加本發(fā)明枯草芽孢桿菌CS1.03發(fā)酵后的醬油氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性風(fēng)味成分含量明顯高于普通醬油，醬香濃郁、品質(zhì)優(yōu)良。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CS1.03首次從醬油發(fā)酵醬醪(醅)中分離到，且目前尚未報(bào)道枯草芽孢桿菌菌株單獨(dú)添加于醬油發(fā)酵進(jìn)行應(yīng)用的實(shí)例。通過添加本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CS1.03的發(fā)酵醬油相比于未添加的發(fā)酵醬油，本發(fā)明產(chǎn)品的氨基酸態(tài)氮含量、揮發(fā)性風(fēng)味成分含量都有明顯的提高。

生物材料保藏情況說明

本發(fā)明涉及的保藏生物材料為一株枯草芽孢桿菌菌株，該枯草芽孢桿菌菌株被命名為枯草芽孢桿菌CS1.03(Bacillus subtilis CS1.03)，其保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)，其在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2015791，保藏單位的地址位于中國(guó)湖北武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)。該枯草芽孢桿菌CS1.03的保藏日期為2015年12月29日。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CS1.03接種培養(yǎng)24h后的平板圖照片。

圖2為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CS1.03的革蘭氏染色圖。

圖3為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CS1.03的淀粉水解試驗(yàn)圖。

圖4為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CS1.03分子學(xué)鑒定試驗(yàn)中16S rDNA序列片段的電泳圖。

圖5為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌CS1.03分子學(xué)鑒定試驗(yàn)中的系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖6為本發(fā)明枯草芽孢桿菌CS1.03發(fā)酵制得的醬油與普通醬油的氨基酸態(tài)氮含量結(jié)果對(duì)比圖。

圖7為本發(fā)明枯草芽孢桿菌CS1.03發(fā)酵制得的醬油揮發(fā)性風(fēng)昧成分的總離子流圖。

圖8為未添加本發(fā)明枯草芽孢桿菌CS1.03發(fā)酵制得的醬油揮發(fā)性風(fēng)昧成分的總離子流圖。

圖9為本發(fā)明枯草芽孢桿菌CS1.03在用于發(fā)酵醬油時(shí)的工藝流程簡(jiǎn)圖。

具體實(shí)施方式

為了便于理解本發(fā)明，下文將結(jié)合說明書附圖和較佳的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更全面、細(xì)致地描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于以下具體的實(shí)施例。

除非另有定義，下文中所使用的所有專業(yè)術(shù)語與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中所使用的專業(yè)術(shù)語只是為了描述具體實(shí)施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

除非另有特別說明，本發(fā)明中用到的各種原材料、試劑、儀器和設(shè)備等均可通過市場(chǎng)購(gòu)買得到或者可通過現(xiàn)有方法制備得到。

實(shí)施例：

一、菌株的分離篩選

一株本發(fā)明的枯草芽孢桿菌菌株，該枯草芽孢桿菌菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)，其命名為枯草芽孢桿菌CS1.03(Bacillus subtilis CS1.03)，其在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2015791。該枯草芽孢桿菌CS1.03的保藏日期為2015年12月29日，保藏單位的地址位于中國(guó)湖北武漢市武漢大學(xué)校內(nèi)。

上述本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌CS1.03的篩選過程主要包括：在傳統(tǒng)的高鹽稀態(tài)發(fā)酵(曬露法)醬醪和低鹽固態(tài)發(fā)酵醬醅中取樣，培養(yǎng)；通過對(duì)兩份樣品進(jìn)行細(xì)菌菌相分析，最終從傳統(tǒng)的高鹽稀態(tài)發(fā)酵(曬露法)樣品中分離篩選出一株獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)菌——枯草芽孢桿菌CS1.03。

二、菌株的鑒定

將從傳統(tǒng)的高鹽稀態(tài)發(fā)酵(曬露法)醬醪中分離篩選出一株獨(dú)特的枯草芽孢桿菌CS1.03進(jìn)行鑒定，其過程包括：對(duì)枯草芽孢桿菌CS1.03進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化試驗(yàn)，初步確定為芽孢桿菌屬；再對(duì)枯草芽孢桿菌CS1.03進(jìn)行16S rDNA序列鑒定分析(鑒定結(jié)果見說明書后所附序列表)，確證此菌株為枯草芽孢桿菌種。

1.形態(tài)學(xué)鑒定

(1)將枯草芽孢桿菌CS1.03接種于高鹽牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，32℃培養(yǎng)24h后(參見圖1)，菌落表面干燥，有褶皺狀突起。

(2)對(duì)枯草芽孢桿菌CS1.03菌落進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡觀察菌株形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)此菌為革蘭氏陽性菌(參見圖2)，有芽孢，菌體個(gè)體形態(tài)呈桿狀，大小約為0.5×2μm～0.5×3μm。

上述的高鹽牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備步驟為：準(zhǔn)備5g牛肉膏，10g蛋白胨，180g氯化鈉，15-20g瓊脂，1000mL蒸餾水，pH 7.0；121℃滅菌30min。

2.生理生化特征試驗(yàn)研究

(1)進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)和V.P.試驗(yàn)，結(jié)果如下表1所示，該試驗(yàn)表明枯草芽孢桿菌CS1.03產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，產(chǎn)過氧化氫酶，V.P.試驗(yàn)為陽性；符合芽孢桿菌的特征。

表1 枯草芽孢桿菌CS1.03的大分子試驗(yàn)結(jié)果

注：+代表結(jié)果呈陽性；-代表結(jié)果呈陰性。

上述葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)培養(yǎng)基的制備步驟包括：準(zhǔn)備1.0g磷酸氫二銨、0.2g氯化鉀、0.2g硫酸鎂、0.2g酵母膏、0.008g溴甲酚紫和1000mL蒸餾水，pH自然；121℃滅菌30min；滅菌后加入5g葡萄糖。

上述V.P.試驗(yàn)培養(yǎng)基的制備步驟包括：準(zhǔn)備7g蛋白胨，5g葡萄糖，5g氯化鈉，1000mL蒸餾水，pH自然；121℃滅菌30min。

(2)進(jìn)行淀粉水解試驗(yàn)，如圖3所示，通過透明圈的大小判斷出本發(fā)明枯草芽孢桿菌CS1.03的淀粉酶酶活高。

上述淀粉水解培養(yǎng)基的制備步驟包括：在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1％的可溶性淀粉；121℃滅菌30min。

(3)進(jìn)行耐鹽性試驗(yàn)，結(jié)果如下表2所示，由表2可以看出，本發(fā)明枯草芽孢桿菌CS1.03可以耐受18％(w/v)的NaCl濃度，適宜在高鹽發(fā)酵中應(yīng)用。

表2 枯草芽孢桿菌CS1.03的耐鹽性試驗(yàn)

注：+代表能夠生長(zhǎng)；++代表生長(zhǎng)狀況較好；+++代表生長(zhǎng)狀況良好。

上述耐鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基的制備步驟包括：在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加不同質(zhì)量的氯化鈉即可。

3.分子學(xué)鑒定

(1)引物設(shè)計(jì)：采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)如下：

Forward primer：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

Reverse primer：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。

兩引物間距離約為1500bp。

(2)DNA模板制備：從培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌CS1.03斜面挑取少量菌體于50μL菌落PCR模板提取緩沖體系中，80℃變性15min，4000r/min離心10～15min，取上清液作為模板。

(3)PCR獲取16S rDNA片段：

反應(yīng)體系：50uL反應(yīng)體系中共含有PCR Premix 25μL，F(xiàn)orward primer(20pmol/uL)0.5μL，Reverse primer(20pmol/uL)0.5μL，模板1μL，16S-free H₂O 23μL。

反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5min；變性94℃1min、退火55℃1min、延伸72℃1.5min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。

(4)電泳：采用瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物結(jié)果。

電泳條件：90V恒壓，時(shí)間20-30min，結(jié)果見圖4。

(5)16S rDNA序列測(cè)序

該枯草芽孢桿菌CS1.03的16S rDNA基因序列測(cè)定結(jié)果如后附的序列表1。

(6)測(cè)序結(jié)果比對(duì)

測(cè)序結(jié)果通過GenBank中的Blast搜索數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列的同源性比較分析，并用MAGE4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖5所示。結(jié)果表明枯草芽孢桿菌CS1.03與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的親緣關(guān)系最近(登錄號(hào)：GQ305125.1)，相似度為100％。

二、菌株的應(yīng)用

經(jīng)過我們的檢測(cè)分析，本發(fā)明的上述枯草芽孢桿菌CS1.03可以產(chǎn)高酶活的淀粉酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶以及乳酸等有機(jī)酸。我們創(chuàng)造性地將此菌株添加于醬油發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)可以有效改善發(fā)酵醬油的品質(zhì)問題，從而達(dá)到提升產(chǎn)品品質(zhì)、提高氨基氮含量及豐富醬油風(fēng)味的效果。

一種上述的枯草芽孢桿菌菌株在醬油發(fā)酵增香中的應(yīng)用，如圖9所示，該應(yīng)用具體包括以下步驟：

(1)將制醬油的成品曲與質(zhì)量分?jǐn)?shù)16％的鹽水按1:1.2(w/w)的質(zhì)量比混合均勻，40℃～42℃保溫發(fā)酵10d，制得醬醅；

(2)將上述的枯草芽孢桿菌CS1.03的菌液噴灑到上述醬醅中，36℃下進(jìn)一步發(fā)酵18d；

上述枯草芽孢桿菌CS1.03的菌液的制備包括以下步驟：準(zhǔn)備5g牛肉膏，10g蛋白胨，160g氯化鈉，5g磷酸氫二鉀，1000mL蒸餾水，pH 7.0；121℃滅菌30min；然后將耐鹽的枯草芽孢桿菌種子液接入培養(yǎng)基，36℃好氧培養(yǎng)40h；

該枯草芽孢桿菌CS1.03的菌液的添加量為2.3×10⁹個(gè)/Kg原料；

(3)淋澆：在添加枯草芽孢桿菌CS1.03發(fā)酵4天后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)23％的鹽水進(jìn)行淋澆，發(fā)酵原料成品曲與用于淋澆的鹽水的混合質(zhì)量比為1∶0.8(w/w)，每天循環(huán)淋澆一次，最后得到生醬油。

(4)醬油品質(zhì)分析

氨基酸態(tài)氮含量分析：取添加CS1.03發(fā)酵的生醬油和未添加發(fā)酵的生醬油進(jìn)行氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定，測(cè)定方法參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.39-2003中的4.2.1。結(jié)果如圖6所示，表明添加復(fù)合風(fēng)味菌劑發(fā)酵的醬油氨基酸態(tài)氮的含量比未添加的普通發(fā)酵醬油高19.3％。

揮發(fā)性風(fēng)味成分分析：取添加CS1.03發(fā)酵醬油(Sample)和未添加CS1.03發(fā)酵醬油(Contrast)進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，兩種醬油的揮發(fā)性風(fēng)味成分的總離子流色譜圖分別為圖7、圖8。比較分析兩種醬油樣品中的酸、酚、醇、酯、醛酮、雜環(huán)類主要化合物含量，其結(jié)果見表3。由表3可知，添加CS1.03的發(fā)酵醬油樣品中酚類物質(zhì)含量比未添加CS1.03的樣品增加了105％，醛酮類化合物含量增加75.6％，酸、酯類化合物也稍有增加，而醇及雜環(huán)類化合物的含量則降低。究其原因，是由于CS1.03在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、麥芽酚、糠醛等物質(zhì)，致使酚及醛酮類化合物含量增加；而其代謝過程產(chǎn)生的乙酸等有機(jī)酸，隨著發(fā)酵的進(jìn)行進(jìn)一步與醇類物質(zhì)形成酯類，導(dǎo)致醇類物質(zhì)含量降低，而酸與酯類物質(zhì)含量微升。從揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量的增加可以看出，枯草芽孢桿菌CS1.03對(duì)醬油風(fēng)味物質(zhì)的形成貢獻(xiàn)較大，通過其在醬油發(fā)酵過程中的代謝作用，促進(jìn)了發(fā)酵向有益的方向發(fā)展，提升了醬油的風(fēng)味。

表3 兩種醬油中揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對(duì)含量比較

<110> 長(zhǎng)沙理工大學(xué)

<120> 一株枯草芽孢桿菌菌株及其在醬油發(fā)酵增香中的應(yīng)用

<160> 3

<210> 1

<211> 1464bp

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌

<400> 1

acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga 60

tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120

cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180

ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240

ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360

tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 420

gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 540

gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg 600

gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg 660

tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct 720

gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 780

cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta 840

acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac 900

gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960

caggtcttga catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga 1020

caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080

agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140

gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200

cacacgtgct acaatgggca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca 1260

caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct 1320

agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380

tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aaccttttag gagccagccg 1440

ccgaaggtgg gacagatgat tggg 1464

<210> 2

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

Agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaggaggtga tccagccgca 20