本發明屬于細胞培養基技術領域，具體涉及一種表皮細胞培養基及其制備方法。
背景技術：
人表皮細胞在創傷愈合中起至關重要的作用，尤其是嚴重燒傷病人表皮細胞的匱乏與其病程長短、并發癥的發生、后期瘢痕的形成均有密切關系，因此應用組織工程技術在體外進行表皮細胞的分離、培養與保存并應用于臨床始終都是燒傷工作者的一個研究熱點。
傳統的表皮培養基不僅需要昂貴的添加因子，而且其培養的表皮細胞擴增速度緩慢，在時間上不能滿足燒燙傷治療的需求，這個因素嚴重束縛了組織工程表皮用于急性皮膚創傷的治療的臨床應用。
中國專利申請(CN105950542A)提供了一種人皮膚表皮細胞培養基及其應用，本發明培養基將K-SFM及DMEM和F12培養基按照2:1:1混合，添加BPE、EGF、SCGF、FGF、TGF-β、VEGF、CaCl2、谷氨酰胺、雙抗。此本發明培養基不含血清，可用于人皮膚表皮細胞原代及傳代培養，但培養基成本昂貴。
因此，目前亟需一種能夠促進表皮細胞快速擴增、成本低廉的表皮細胞培養基。
技術實現要素：
為解決上述問題，本發明提供了一種表皮細胞培養基及其制備方法，其具有快速促進表皮細胞生長，成分簡單，成本低廉的優點。
本發明通過以下技術方案實現：
一種表皮細胞培養基，其主要由以下成分及其濃度組成：基礎培養基10-15g/L，胰島素10-30mg/L，谷氨酰胺1-10mg/L，飛燕草素10-100μg/L，桑色素1-10ng/L，兒茶素45-65μM，表皮生長因子5-10μg/L，糖皮質激素50-300μg/L，轉化生長因子-β1-3μg/L，亞硒酸鈉1-10μg/L，檸檬酸鐵銨0.2-1.5mg/L，硝酸鐵0.3-0.8mg/L和EDTA-2Na 4-10mg/L。
優選地，所述表皮細胞培養基，由以下成分及其濃度組成：基礎培養基12g/L，胰島素14.5mg/L，谷氨酰胺7.5mg/L，飛燕草素34μg/L，桑色素5.25ng/L，兒茶素63.5μM，表皮生長因子8.2μg/L，糖皮質激素150μg/L，轉化生長因子-β2.6μg/L，亞硒酸鈉6μg/L，檸檬酸鐵銨1.35mg/L，硝酸鐵0.45mg/L和EDTA-2Na 6.25mg/L。
優選地，所述表皮細胞培養基中基礎培養基為Ham’s F12或DMEM-L。
一種表皮細胞培養基的制備方法，由分為以下步驟：
(1)稱取相應重量的基礎培養基、飛燕草素、桑色素、兒茶素、亞硒酸鈉、檸檬酸鐵銨、硝酸鐵和EDTA-2Na，溶于35℃，800mL超純水中，攪拌至完全溶解，得溶液I；
(2)將上述所得溶液I冷卻至15-16℃，加入相應量的胰島素、谷氨酰胺、表皮生長因子、糖皮質激素和轉化生長因子，加入200mL超純水輕微攪拌至均勻，得溶液II。
(3)用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調溶液II的pH至7.2，得溶液III。
(4)將溶液III用0.22μm濾膜正壓過濾除菌，即得。
本發明培養基成分及其濃度是經過大量實驗篩選得到的，是一種組分配比合理、科學、有效的表皮細胞培養基。飛燕草素(C15H11ClO7，CAS NO.528530)、桑色素(C15Hl0O7·2H2O，CAS NO.480-16-0)屬于生物類黃酮化合物，均具有很強的抗養化與抑菌作用，如桑色素對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌和傷寒桿菌有較強的抗菌作用。與此同時，飛燕草素對彈性蛋白酶和膠原蛋白酶具有抑制作用。兒茶素(C15H14O6，CAS NO.7295-85-4)又稱兒茶精，茶單寧，為黃烷醇的衍生物，分子式C15H14O6。兒茶素最初由兒茶中提取出，為無色結晶形固體，能溶于水；兒茶素是天然的油脂抗氧化劑，并且可以清除人體產生的自由基，以保護細胞膜，可以抑制引起人類皮膚病的病菌，并且對治療濕疹有很好的療效。本發明培養基中加入飛燕草素、桑色素和兒茶素，不僅能夠起到很好的抑菌效果，同時對表皮細胞的生長有極大地促進作用。
胰島素可以促進RNA、蛋白質和脂肪酸的合成，抑制細胞凋亡，是重要的細胞存活因子。檸檬酸鐵銨，硝酸鐵和EDTA-2Na組合能夠代替傳統培養基中轉鐵蛋白的作用，能夠促進鐵的運輸。表皮生長因子、轉化生長因子-β和糖皮質激素分別是重要的促生長因子和激素，對表皮細胞生長具有促進作用。
本發明培養基與傳統表皮細胞培養基相比，具有以下優點：
(1)本發明表皮細胞培養基能使表皮細胞快速增殖，并意外發現本發明培養基表皮細胞的凋亡速度減慢，因而本發明培養基對表皮細胞生長有極大地促進作用。
(2)本發明培養基成分簡單、成本低廉，適合用于表皮細胞的大規模培養。
附圖說明
圖1不同培養基中表皮細胞生長曲線。培養基分別為實施例1-3及對比例1制備得到的培養基。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明做進一步詳細說明，但這并非是對本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的范圍之內。
實施例1一種表皮細胞培養基
一種表皮細胞培養基，由以下成分及其濃度組成：Ham’s F1212g/L，胰島素14.5mg/L，谷氨酰胺7.5mg/L，飛燕草素34μg/L，桑色素5.25ng/L，兒茶素63.5μM，表皮生長因子8.2μg/L，糖皮質激素150μg/L，轉化生長因子-β2.6μg/L，亞硒酸鈉6μg/L，檸檬酸鐵銨1.35mg/L，硝酸鐵0.45mg/L和EDTA-2Na 6.25mg/L。
制備方法：
(1)稱取相應重量的基礎培養基、飛燕草素、桑色素、兒茶素、亞硒酸鈉、檸檬酸鐵銨、硝酸鐵和EDTA-2Na，溶于35℃，800mL超純水中，攪拌至完全溶解，得溶液I；
(2)將上述所得溶液I冷卻至15℃，加入相應量的胰島素、谷氨酰胺、表皮生長因子、糖皮質激素和轉化生長因子，加入200mL超純水輕微攪拌至均勻，得溶液II。
(3)用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調溶液II的pH至7.2，得溶液III。
(4)將溶液III用0.22μm濾膜正壓過濾除菌，即得。
實施例2一種表皮細胞培養基
一種表皮細胞培養基，由以下成分及其濃度組成：DMEM-L 15g/L，胰島素30mg/L，谷氨酰胺10mg/L，飛燕草素100μg/L，桑色素10ng/L，兒茶素65μM，表皮生長因子10μg/L，糖皮質激素300μg/L，轉化生長因子-β3μg/L，亞硒酸鈉10μg/L，檸檬酸鐵銨1.5mg/L，硝酸鐵0.8mg/L，EDTA-2Na 10mg/L。
制備方法與實施例1類似。
實施例3一種表皮細胞培養基
一種表皮細胞培養基，由以下成分及其濃度組成：DMEM-L培養基10g/L，胰島素10mg/L，谷氨酰胺1mg/L，飛燕草素10μg/L，桑色素1ng/L，兒茶素45μM，表皮生長因子5μg/L，糖皮質激素50μg/L，轉化生長因子-β1μg/L，亞硒酸鈉1μg/L，檸檬酸鐵銨0.2mg/L，硝酸鐵0.3mg/L，EDTA-2Na 4mg/L。
制備方法與實施例1類似。
對比例1一種表皮細胞培養基
一種表皮細胞培養基，由以下成分及其濃度組成：Ham’s F 12g/L，胰島素14.5mg/L，谷氨酰胺7.5mg/L，飛燕草素97.5μg/L，桑色素5.25ng/L，表皮生長因子8.2μg/L，糖皮質激素150μg/L，轉化生長因子-β2.6μg/L，亞硒酸鈉6μg/L，檸檬酸鐵銨1.35mg/L，硝酸鐵0.45mg/L和EDTA-2Na 6.25mg/L。
制備方法與實施例1類似。
與實施例1區別在于，不含有兒茶素而飛燕草素濃度提升至97.5μg/L。
試驗例1細胞生長檢測
取外科包皮手術切下的正常健康人的包皮組織加入含500U/mL雙抗的MEM取樣培養基中，盡快返回細胞室。剪除脂肪組織，將皮片剪成2mm×5mm的狹長條，再在100U/ml的雙抗D-hanks液中浸泡3次，每次3min。用0.2％的胰酶冷消化過夜，然后在平皿內分離表皮和真皮，盡量將皮片剪碎，37℃熱消化30min，加等量MEM終止消化，過銅網離心棄上清，分別加入3mL實施例1-3及對比例1培養液，均勻接種在無菌培養瓶內，置37℃CO2培養箱中培養。
利用MTT法檢測檢測細胞生長狀況，如表1所示。
表1不同培養基中表皮細胞生長狀況
由表1可知，實施例培養基中表皮細胞生長狀況明顯優于對比例，實施例細胞培養基中表皮細胞生長迅速，能夠快速達到平頂期，凋亡速度減慢，因此本發明培養基對表皮細胞生長有極大地促進作用。
各培養基中表皮細胞生長趨勢，如圖1所示。