本發明屬于干細胞培養
技術領域：
，具體涉及一種脂肪干細胞的無血清培養液及其制備方法和用途。
背景技術：
：脂肪干細胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)是zuk等人于2001年從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的間充質干細胞。脂肪干細胞能夠在體外穩定增殖，且來源豐富、取材方便、細胞獲取量較大，適宜大規模培養，具有很高的臨床應用價值，在細胞工程、組織工程及再生醫學等領域得到廣泛的應用。脂肪干細胞的貼壁較緩慢，通常需要在培養基中添加動物血清或其他促進貼壁的生長因子，以促進脂肪干細胞的貼壁和增殖。動物血清中含有能為脂肪干細胞提供生長增殖所需的激素、生長因子、轉移蛋白等營養物質，能促進脂肪干細胞的貼壁，但存在諸多缺點：價格昂貴，來源不穩定，批間差異較大，需要大量驗證工作，成分不明確，不利于疫苗和單克隆抗體等目的產品的分離純化，容易被病毒和支原體感染等。無血清培養基是在基礎培養基的基礎上，加入成分明確的血清替代成分，以滿足干細胞的培養要求，同時避免因使用血清帶來的諸多不利因素。血清替代成分較復雜，包括生長因子、蛋白等營養成分。已有研究表明，表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子等生長因子，以及三七總皂甙、丹參酮ⅡA等中藥成分能有效促進干細胞的增殖。與脂肪干細胞生物學行為相關的生長因子主要有血小板衍生生長因子、轉化生長因子和血管內皮生長因子。無血清培養基是干細胞走向臨床應用的重要條件，也是近年來的研究熱點之一。中國專利申請CN103255103公開了一種無血清的脂肪干細胞培養基，該培養基在DMEM-LG培養基的基礎上添加了堿性成纖維生長因子、表皮生長因子、肝素、L-谷氨酰胺、2-巰基乙醇、白血病抑制因子和丙酮酸鈉等組分，但未添加促進貼壁的細胞因子，需要使用包被的培養器皿以提高貼壁性能，且未添加白蛋白等營養成分，增殖較緩慢。中國專利申請CN104877962公開了一種無血清的脂肪干細胞培養基，該培養基在IMDM培養基的基礎上，還包括重組人胰島素、重組轉鐵蛋白、維生素C、人血清白蛋白、成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子、轉化生長因子、纖維連接蛋白、胎球蛋白、茶多酚和干細胞生長因子，通過纖維連結蛋白和胎球蛋白的協同作用，大大增強了脂肪干細胞的貼壁性能，無需對培養器皿進行包被，但成分較復雜。目前已有一些市售脂肪干細胞無血清培養基，如Gibco、佰通生物科技等公司的脂肪干細胞無血清培養基，但存在價格昂貴、貼壁性能不夠理想等缺點，貼壁性能不佳會對脂肪干細胞的增殖、分化等一系列反應產生影響。因此，提供一種成分較簡單、貼壁性能優良的無血清培養基以促進脂肪干細胞的增殖具有重要意義。技術實現要素：為解決現有技術存在的問題，本發明提供了一種脂肪干細胞無血清培養基，通過添加少量的二氫楊梅素和兒茶素，可顯著提高脂肪干細胞的貼壁性能和增殖速率，利于脂肪干細胞的增殖和干細胞特性保持，培養基的成分較簡單，成本較低。本發明的目的將通過下面的詳細描述來進一步說明。本發明提供一種脂肪干細胞無血清培養基，包括DMEM低糖培養基，還包括轉鐵蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素。采用上述技術方案，DMEM低糖培養基為基礎，在添加轉鐵蛋白、血小板衍生生長因子等營養成分的同時添加一定量的二氫楊梅素和兒茶素，可顯著提高脂肪干細胞的貼壁性能和增殖速率，解決了現有技術存在的貼壁性能不夠理想的問題，利于脂肪干細胞的增殖和干細胞特性保持，培養基的成分較簡單，成本較低。DMEM低糖培養基提供糖類、L-谷氨酰胺和無機鹽等基礎物質，為脂肪干細胞的新陳代謝提供能量來源。轉鐵蛋白為細胞內化和細胞代謝提供所需的鐵，起到鐵傳遞的作用。血清白蛋白可作為脂肪干細胞生長的營養來源，還可調節滲透壓，保護細胞免受機械損傷。血小板衍生生長因子(Plateletderivedgrowthfactor，PDGF)、表皮生長因子(EpidermalGrowthFactor，EGF)和轉化生長因子(transforminggrowthfactor，TGF)則主要起到脂肪干細胞生存維持和增殖刺激的作用。β-巰基乙醇具有抗氧化的作用，避免蛋白質因氧化而失活。二氫楊梅素(dihydromyricelin，DMY)為葡萄屬植物藤茶的提取物，是藤茶中主要活性成分黃酮類化合物，分子式為C15H12O8；現有研究表明，DMY具有抗氧化、清除體內自由基、消炎、止咳、祛痰、鎮痛、抑菌、抗高血壓、降脂、抗腫瘤、保肝護肝等諸多功效，未見將DMY用于干細胞培養的報道。兒茶素(catechin)是茶湯中最主要的成分，呈苦澀味，通過從茶葉中提取得到，具有防治心血管疾病、控制肥胖、預防癌癥等多種功能，可以清除自由基，常用作抗氧化劑，在染料和鞣革工業也得到較廣泛的應用。優選地，所述轉鐵蛋白的濃度為10～50μg/mL，所述血清白蛋白的濃度為0.5～5mg/mL，所述血小板衍生生長因子的濃度為10～50ng/mL，所述表皮生長因子的濃度為10～50ng/mL，所述轉化生長因子的濃度為10～50ng/mL，所述β-巰基乙醇的濃度為1～20μg/mL，所述二氫楊梅素的濃度為10～50μg/mL，所述兒茶素的濃度為10～50μg/mL。優選地，所述轉鐵蛋白的濃度為20～40μg/mL，所述血清白蛋白的濃度為1～3mg/mL，所述血小板衍生生長因子的濃度為15～30ng/mL，所述表皮生長因子的濃度為15～30ng/mL，所述轉化生長因子的濃度為15～30ng/mL，所述β-巰基乙醇的濃度為5～15μg/mL，所述二氫楊梅素的濃度為15～30μg/mL，所述兒茶素的濃度為10～30μg/mL。上述濃度是發明人經大量試驗篩選確定的優選濃度，對脂肪干細胞的貼壁、增殖和干細胞特性保持起到重要作用。優選地，所述轉鐵蛋白的濃度為25μg/mL，所述血清白蛋白的濃度為2mg/mL，所述血小板衍生生長因子的濃度為25ng/mL，所述表皮生長因子的濃度為25ng/mL，所述轉化生長因子的濃度為25ng/mL，所述β-巰基乙醇的濃度為10μg/mL，所述二氫楊梅素的濃度為25μg/mL，所述兒茶素的濃度為20μg/mL。優選地，所述血小板衍生生長因子為PDGF-BB，所述轉化生長因子為轉化生長因子-β1。優選地，所述的脂肪干細胞的無血清培養基還包括青霉素和/或鏈霉素。更優選地，青霉素的濃度為100U/mL，鏈霉素的濃度為0.1mg/mL。相應地，本發明還提供脂肪干細胞無血清培養基的制備方法，包括如下步驟：取DMEM低糖培養基，加入轉鐵蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素，攪拌均勻，經濾膜過濾除菌，得到脂肪干細胞的無血清培養基。優選地，所述制備方法還包括加入青霉素和/或鏈霉素的步驟。此外，本發明還提供了脂肪干細胞無血清培養基在脂肪干細胞培養中的用途。與現有技術相比，本發明的有益效果包括：本發明提供了一種脂肪干細胞無血清培養基，通過添加少量的二氫楊梅素和兒茶素，可顯著提高脂肪干細胞的貼壁性能和增殖速率，解決了現有技術存在的貼壁性能不夠理想的問題，利于脂肪干細胞的增殖和干細胞特性保持，培養基的成分較簡單，成本較低，實現了二氫楊梅素和兒茶素在脂肪干細胞培養方面的應用，也為脂肪干細胞的培養提供了新的選擇，綜合性能優于含胎牛血清的脂肪干細胞培養基。本發明提供的脂肪干細胞無血清培養基的制備方法簡單，可以制得質量穩定的脂肪干細胞無血清培養基。附圖說明圖1脂肪干細胞使用不同培養基培養的增殖曲線。圖2實施例一組和實施例二組的培養基培養脂肪干細胞至第5代的細胞形態圖。圖3脂肪干細胞干性基因Sox-2、Oct4和Nanog的mRNA相對表達量結果圖。具體實施方式下面將結合本發明實施例和附圖，對本發明的技術方案作進一步詳細的描述。本發明中，所涉及的組分、試劑和試劑盒均為常規市售產品，或可通過本領域的常規技術手段獲得，如DMEM低糖培養基購自Gibco，貨號11885-076。實施例一脂肪干細胞無血清培養基脂肪干細胞無血清培養基，包括DMEM低糖培養基，還包括轉鐵蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素；轉鐵蛋白的濃度為25μg/mL，血清白蛋白的濃度為2mg/mL，血小板衍生生長因子的濃度為25ng/mL，表皮生長因子的濃度為25ng/mL，轉化生長因子的濃度為25ng/mL，β-巰基乙醇的濃度為10μg/mL，二氫楊梅素的濃度為25μg/mL，兒茶素的濃度為20μg/mL。本發明中，各組分的濃度均以脂肪干細胞無血清培養基的終體積計。制備方法：取DMEM低糖培養基，加入轉鐵蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素，攪拌均勻，經濾膜過濾除菌，得到脂肪干細胞的無血清培養基。實施例二脂肪干細胞無血清培養基脂肪干細胞無血清培養基，包括DMEM低糖培養基，還包括轉鐵蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素；轉鐵蛋白的濃度為40μg/mL，血清白蛋白的濃度為1mg/mL，血小板衍生生長因子的濃度為30ng/mL，表皮生長因子的濃度為15ng/mL，轉化生長因子的濃度為20ng/mL，β-巰基乙醇的濃度為5μg/mL，二氫楊梅素的濃度為30μg/mL，兒茶素的濃度為10μg/mL。制備方法：取DMEM低糖培養基，加入轉鐵蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素，攪拌均勻，經濾膜過濾除菌，得到脂肪干細胞的無血清培養基。實施例三脂肪干細胞無血清培養基脂肪干細胞無血清培養基，包括DMEM低糖培養基，還包括轉鐵蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素；轉鐵蛋白的濃度為20μg/mL，血清白蛋白的濃度為3mg/mL，血小板衍生生長因子的濃度為20ng/mL，表皮生長因子的濃度為20ng/mL，轉化生長因子的濃度為10ng/mL，β-巰基乙醇的濃度為20μg/mL，二氫楊梅素的濃度為10μg/mL，兒茶素的濃度為25μg/mL。制備方法：取DMEM低糖培養基，加入轉鐵蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素，攪拌均勻，經濾膜過濾除菌，得到脂肪干細胞的無血清培養基。對比例1脂肪干細胞無血清培養基脂肪干細胞無血清培養基，包括DMEM低糖培養基，還包括轉鐵蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子、β-巰基乙醇和二氫楊梅素；轉鐵蛋白的濃度為25μg/mL，血清白蛋白的濃度為2mg/mL，血小板衍生生長因子的濃度為25ng/mL，表皮生長因子的濃度為25ng/mL，轉化生長因子的濃度為25ng/mL，β-巰基乙醇的濃度為10μg/mL，二氫楊梅素的濃度為25μg/mL。制備方法同實施例一。對比例1與實施例一的區別在于：不含兒茶素。對比例2脂肪干細胞無血清培養基脂肪干細胞無血清培養基，包括DMEM低糖培養基，還包括轉鐵蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子、β-巰基乙醇和兒茶素；轉鐵蛋白的濃度為25μg/mL，血清白蛋白的濃度為2mg/mL，血小板衍生生長因子的濃度為25ng/mL，表皮生長因子的濃度為25ng/mL，轉化生長因子的濃度為25ng/mL，β-巰基乙醇的濃度為10μg/mL，兒茶素的濃度為20μg/mL。制備方法同實施例一。對比例2與實施例一的區別在于：不含二氫楊梅素。對比例3脂肪干細胞無血清培養基脂肪干細胞無血清培養基，包括DMEM低糖培養基，還包括轉鐵蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子和β-巰基乙醇；轉鐵蛋白的濃度為25μg/mL，血清白蛋白的濃度為2mg/mL，血小板衍生生長因子的濃度為25ng/mL，表皮生長因子的濃度為25ng/mL，轉化生長因子的濃度為25ng/mL，β-巰基乙醇的濃度為10μg/mL。制備方法同實施例一。對比例3與實施例一的區別在于：不含二氫楊梅素和兒茶素。對比例4脂肪干細胞無血清培養基脂肪干細胞無血清培養基，包括DMEM低糖培養基，還包括轉鐵蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、轉化生長因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素；轉鐵蛋白的濃度為25μg/mL，血清白蛋白的濃度為2mg/mL，血小板衍生生長因子的濃度為25ng/mL，表皮生長因子的濃度為25ng/mL，轉化生長因子的濃度為25ng/mL，β-巰基乙醇的濃度為10μg/mL，二氫楊梅素的濃度為60μg/mL，兒茶素的濃度為20μg/mL。制備方法同實施例一。對比例4與實施例一的區別在于：二氫楊梅素的濃度由25μg/mL變為60μg/mL。實施例四脂肪干細胞的分離培養從3周齡健康SD大鼠腹股溝處無菌切取脂肪組織，通過Ⅰ型膠原酶消化法分離脂肪干細胞，進行原代培養，待長至80～90％匯合度，以1:3進行傳代，取第3代ADSCs用于本發明的貼壁檢測、細胞增殖檢測等實驗。試驗例一脂肪干細胞的貼壁檢測取未經包被的24孔板，設置實施例一組、實施例二組、實施例三組、對比例1組、對比例2組、對比例3組、對比例4組和陽性對照組，分別加入實施例一、實施例二、實施例三、對比例1、對比例2、對比例3、對比例4的無血清培養基以及含10％FBS的DMEM低糖培養基，每組3個復孔，每孔接種1×105個ADSCs，放置于細胞培養箱中孵育2h，棄去培養基，使用PBS沖洗去除未貼壁細胞，然后進行消化并收集計數，結果如表1所示。表1不同無血清培養基的細胞貼壁檢測結果組別細胞貼壁數實施例一組293.7±24.8實施例二組275.3±20.6實施例三組269.0±23.1對比例1組171.3±16.5對比例2組72.7±24.9對比例3組68.0±8.4對比例4組213.0±18.6陽性對照組280.7±23.5從表1可知，本發明提供的無血清培養基能顯著促進脂肪干細胞的貼壁，與陽性對照組的細胞貼壁數相當，差異不具有統計學意義；對比例3組(未添加二氫楊梅素和兒茶素)的脂肪干細胞貼壁性能較差，說明無血清培養基中所含有的血小板衍生生長因子、表皮生長因子和轉化生長因子等無法顯著提高脂肪干細胞的貼壁性能；對比例2組(未添加二氫楊梅素)的脂肪干細胞貼壁性能較差，說明添加兒茶素的添加無法顯著提高脂肪干細胞的貼壁性能；對比例1組(未添加兒茶素)的脂肪干細胞貼壁性能一般，優于對比例2組和對比例3組(P＜0.01)，但遠不如本發明的實施例一至三組(P＜0.01)，說明二氫楊梅素的添加可以顯著促進脂肪干細胞的貼壁，但效果遠不如二氫楊梅素和兒茶素同時添加；而對比例4組(二氫楊梅素的濃度較高)雖然也能顯著促進脂肪干細胞的貼壁，但效果遠不如本發明的實施例一至三組(P＜0.01)。通過對比各試驗組，可以發現：對比例2組和對比例3組不利于脂肪干細胞的貼壁，難以實現后續的快速增殖；一定含量二氫楊梅素和兒茶素的共同添加起到了協同促進脂肪干細胞貼壁的效果，二氫楊梅素的濃度過高反而不利于脂肪干細胞的貼壁。試驗例二脂肪干細胞的細胞增殖檢測將第3代脂肪干細胞以5000個/mL的密度接種到6孔板中，每孔接種2mL，設置實施例一組、實施例二組、對比例1組、對比例4組和陽性對照組，分別加入實施例一、實施例二、對比例1、對比例4的無血清培養基以及含10％FBS的DMEM低糖培養基，置于37℃、5％CO2的細胞培養箱中培養，每3天進行換液，連續培養9天，培養過程中使用顯微鏡觀察細胞形態，且每天分別將培養的細胞用0.25％胰酶消化，進行細胞計數，繪制細胞密度隨培養時間的增殖曲線如圖1所示。從圖1可知，本發明實施例一和實施例二提供的無血清培養基所培養的細胞增殖速率明顯優于對比例1組和對比例4組，且優于陽性對照組。實施例一組和實施例二組的培養基培養脂肪干細胞至第5代的細胞形態如圖2所示，細胞呈梭形，形態均一。試驗例三脂肪干細胞的細胞表型檢測使用實施例一的培養基培養脂肪干細胞至第10代，棄去培養基，PBS洗滌后用0.25％胰酶消化，離心后制成懸液，加入單克隆抗體，孵育后，洗滌，應用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD29、CD44、CD73等的表達水平，結果如表2所示。從表2可知，使用本發明提供的無血清培養基培養脂肪干細胞至第10代的細胞表型中CD29、CD44和CD73等的陽性率均大于96％，且CD14、CD31和CD45等的陽性率均小于1％，說明脂肪干細胞的干細胞特性保持良好。表2使用本發明培養基培養的脂肪干細胞表型檢測結果分子表型表達水平/％CD2998.02±0.56CD4497.15±0.39CD7397.36±0.34CD9098.49±0.42CD10596.81±0.76CD16697.50±0.63CD140.11±0.02CD310.34±0.05CD450.67±0.09HLA-DR0.88±0.08試驗例四脂肪干細胞的干性基因表達檢測使用實施例一的培養基培養脂肪干細胞至第10代，收集脂肪干細胞并提取RNA，反轉錄，采用實時熒光定量PCR儀檢測脂肪干細胞干性相關基因Sox-2、Oct4和Nanog的mRNA相對表達量，結果如圖3所示。從圖3可知，本發明提供的培養基培養的脂肪干細胞干性基因表達良好，干細胞特性保持良好。以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3