本發明涉及一種抗結核桿菌化合物及其制備方法與應用。
背景技術：
：結核病(Tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(MycobacteriumTuberculosis，MTB)引起的一種慢性致死性疾病，是危害人類健康和導致人類死亡的重大傳染性疾病，其致死率僅次于艾滋病(Ac-quiredImmunodeficiencysyndrome，AIDS)。由于抗結核藥物的大量使用和抗結核作用位點的突變，導致耐多藥結核病(multidrug-resistanttuberculosis，MDR-TB)不斷出現，再加上近年來患有艾滋病人口數量的增長，使結核病與人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)并發發病率急劇增加，這些問題的出現都給結核病的治療帶來巨大的挑戰，這無疑說明結核病已經成為人類健康的重大威脅，亟待解決。技術實現要素：本發明的目的是提供一種抗菌化合物及其制備方法與應用。本發明所提供的化合物如式Ⅰ所示。所述化合物在制備抗結核桿菌藥物中的應用也屬于本發明的保護范圍。本發明的再一個目的是提供一種抗菌藥物。本發明所提供的抗菌藥物的活性成分為以上式Ⅰ所示的化合物。在本發明中，所述抗菌藥物為抗結核桿菌藥物。本發明的另一個目的是提供所述化合物的制備方法。本發明所提供的所述化合物的制備方法，是對獨山瓜馥木干燥根進行甲醇回流提取，獲得獨山瓜馥木甲醇浸膏，再對所得甲醇浸膏進行分離和純化，從而得到所述化合物。進一步，所述甲醇浸膏是按照如下方法制備得到的:將所述獨山瓜馥木干燥根切塊，加入2倍重量的甲醇，回流提取3次，每次1.5h，去除甲醇(如用旋轉蒸發儀減壓回收)，水浴蒸干，獲得所述獨山瓜馥木甲醇提取物。在上述方法中，所述分離和純化的方法具體可包括如下步驟:(a)向所述甲醇提取物中加水，用可溶解所述化合物的有機溶劑進行萃取，收集有機相，去除有機溶劑，獲得含有權利要求1所述化合物的萃取物；(b)將所述萃取物依次經過所述硅膠柱層析A、硅膠柱層析B、制備薄層色譜，分離得到以上式Ⅰ所示的化合物。在步驟(a)中，所述可溶解所述化合物的溶劑可為乙酸乙酯。步驟(b)中，進行所述硅膠柱層析A時，采用的硅膠粒度為200-300目，洗脫體積為5500mL，洗脫體積的第1-500mL采用的洗脫液由體積比為10:1的石油醚和乙酸乙酯混合而成，洗脫體積的第501-1000mL采用的洗脫液由體積比為10:2的石油醚和乙酸乙酯混合而成，洗脫體積的第1001-1500mL采用的洗脫液由體積比為10:3的石油醚和乙酸乙酯混合而成，洗脫體積的1501-2000mL采用的洗脫液由體積比為10:4的石油醚和乙酸乙酯混合而成，洗脫體積的2001-2500mL采用的洗脫液由體積比為10:5的石油醚和乙酸乙酯混合而成，洗脫體積的2501-3000mL采用的洗脫液由體積比為10:6的石油醚和乙酸乙酯混合而成，洗脫體積的第3011-3500mL采用的洗脫液由體積比為10:7的石油醚和乙酸乙酯混合而成，洗脫體積的第3501-4000mL采用的洗脫液由體積比為10:8的石油醚和乙酸乙酯混合而成，洗脫體積的第4001-4500mL采用的洗脫液由體積比為10:9的石油醚和乙酸乙酯混合而成，洗脫體積的第4501-5000mL采用的洗脫液由體積比為10:10的石油醚和乙酸乙酯混合而成，洗脫體積的第5001-5500mL采用的洗脫液乙酸乙酯洗脫而成。在步驟(b)中，進行所述硅膠柱層析B時，采用的硅膠粒度可為200-300目，洗脫液由體積比為10:9的石油醚和乙酸乙酷混合而成，洗脫體積1000mL。進行所述制備薄層色譜時，采用的吸附劑為硅膠，硅膠粒度可為200-400目，展開劑由體積比為24:1的二氯甲烷和甲醇混合而成。在本發明的一個實施例中，進行所述制備薄層色譜時，采用的硅膠為GF254型號的硅膠板(購自青島海洋化工)。在上述方法中，步驟(a)可為:向所述甲醇提取物中加水，用石油醚進行萃取，收集水相；再用乙酸乙酯對所述水相進行萃取，收集有機相，即獲得所述“含有所述化合物的萃取液”。在本發明的一個實施例中，步驟(a)更加具體為:向所述甲醇提取物中加入1倍重量的水，攪拌得到水懸液；再向所述水懸液中加入等體積的石油醚，萃取30分鐘，萃取三次，收集水相；再向所述水相中加入等體積的乙酸乙酯，萃取30分鐘，萃取三次，收集有機相，去除有機溶劑，蒸干即獲得所述“含有所述化合物的萃取物”。在上述方法中，步驟(b)具體可為:將所述萃取物進行所述硅膠柱層析A，收集中間產物Fra.I，所述中間產物Fra.I在以體積比為10：9的石油醚和乙酸乙酯混合液作為展開劑，以粒度為100-200目的硅膠作為固定相的薄層層析(操作溫度27℃)中，比移值(Rf)為0.30-0.42；再將所述中間產物Fra.I進行所述硅膠柱層析B，收集中間產物Subfra.I3，所述中間產物Subfra.I3在以體積比為10:9的石油醚和乙酸乙酯的混合液作為展開劑，以粒度為200-300目的硅膠作為固定相的薄層層析(操作溫度27℃)中，比移值(Rf)為0.28-0.35；再將所述中間產物Subfra.I3進行所述制備薄層色譜，收集比移值(Rf)為0.27的樣品，獲得以上式Ⅰ所示的化合物。其中，所述中間產物Fra.I為在進行所述硅膠柱層析A時，以體積比為10:9的石油醚和乙酸乙酯混合液作為洗脫液進行洗脫所得，對應洗脫體積的4001-4500mL。所述中間產物Subfra.I3為在進行所述硅膠柱層析B時，以體積比為10:9的石油醚和乙酸乙酯的混合液作為洗脫液進行洗脫所得，對應洗脫體積的401-600mL。更加具體的，步驟(b)中，在進行所述硅膠柱層析A時，采用的層析柱的規格為60X900mm，柱溫為27℃，所用硅膠為1.8kg，上樣量為36g所述萃取物，流速為*ml/min，在進行所述硅膠柱層析B時，采用的層析柱的規格為20X900mm，柱溫為27℃，所用硅膠為900g，上樣量為1.5g所述中間產物Fra.I，流速為*ml/min。在進行所述制備薄層色譜時，采用的薄層板規格為20X20cm，操作溫度27℃；上樣量0.5ml；展開時間1h。實驗證明，本發明提供的化合物結構全新，具有較好的抗結核桿菌活性，適宜于抗菌先導化合物研究或制備抗菌藥物。本發明所用的天然產物活性成分制備方法選擇了能產生具有優異抗菌活性化合物的獨山瓜馥木(Fissistigmacavaleriei)，提取方法成熟，工藝簡便，所得產物產率高，經核磁共振檢測，其結構正確。附圖說明圖1為本發明所述TLC圖；圖2位本發明所述活性測試圖；附圖說明：圖1從左到右依次為乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和萃取后剩余物；圖2從左至右依次為：乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、萃取后剩余物。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。獨山瓜馥木干燥根(Fissistigmacavaleriei):采自貴州省黔東南州獨山縣。獨山瓜馥木干燥根(Fissistigmacavaleriei)憑證標本已于2011年04月03日保藏于貴州大學藥學院。當然，也可從商業途徑購得獨山瓜馥木干燥根(Fissistigmacavaleriei)。結核分枝桿菌(MycobacteriumTuberculosis，MTB)為H37Rv標準株。實施例1抗菌化合物的制備及鑒定所用試劑均為分析純(天津市致遠化學試劑有限公司)；硅膠柱色譜所用硅膠100-200目、200-300目均購自青島海洋化工廠；制備薄層色譜所用硅膠GF254購自青島市青島海洋化工分廠。一、抗菌化合物的制備1、獨山瓜馥木干燥根3Kg，切塊，分批次加入適量甲醇，加熱回流提取3次，每次1.5h，用旋轉蒸發儀減壓回收溶劑，從而去除甲醇，獲得獨山瓜馥木甲醇提取物。獨山瓜馥木干燥根乙酸乙酯萃取物的獲得2、向步驟1所得的獨山瓜馥木根甲醇提取物中加入1倍重量的水，攪拌使其混懸，再向其中加入等體積的石油醚，萃取0.3h，萃取三次，收集水相；再向所述水相中加入等體積的乙酸乙酯，萃取0.5h,萃取三次，收集有機相，用旋轉蒸發儀減壓回收溶劑，從而去除乙酸乙酯，獲得獨山瓜馥木根乙酸乙酯萃取物。3、獨山瓜馥木乙酸乙酯萃取物的硅膠柱層析硅膠柱層析條件如下硅膠柱(常壓柱)規格:60X900mm(海門市華凱實驗玻璃儀器有限公司)；柱溫為27℃；所用硅膠(200-300目)量為1.8kg；獨山瓜馥木根乙酸乙酯萃取物的上樣量為36g；洗脫液及洗脫程序如表1所示；流速為2ml/min；連續收集洗脫液，每100mL收集一管。表1獨山瓜馥木根乙酸乙酯萃取物的硅膠柱層析的洗脫程序洗脫液編號洗脫液成分石油醚：乙酸乙酯洗脫體積(ml)洗脫液1體積比10:11-500洗脫液2體積比10:2501-1000洗脫液3體積比10:31001-1500洗脫液4體積比10:41501-2000洗脫液5體積比10:52001-2500洗脫液6體積比10:62501-3000洗脫液7體積比10:73001-3500洗脫液8體積比10:83501-4000洗脫液9體積比10:94001-4500洗脫液10體積比10:104501-5000洗脫液11體積比0:15001-5500對所收集的各管洗脫液進行薄層層析(TLC)檢測，以各管洗脫液進行硅膠柱層析洗脫時采用的相應組分的洗脫液作為展開劑，以粒度為100-200目的硅膠作為固定相，操作溫度為27℃。計算10種洗脫液對應的10個流份的比移值(Rf)。結果顯示：將該步驟所收集的10個流份，分別記為Fra.A，Fra.B，Fra.C，Fra.D，Fra.E，Fra.F，Fra.G，Fra.H，Fra.I，Fra.J，Fra.K。其中，Fra.A為用洗脫液石油醚：乙酸乙酯(體積比10：1)洗脫得到的(對應洗脫體積的第1-500ml)，比移值(Rf)為0.55-0.70；Fra.B為用洗脫液石油醚:乙酸乙酯(體積比10:2)洗脫得到的(對應洗脫體積的第501-1000ml)，比移值(Rf)為0.50-0.67；Fra.C為用洗脫液石油醚:乙酸乙酯(體積比10:3)洗脫得到的(對應洗脫體積的第1001-1500ml)，比移值(Rf)為0.5-0.60；Fra.D為用洗脫液石油醚:乙酸乙酯(體積比10:4)洗脫得到的(對應洗脫體積的第1501-2000ml),比移值(Rf)為0.45-0.62；Fra.E為用洗脫液石油醚:乙酸乙酯(體積比10：5)洗脫得到的(對應洗脫體積的第2001-2500ml)，比移值(Rf)為0.40-0.58；Fra.F為用洗脫液石油醚:乙酸乙酯(體積比10:6)洗脫得到的(對應洗脫體積的2501-3000mL),比移值(Rf)為0.37-0.55；Fra.G為用洗脫液石油醚:乙酸乙酯(體積比10:7)洗脫得到的(對應洗脫體積的第3001-3500ml)，比移值(Rf)為0.35-0.55；Fra.H為用洗脫液石油醚:乙酸乙酯(體積比10:8)洗脫得到的(對應洗脫體積的第3501-4000ml)，比移值(Rf)為0.33-0.53；Fra.I為用洗脫液石油醚:乙酸乙酯(體積比10:9)洗脫得到的(對應洗脫體積的第4001-4500ml)，比移值(Rf)為0.30-0.42；Fra.J為用洗脫液石油醚:乙酸乙酯(體積比10:10)洗脫得到的(對應洗脫體積的第4501-5000ml)，比移值(Rf)為0.26-0.40。Fra.K為用洗脫液為乙酸乙酯洗脫得到的(對應體積5001-5500ml)，比移值0.35-0.67。4,流份Fra.I的硅膠柱層析。硅膠柱(常壓柱)規格:20X900mm(海門市華凱實驗玻璃儀器有限公司)；柱溫為27℃；所用硅膠(200-300目)量為900g；上樣量為1.5g(1.5g流份Fra.I蒸干溶劑后的固體)；洗脫液為石油醚:乙酸乙酯(體積比10:9)；流速為*ml/min；洗脫體積為1000ml。連續收集洗脫液，每20ml收集一管。洗脫體積的第1-200mL為第1個流份、洗脫體積的第201-400ml為第2個流份、洗脫體積的第401-600ml為第3個流份、洗脫體積的第601-800ml為第4個流份、洗脫體積的第801-1000ml為第5個流份。對所收集的各管洗脫液進行薄層層析(TLC)檢測，用進行以上硅膠柱層析時采用的洗脫液(體積比為10:9的石油醚:乙酸乙酯)作為展開劑，以粒度為200-300目的硅膠作為固定相，操作溫度為27℃。計算5個流份的比移值(Rf)。結果顯示，將該步驟所收集的5個流份，分別記為Subfra.Il，Subfra.I2，Subfra.I3，Subfra.I4，Subfra.I5。其中，Subfra.Il對應洗脫體積的第1-200mL，比移值(Rf)為0.38-0.50；Subfra.I2對應洗脫體積的第201-400mL，比移值(Rf)為0.35-0.47；Subfra.I3對應洗脫體積的第401-600m,比移值(Rf)為0.32-0.40；Subfra.I4對應洗脫體積的第601-800mL，比移值為0.26-0.34，Subfra.I5對應洗脫體積的第801-1000ml，比移值為0.20-0.30。5,流份Subfra.I3的制備色譜薄層板規格:20X20cm(制備薄層色譜所用硅膠GF254購自煙臺市化學工業研究所)；操作溫度27℃；上樣量0.5ml；展開時間1h；展開劑為體積比為24:1的二氯甲烷:甲醇。上樣展開完畢，進行顯色，將檢測到的樣品連同硅膠一齊刮下，使用洗脫液(體積比為24:1的二氯甲烷:甲醇)將組分洗脫，將洗脫液蒸干。共得到40mg式Ⅰ化合物，在以上制備薄層色譜中的比移值(Rf)為0.5。二、抗菌化合物式Ⅰ的結構鑒定對步驟一得到的式Ⅰ化合物進行鑒定(1)外觀：式Ⅰ化合物為黃色或淡黃色液體至固體。(2)溶解性：易溶于乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇等有機溶劑。(3)核磁共振譜:圖1是式Ⅰ化合物的1H-NMR譜圖，圖2是式Ⅰ化合物的13C-NMR譜圖。根據化合物的1H-NMR,13C-NMR，對兩個化合物的核磁共振譜進行了研究并對13C信號進行了歸屬，見表2。并最終確定結構如下：式Ⅰ化合物氫譜和碳譜峰的歸屬，ES-MSm/z126[M]+；H-NMR(CDCl3)δ：4.9(-OH),4.7(6-H),6.5(4-H),7.3(3-H),9.5(CHO)；13C-NMR(CDCl3)δ:：57.0(6-C),161.5(5-C),111.6(4-C),124.0(3-C),152.0(2-C),178.1(CO)。注：溶劑為二氯甲烷，式Ⅰ化合物的NMR測試采用里瓦安核磁共振儀器(400兆赫茲)，測試的溶劑均為氘代二氯甲烷。實施例2，式Ⅰ化合物的抗結核桿菌活性測定一、實驗方法抗結核桿菌活性測定結核桿菌在改良羅氏培養基上生長良好，通過觀察其在培養基上生長菌落的增殖情況來衡量式Ⅰ化合物的抗菌活性，具體操作如下。將結核桿菌H37Rv接種到含有改良羅氏培養基(上海博微生物科技有限公司)的固體斜面上，藥物濃度分別為500μg/ml、2500μg/ml、5000μg/ml，陽性對照組為異煙肼2μg/ml，陰性對照組為5％二甲基亞砜，置于37℃的恒溫培養箱中培養10天，統計待測化合物對結核桿菌的最低抑菌濃度值(MIC)，通過觀察結核桿菌的生長情況，生長被抑制80％以上的化合物濃度即為該化合物對結核桿菌的最低抑菌濃度值。實驗重復3次。二、實驗結果結果顯示，在抗結核桿菌實驗中，實施例1制備得到的式Ⅰ化合物對結核桿菌的抗菌活性MIC確定為500μg/ml，具體結果如表3所示。表3，式Ⅰ化合物的抗菌活性表3抗結核桿菌活性試驗當前第1頁1 2 3