本發明屬于生物技術領域，尤其涉及到一種新型間充質干細胞無血清培養基的配方及配制方法，以及在人臍帶間充質干細胞的原代培養及大規模傳代培養中的應用。

背景技術：

隨著再生醫學的迅猛發展，干細胞的研究及其臨床應用已是當今生命科學最前沿最熱門的領域之一，它不但為人類戰勝多種疾病帶來希望，而且具有巨大的市場潛力。而與干細胞研究及臨床應用息息相關的培養基則是不可或缺的重要一環。目前，干細胞的培養都添加了一定量的動物源性的血清，如新生牛血清或胎牛血清，來滿足干細胞生長增殖的需要。但也存在許多問題：(1)血清是種非常復雜的混合物，成分多樣，目前對其準確的成分、含量及其作用機制仍不清楚，有些可能對干細胞的生長產生抑制或毒害作用；(2)血清都是批量生產，各批次之間生物活性物質及因子等成份或含量不一致，導致實驗結果或產品的重現性較差，使得干細胞生產標準化困難；(3)動物血清可能存在外源性病毒和致病性因子的風險，如支原體、病毒等，導致干細胞生產污染；(4)大規模干細胞培養中，血清價格昂貴，是構成生產成本的主要部分之一；(5)干細胞的臨床應用中，殘留的血清可能會引起患者的過敏反應。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種化學成分限定的間充質干細胞無血清培養基，這種無血清培養基是目前最安全的，最為理想的培養基。其優點如下：(1)成份明確，避免血清批次間的質量變動，提高干細胞研究及臨床應用結果的可重復性；(2)避免血清對干細胞培養的毒性作用和血清源性污染；(3)降低了干細胞培養及臨床應用的成本；(4)有利于干細胞體外培養的分化；(5)減少了干細胞臨床應用可能引起的過敏反應，降低了風險。

本發明的間充質干細胞無血清培養基，是由9倍體積基礎培養基與1倍體積的濃縮添加劑混合而成；

混合后基礎培養基中各組分的終濃度如下：

DMEM-LG培養基粉末10g/L；Purmorphamine 1-20μM；胰島素1.0-20.0mg/L；轉鐵蛋白0.5-10.0mg/L；乙醇胺0.2-2.0mg/L；L-抗壞血酸-2-磷酸5-50μmol/L；2-巰基乙醇0.5-5.0×10^-5mol/L；L-谷氨酰胺30-300mg/L；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺20-200mg/L；亞硒酸鈉1-10mg/L；丙酮酸鈉20-200mg/L；硫酸亞鐵0.5-5.0mg/L；氯化鋅0.2-2.0mg/L；地塞米松0.5-5.0nmol/L；碳酸氫鈉1000-3000mg/L；4-羥乙基哌嗪乙磺酸500-2000mg/L；

配制的濃縮添加劑組分及濃度(與基礎培養基混合之前)：

人血清白蛋白10-50g/L；纖黏連蛋白2-20mg/L；α-抗胰蛋白酶1-20mg/L；亞油酸0.5-10mg/L；亞麻酸2-20mg/L；卵磷脂1-10mg/L；BMP-7 1-50μg/L；Wnt5a 50-200μg/L；EGF 10-200μg/L；bFGF 20-200μg/L；PDGF 5-50μg/L；TGF-β1-50μg/L。

本發明所述的間充質干細胞無血清培養基優選混合后基礎培養基中各組分的終濃度如下：

DMEM-LG培養基粉末10g/L；Purmorphamine 1-5μM；胰島素5.0-15.0mg/L；轉鐵蛋白0.5-2.0mg/L；乙醇胺0.2-1.0mg/L；L-抗壞血酸-2-磷酸5-20μmol/L；2-巰基乙醇0.5-1.0×10^-5mol/L；L-谷氨酰胺100-200mg/L；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺20-100mg/L；亞硒酸鈉1-5mg/L；丙酮酸鈉100-200mg/L；硫酸亞鐵0.5-1.0mg/L；氯化鋅0.2-0.5mg/L；地塞米松0.5-1.0nmol/L；碳酸氫鈉1500-2500mg/L；4-羥乙基哌嗪乙磺酸800-1500mg/L；

配制的濃縮添加劑組分及濃度優選(與基礎培養基混合之前)：

人血清白蛋白15-25g/L；纖黏連蛋白5-15mg/L；α-抗胰蛋白酶1-10mg/L；亞油酸2.5-7.5mg/L；亞麻酸2-10mg/L；卵磷脂1-5mg/L；BMP-7 1-10μg/L；Wnt5a 100-150μg/L；EGF 10-100μg/L；bFGF 50-150μg/L；PDGF 5-20μg/L；TGF-β1-10μg/L。

本發明所述的間充質干細胞無血清培養基進一步優選混合后基礎培養基中各組分的終濃度如下：

DMEM-LG培養基粉末10g/L；Purmorphamine 2.5μM；胰島素10.0mg/L；轉鐵蛋白0.60mg/L；乙醇胺0.4mg/L；L-抗壞血酸-2-磷酸15μmol/L；2-巰基乙醇1.0×10^-5mol/L；L-谷氨酰胺150mg/L；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺50mg/L；亞硒酸鈉2.5mg/L；丙酮酸鈉150mg/L；硫酸亞鐵0.8mg/L；氯化鋅0.4mg/L；地塞米松1.0nmol/L；碳酸氫鈉2000mg/L；4-羥乙基哌嗪乙磺酸1000mg/L；

配制的濃縮添加劑組分及濃度進一步優選(與基礎培養基混合之前)：

人血清白蛋白20g/L；纖黏連蛋白10mg/L；α-抗胰蛋白酶5mg/L；亞油酸5mg/L；亞麻酸5mg/L；卵磷脂2mg/L；BMP-7 5μg/L；Wnt5a 125μg/L；EGF 50μg/L；bFGF 100μg/L；PDGF 10μg/L；TGF-β2μg/L。

本發明的另一個目的是提供上述培養基的配制方法：

本發明所述的間充質干細胞無血清培養基的配制方法，

1)基礎培養基的配制方法如下：

取超純水，先充分溶解DMEM-LG培養基粉末，一邊溶解一邊攪拌，再依次加入Purmorphamine、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺、L-抗壞血酸-2-磷酸、2-巰基乙醇、L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、亞硒酸鈉、丙酮酸鈉、硫酸亞鐵、氯化鋅、地塞米松、碳酸氫鈉及4-羥乙基哌嗪乙磺酸，充分溶解后，用濃鹽酸調整pH值，用氯化鈉調整滲透壓，補加超純水至900ml，過濾除菌，4℃保存；

2)濃縮添加劑配制方法如下：

取超純水，放入37℃的水浴鍋中，恒溫攪拌，先加入人血清白蛋白，攪拌充分溶解；在37℃恒溫的條件下，邊攪拌邊緩慢地滴入亞油酸，完全加入后再攪拌使充分溶解；按加入亞油酸的方法，依次加入亞麻酸及卵磷脂；最后37℃恒溫的條件下，再依次加入細胞因子EGF、PDGF、bFGF、β-TGF、BMP-7及Wnt5a，邊加入邊攪拌，使充分溶解，補加超純水至100ml，過濾除菌，-20℃避光保存；

3)基礎培養基與濃縮添加劑按照9：1的體積比混合。

本發明的間充質干細胞無血清培養基的配制方法更加具體的步驟如下：

1)基礎培養基的配制方法如下：

取800ml超純水，先充分溶解DMEM-LG培養基粉末，一邊溶解一邊攪拌，攪拌子轉速50-200rpm；再依次加入Purmorphamine、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺、L-抗壞血酸-2-磷酸、2-巰基乙醇、L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、亞硒酸鈉、丙酮酸鈉、硫酸亞鐵、氯化鋅、地塞米松、碳酸氫鈉及4-羥乙基哌嗪乙磺酸，充分溶解后，用濃鹽酸調整pH6.8-7.2，用氯化鈉調整滲透壓為260-335mOsm/kg，補加超純水至900ml，0.22μm過濾除菌，4℃保存；

2)濃縮添加劑配制方法如下：

取90ml超純水，放入37℃的水浴鍋中，恒溫攪拌，轉速50-100rpm，先加入人血清白蛋白，攪拌時間15min，使充分溶解；在37℃恒溫的條件下，邊攪拌邊緩慢地滴入亞油酸，完全加入后再攪拌10min，使充分溶解；按加入亞油酸的方法，依次加入亞麻酸及卵磷脂；最后37℃恒溫的條件下，再依次加入細胞因子EGF、PDGF、bFGF、β-TGF、BMP-7及Wnt5a，邊加入邊攪拌，使充分溶解，補加超純水至100ml，0.22μm過濾除菌,-20℃避光保存；

3)基礎培養基與濃縮添加劑按照9：1的體積比混合。

本發明的第三個目的是提供上述培養基在培養間充質干細胞上的應用。

干細胞培養基是人工模擬干細胞在體內的生長環境，為干細胞體外的生長增殖提供的營養環境。通常，干細胞的生長均有賴于血清的存在，如胎牛血清或新生牛血清，在不添加血清的培養基中，絕大部分細胞(包括干細胞)均不能生長增殖或分化。研究發現，血清能夠提供許多細胞(包括干細胞)生長必須的營養物質，如氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等；還提供激素和各種生長因子，如胰島素、腎上腺皮質激素、類固醇激素(雌二醇、睪酮、孕酮)等；還提供攜帶各種重要的低分子量物質的結合蛋白，如白蛋白攜帶維生素、脂肪以及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵等；還提供一些促進細胞接觸及伸展的因子，使細胞免受機械損傷，對培養中的細胞起保護作用。

但血清也是一種非常復雜的混合物，成分可能多達幾百種。目前對其準確的成分、含量及其作用機制仍不清楚。血清各批次之間的質量差別較大，受生產商原料來源地的影響較大，要保證每批的一致性很困難，不利于實驗室研究或產品生產的標準化。血清中可能含有一些未知的或未檢測出的支原體、病毒等有害微生物，對細胞產生潛在的影響。血清中存在的一些抗體、補體及細菌毒素等物質，也會對細胞的生長產生不利影響，甚至造成細胞死亡。

無血清細胞培養基的發明是培養基的發展歷程上的一個里程碑。它完全采用人工合成的化合物，成分確定，可以排除有血清培養基中許多未知因素的干擾，減少由血清帶來的污染機會，減少過敏源。培養基中確定的成份更有利于某一類型的細胞生長或繁殖，使實驗結果更為可靠，有利于標準化及連續化生產。

本發明使用的Purmorphamine是一種小分子化合物，屬于Hedgehog激動劑，分子式為C₃₁H₃₂N₆O₂，CAS號為：483367-10-8。本發明發現在無血清培養體系中加入適當濃度Purmorphamine，能顯著增加間充質干細胞的增殖能力。添加EGF、PDGF、bFGF、β-TGF、BMP-7及Wnt5a來替代血清中的細胞因子；添加亞油酸、亞麻酸、卵磷酸替代血清中的脂類物質；通過這些添加物的復配或者正交試驗獲得良好的增殖效果。

此外，添加人血清白蛋白、轉鐵蛋白來替代血清中的結合類蛋白物質；添加胰島素、乙醇胺、地塞米松來替代血清中的激素類物質；添加氯化鋅、硫酸亞鐵及亞硒酸鈉來替代血清中的金屬離子及微量元素；添加L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺、丙酮酸來替代血清中的能量物質，添加L-抗壞血酸-2-磷酸、2-巰基乙醇來替代血清中還原類物質，添加4-羥乙基哌嗪乙磺酸、碳酸氫鈉來替代血清中緩沖系統，維持細胞(干細胞)生存環境的pH。

本發明培養基配方的獲得經過了大量探索，以下僅僅是部分實驗。

使用本發明中的無血清間充質干細胞培養基，配制Purmorphamine母液，濃度為80μM。收集對數期臍帶間充質干細胞，2×10³個/孔接種于96孔細胞培養板。通過一系列的倍比稀釋，使Purmorphamine最終的處理濃度為別為10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.312μM、0.156μM、0.078μM，以不加Purmorphamine的為對照，培養72小時后，加5mg/ml MTT 10μl/孔，繼續培養4h。吸棄培養孔內培養基，加DMSO 100μl/孔，置搖床上低速振蕩10-15min，使結晶物充分溶解。在酶標儀下測定OD450nm的吸光值。以處理組的吸光值除以對照組的吸光值，計算細胞的活力。結果見圖1。實驗結果表明，小分子化合物Purmorphamine能顯著提高MSCs的活性及增殖能力。當濃度為2.5μM時，細胞存活率提高40％左右；當濃度低于2.5μM時，細胞存活率隨著濃度的提高而增加；當濃度大于2.5μM時，細胞存活率隨著濃度的增加，幾乎無變化。

進一步的實驗發現，當Purmorphamine與BMP-7骨形態發生蛋白的聯合使用，使MSCs存活率優于Purmorphamine或BMP-7的單獨使用。實驗分為四組：

第一組：本發明中的無血清培養基，做為對照組；

第二組：本發明中的無血清培養基，添加2.5μM的Purmorphamine；

第三組：本發明中的無血清培養基，添加0.50μg/L的BMP-7骨形態發生蛋白。

第四組：本發明中的無血清培養基，添加2.5μM的Purmorphamine及0.50μg/L的BMP-7骨形態發生蛋白。

結果見圖2，實驗結果表明，第二組單獨添加2.5μM的Purmorphamine，24h小時細胞存活率提高10％，48h小時細胞存活率提高25％，72h小時細胞存活率提高39％；第三組單獨添加0.50μg/L的BMP-7骨形態發生蛋白，24h小時細胞存活率提高2％，48h小時細胞存活率提高3％，72h小時細胞存活率提高8％；第四組同時添加上述兩種物質，24h小時細胞存活率提高14％，48h小時細胞存活率提高35％，72h小時細胞存活率提高66％。結論，Purmorphamine與BMP-7的同時使用，產生協同作用，效果更好。

Wnt蛋白是一組長度為350-400個氨基酸之信號轉導蛋白，可通過激活或抑制特異的細胞信號通路來維持MSCs增殖及存活而不誘導分化；在胚胎發育、細胞增殖調控中發揮重要作用。在間充質干細胞無血清培養體系中，加入Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b均能促進細胞的增殖與存活，其中優選Wnt5a。

使用本發明中的無血清間充質干細胞培養基，分別加入Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b三種蛋白，比較三種蛋白對細胞增殖及活力的影響。收集P1代對數期臍帶間充質干細胞，2×10³個/孔接種于96孔細胞培養板，每種蛋白系列作用濃度如下：100μg/L、50μg/L、25μg/L、12.5μg/L、6.25μg/L、3.13μg/L、1.56μg/L、0.78μg/L、0.39μg/L、0μg/L(對照)。培養72h，加5mg/ml MTT 10μl/孔，繼續培養4h。吸棄培養孔內培養基，加DMSO 100μl/孔，置搖床上低速振蕩10-15min，使結晶物充分溶解。在酶標儀下測定OD450nm的吸光值。以處理組的吸光值除以對照組的吸光值，計算細胞的活力。結果見圖3。實驗結果表明，Wnt3a、Wnt5a、Wnt10b三種蛋白均為顯著的提高細胞的存活率，其中，以Wnt5a蛋白為最優。從數據來看，Wnt5a蛋白使用濃度為12.5μg/L時，細胞的存活率最大，活性比對照提高50％左右；其次為Wnt3a蛋白，使用濃度為25μg/L時，細胞存活率達到最高，活性比對照提高40％左右；Wnt10b使用濃度為12.5μg/L時，細胞存活率達到最大，活性比對照提高20％左右。

本發明細胞因子復配方法及效果：(采用正交設計)

使用本發明中的無血清間充質干細胞培養基，調整細胞懸液濃度為1×10⁴個/ml；200ul/孔，2×10³個/孔接種于96孔細胞培養板，置于37℃，5％CO₂及飽和濕度的細胞培養箱培養。每孔加入一定濃度的EGF、bFGF、PDGF、TGF-β及Wnt5a細胞因子。其中EGF采用1μg/L、2.5μg/L、5μg/L、10μg/L四個劑量；bFGF采用0μg/L、2.5μg/L、5μg/L、10μg/L四個劑量；PDGF采用0.2μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L四個劑量；TGF-β采用0.2μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L四個劑量；Wnt5a采用3.13μg/L、6.25μg/L、12.5μg/L、25μg/L四個劑量。采用L₁₆(4⁵)正交設計加樣方案。培養72小時后，加5mg/ml MTT 10μl/孔，繼續培養4h。吸棄培養孔內培養基，加DMSO 100μl/孔，置搖床上低速振蕩10-15min，使結晶物充分溶解。在酶標儀下測定OD450nm的吸光值，結果見表1。

表1細胞因子復合配方對MSCs存活率的影響

表1的實驗數據表明，實驗方案12(EGF 5μg/L，bFGF 10μg/L，PDGF 1μg/L，TGF-β0.2μg/L，Wnt5a 12.5μg/L)的吸光值最高，使用該復配方案MSCs的細胞活性最大，存活率最高。該配方的五種細胞因子中，以bFGF最為重要，然后依次為Wnt5a、EGF、TGF-β、PDGF。該配方中bFGF的最佳濃度為10μg/L，Wnt5a的最佳濃度為12.5μg/L，EGF的最佳濃度為5μg/L，TGF-β的最佳濃度為0.2μg/L，PDGF的最佳濃度為1μg/L。實驗結果表明，bFGF、Wnt5a、EGF、TGF-β、PDGF的添加是本發明中無血清培養基的必要添加組分，有利于細胞的生長及增殖。其中Wnt5a、EGF、TGF-β、PDGF隨著濃度的再進一步增加，沒有明顯的促進MSCs的活性及存活率。

本發明脂類復配方法及效果：(采用正交設計)

使用本發明中的無血清間充質干細胞培養基，調整細胞懸液濃度為1×10⁴個/ml；200ul/孔，2×10³個/孔接種于96孔細胞培養板，置于37℃，5％CO₂及飽和濕度的細胞培養箱培養。每孔加入一定濃度的油酸、亞油酸、亞麻酸及卵磷脂。其中油酸采用0mg/L、0.5mg/L、1mg/L三個劑量，亞油酸采用0.25mg/L、0.5mg/L、1mg/L三個劑量，亞麻酸采用0.25mg/L、0.5mg/L、1mg/L三個劑量，卵磷脂采用0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L三個劑量；采用L₉(3⁴)正交設計加樣方案。培養72小時后，加5mg/ml MTT 10μl/孔，繼續培養4h。吸棄培養孔內培養基，加DMSO 100μl/孔，置搖床上低速振蕩10-15min，使結晶物充分溶解。在酶標儀下測定OD450nm的吸光值。結果見表2。

表2脂類復合配方對MSCs存活率的影響

表2的實驗數據表明，實驗方案2(油酸0mg/L，亞油酸0.5mg/L、亞麻酸0.5mg/L，卵磷脂0.2mg/L)的吸光值最高，使用該復配方案MSCs的細胞活性最大，存活率最高。四種脂肪酸中，以卵磷脂最為重要，其次為亞油酸，再次為亞麻酸，最后為油酸。卵磷脂的最佳濃度為0.2mg/L，亞油酸的最佳濃度為0.5mg/L，亞麻酸的最佳濃度為0.5mg/L，油酸作用不明顯，添加與否不影響細胞的存活率。亞油酸及亞麻酸為人體細胞必須的脂肪酸，人體維持機體正常代謝不可缺少而自身又不能合成。實驗結果表明，亞油酸、亞麻酸及卵磷脂的添加是本發明中無血清培養基的必要添加組分，有利于細胞的生長及增殖，但三種脂肪酸隨著濃度的再進一步增加，沒有明顯的促進MSCs的活性及存活率。

本發明優點：

1.成份明確，減少了批次間的差異；

2.無潛在的外源性病毒和致病性因子的風險；

3.減少了臨床研究的不良反應；

4.增殖效果好。

附圖說明

圖1為本發明小分子化合物Purmorphamine對MSCs活性影響；

圖2為本發明Purmorphamine與BMP-7對MSCs活性的影響；

圖3為Wnt蛋白對MSCs活性的影響；

圖4為實施例2中A培養基培養MSCs的貼壁圖；

圖5為實施例2中B培養基培養MSCs的貼壁圖；

圖6為實施例2中C培養基培養MSCs的貼壁圖；

圖7為實施例4中A、B、C三種培養基對MSCs細胞增殖的影響。

具體的實施方式

以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。

實施例1：本發明的優選方案如下：

基礎培養基與濃縮添加劑混合后基礎培養基中各組分的終濃度：

DMEM-LG培養基粉末 10g/L；Purmorphamine 2.5μM；胰島素10.0mg/L；轉鐵蛋白 0.60mg/L；乙醇胺 0.4mg/L；L-抗壞血酸-2-磷酸 15μmol/L；2-巰基乙醇 1.0×10^-5mol/L；L-谷氨酰胺 150mg/L；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 50mg/L；亞硒酸鈉 2.5mg/L；丙酮酸鈉 150mg/L；硫酸亞鐵 0.8mg/L；氯化鋅 0.4mg/L；地塞米松 1.0nmol/L；碳酸氫鈉 2000mg/L；4-羥乙基哌嗪乙磺酸 1000mg/L；

混合之前配制的濃縮添加劑組分及濃度：

人血清白蛋白 20g/L；纖黏連蛋白 10mg/L；α-抗胰蛋白酶 5mg/L；亞油酸 5mg/L；亞麻酸 5mg/L；卵磷脂 2mg/L；BMP-7 5μg/L；Wnt5a 125μg/L；EGF 50μg/L；bFGF 100μg/L；PDGF 10μg/L；TGF-β2μg/L。

實施例2：實驗分三組，分別為三種培養基，具體如下：

A培養基：本發明中的間充質干細胞無血清培養基，由基礎培養基與濃縮添加劑組成按9:1的體積比混合而成；

B培養基：商業化的無血清培養基，Life technologies公司的StemPro MSC SFM CTS人間充質干細胞無血清培養基；

C培養基：商業化的有血清培養基，MEM+10％胎牛血清。

本實施例中比較三種培養基對人臍帶間充質干細胞原代細胞的培養。取臍帶組織，用75％酒精消毒后，無菌條件下去除動脈靜脈血管及羊膜，撕取華通膠，充分剪碎至約1-3mm³大小，用移液管吸取華通膠塊，平分至分別裝有A培養基、B培養基、C培養基的三個75cm²的細胞培養瓶中，輕輕搖晃使華通膠分散在培養基中。細胞培養瓶放置37℃含5％CO₂的細胞培養箱中，靜止培養，從第4天起，每天觀察一次是否出現臍帶間充質干細胞貼壁的現象，比較貼壁出現時間的早晚。繼續培養至第15天，收獲原代臍帶間充質干細胞并計數。

實驗結果表明，使用本發明中A培養基，在第6天時即可出現貼壁的原代臍帶間充質干細胞(見圖4)，這與B培養基出現貼壁現象時的時間一致(見圖5)，但均略晚于C培養基1天時間(見圖6)。培養至第15天，使用A培養基收獲的臍帶間充質干細胞數量計數為170萬個，使用B培養基的細胞計數為130萬個，使用C培養基的細胞計數為116萬個。A培養基的原代細胞數量比B培養基的多30.8％，比C培養基的多46.5％；B培養基的原代細胞數量比C培養基的多12.1％，結果見表3。結論：使用本發明中的無血清間充質干細胞A培養基培養原代臍帶間充質干細胞(UCMSC)，其出現細胞貼壁的時間與市場上的B培養基一致，但都比C培養基稍晚1天；A培養基培養的原代細胞數量優于B培養基與C培養基，B培養基優于C培養基。A培養基更適于MSCs細胞的原代培養。

表3

實施例3：使用本發明中無血清A培養基與B培養基、C培養基分別培養原代臍帶間充質干細胞檢測其對細胞表型的影響。收獲采用三種培養基培養的原代臍帶間充質干細胞，用生理鹽水洗滌2次，棄上清，調整細胞濃度為2×10⁶個/ml。每個樣本分別采用熒光抗體標記，標記的抗體有CD13、CD14、CD19、CD29、CD31、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC、HLA-DR，分別采用同型抗體作對照。每管中加入對應熒光抗體5μl，再每管加入100μl臍帶間充質干細胞，用旋渦振蕩器充分搖勻，4℃下避光孵育30min。每管加3ml生理鹽水，洗滌，1200rpm離心5min棄上清；每管加2ml PBS，1500rpm離心5min，棄上清，加500μl PBS，旋渦震蕩混勻，流式上機檢測。細胞表型如下：

表4

流式檢測結果表明，三種培養基培養的原代臍帶間充質干細胞，均強烈表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC表面抗原，表型在95％以上，均不表達CD14、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR表面抗原，表型均在2％以下，均滿足臍帶間充質干細胞的細胞表型。說明無血清A培養基培養的臍帶間充質干細胞，在細胞表型方面，能夠與C有血清培養基、商業化的B無血清達到同樣的效果。

實施例4：本發明中A培養基與B培養基、C培養基對人臍帶間充質干細胞增殖的影響。取原代臍帶間充質干細胞，分別采用A培養基、B培養基、C培養基進行傳代培養。調整細胞密度為2×10⁴個/ml，接種75cm²細胞培養瓶，每瓶接種20ml，放置37℃含5％CO₂的細胞培養箱中培養。當細胞生長融合度達到90％時，按1:3的比例進行傳代，每傳代一次細胞代次增加一代，傳至第5代為止，觀察細胞的形態；比較三種培養基，細胞相對于原代細胞的增殖倍數。

實驗結果見圖7，表明臍帶間充質干細胞傳代至第5代時，細胞形態呈明顯的纖維狀，呈螺旋樣，增殖能力強。使用本發明中A培養基臍帶間充質干細胞至P5代時，累計增殖325倍；B培養基細胞至P5代累計增殖240倍；C培養基細胞至P5代累計增殖225倍。P3代以前代次(含P3代)，A培養基的細胞增殖倍數略低于C培養基，從P4代起，使用A培養基的臍帶間充質干細胞增殖速度明顯快于C培養基，也快于B培養基。A培養基能滿足人臍帶間充質干細胞的傳代需求，顯著促進其增殖。使用C培養基的后面代次細胞增殖慢于A培養基甚至B培養基，可能因為血清含有的一些有害因子的抑制作用導致。