本發明涉及生物工程領域，具體地說涉及一種母乳內源性抗菌多肽及其應用。

背景技術：

自1939年第一種抗菌肽(antimicrobialpeptides，amps)從土壤芽孢桿菌中被分離以來，在不同生物中陸續發現了2490多種抗菌肽，并且新的抗菌肽還在不斷地開發和鑒定中。抗菌肽是一類由5～100個氨基酸組成的寡肽，具有廣譜的抗菌活性，作用靶標包括革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、真菌、病毒、寄生蟲以及腫瘤細胞等，使它迅速成為潛在的治療藥物。

抗菌肽的殺菌機制包括通過破壞細胞膜的完整性，抑制蛋白、dna和rna的合成，或與胞內某些特定的靶標相結合從而殺死細菌。一般來說，一種抗菌肽僅對一類微生物有效，但是也有一些例外的抗菌肽針對不同的微生物具有不同的殺傷機制，例如抗菌肽indolicidin不僅可以通過滲透細胞抑制dna的合成殺傷大腸桿菌，而且可以通過損傷真菌細胞膜殺傷真菌，還可以抑制hiv-整合酶抑制hiv活性。還有一些抗菌肽對不同類型微生物具有相同的殺傷模式，pmap-23能夠在細胞膜形成孔隙殺死真菌和寄生蟲。抗菌肽不僅可以破壞微生物細胞膜而且可以抑制功能蛋白的合成產生快速殺傷效應的獨特機制使其成為理想的抗生素替代品。耐藥菌、生物被膜、滯留菌對傳統抗生素具有很強的抗性，并且它們在感染中發揮著重要作用。利用抗菌肽破壞細胞膜的效應殺死耐藥菌以及對生物被膜基質蛋白酶的作用清除生物被膜，可以有效控制感染的發生，因此具有潛在的開發應用價值。

研究報道母乳強大的抗感染能力主要取決于其成份組成，如：母乳寡糖(oligosaccharides)和乳鐵蛋白可促進益生菌的生長，平衡新生兒腸道菌群抵御外界病原體的入侵；乳凝集素可通過抑制toll樣受體信號通路抵抗病菌感染。近年來，母乳已被鑒定出含有超過300種內源性多肽，其中β-防御素2具有廣譜抗菌活性，對沙門氏菌和大腸埃希菌等具有殺傷作用；胰高血糖素樣肽2可顯著提高壞死性小腸結腸炎的發生率，減少腸道中炎癥因子tnf-α、il-6的分泌。多肽作為藥物，不僅具有大分子藥物的精確，而且還具備小分子藥物的高效，更兼具藥物的安全性優勢，在抗腫瘤和代謝性疾病等多項領域中均受到越來越多的重視，如利拉魯肽和艾塞那肽可成功治療糖尿病。因此從母乳內源性多肽的角度尋找抗菌肽對臨床抗感染治療具有積極的作用。

技術實現要素：

發明目的：本發明的目的是提供一種母乳內源性抗菌多肽，本發明還有一個目的是提供編碼前述多肽的核苷酸，本發明還有一個目的是提供含有前述核苷酸序列的表達載體；本發明還有一個目的是提供前述表達載體轉染的宿主細胞；本發明還有一個目的是提供含有前述多肽的組合物；本發明還有一個目的是提供前述多肽在制備抗小腸結腸炎耶爾森菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌藥物上的應用。

技術方案：本發明所述的一種分離的內源性抗菌多肽，其通式為seqidno.1所示的氨基酸序列。

β-casein197(氨基酸序列seqidno.1)：

leu-leu-asn-gln-glu-leu-leu-leu-asn-pro-thr-his-gln-ile-tyr-pro-val。

本發明所述的母乳內源性抗菌多肽來源于人類母乳中的β-酪蛋白，為經過篩選可同時對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、小腸結腸炎耶爾森菌具有優秀抑菌效果的天然內源性抗菌多肽。

本發明的多肽對小腸結腸炎耶爾森菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌同時具有較好的抑菌效果，結構穩定，不易在體內降解。所述多肽的獲得可按照氨基酸序列通過固相合成方法獲得；或者通過宿主微生物或細胞內克隆并表達攜帶編碼所述多肽之一的核苷酸序列的dna片段，通過現有的重組dna技術制備獲得。所使用的表達載體和宿主細胞均為重組技術為公眾所知的。表達載體例如pet載體、pgex載體；宿主細胞例如大腸桿菌(e.coli)，放線菌(actinomycetes)，芽孢桿菌(bacillus)，鏈霉菌(streptomyces)，本發明所述的多肽可用常規的酶切方法將其從宿主細胞中分離，也可以通過常規的液相色譜法進行分離和純化，上述的分離純化方法都是本領域技術人員公知的技術。

本發明還提供編碼前述多肽的核苷酸，其為seqidno.2所示的核苷酸序列。

本發明還提供含有前述多肽的組合物。

所述多肽或所述多肽組合物可制備成藥學上可接受的載體，包括但不限于膠囊、片劑、錠劑、丸劑、滴丸、栓劑、噴霧、乳膏、貼劑等形式。

本發明所述多肽對小腸結腸炎耶爾森菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有顯著抑菌效果，通過電鏡掃描發現其主要通過破壞細菌細胞膜的完整性從而抑制細菌?？捎糜谥苽淇剐∧c結腸炎耶爾森菌、抗大腸桿菌、抗金黃色葡萄球菌的藥物。

附圖說明

圖1為試驗例1中β-casein197的抑菌效果圖；

圖2為試驗例2中β-casein197熒光顯微鏡下觀察的染色結果；

圖3為試驗例3的試驗菌在β-casein197處理下的掃描電鏡圖；

圖4為試驗例3的試驗菌在β-casein197處理下的透射電鏡圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步說明。

實施例1

委托上?？齐纳锟萍加邢薰就ㄟ^固相法合成如下seqidno.1所示序列：

leu-leu-asn-gln-glu-leu-leu-leu-asn-pro-thr-his-gln-ile-tyr-pro-val

這是十七個氨基酸組成的多肽，通過在線工具獲取前述多肽序列的主要生物學參數如下：

等電點(pi)為5.24，分子質量(mw)2005.34da，較低的相對分子質量表明該抗菌多肽不易被蛋白酶水解。不穩定系數為33.2，表明該抗菌多肽較為穩定，不易被胃酸所降解破壞。脂溶指數和親水性分別為154.71和0.106，表現為弱的疏水性。

上述序列為來源于人類母乳中β-酪蛋白的天然序列，除了通過化學固相合成法獲得，還可以通過對長鏈多肽通過生物酶切技術獲得，亦可通過宿主微生物或細胞內克隆并表達攜帶編碼所述多肽之一的核苷酸序列的dna片段，通過現有的重組dna技術制備獲得。

所使用的表達載體和宿主細胞均為重組技術為公眾所知的。表達載體例如pet載體、pgex載體；宿主細胞例如大腸桿菌(e.coli)，放線菌(actinomycetes)，芽孢桿菌(bacillus)，鏈霉菌(streptomyces)，本發明所述的多肽可用常規的酶切方法將其從宿主細胞中分離，也可以通過常規的液相色譜法進行分離和純化，上述的分離純化方法都是本領域技術人員公知的技術。

編碼上述多肽的核苷酸序列對應如下：

ctgctcaaccaagaacttctacttaaccccacccaccagatctaccctgtg

實施例2

實施例1所述的多肽可以單獨應用，除此之外，這些多肽還可以多肽組合物聯合使用。多肽組合物中包含序列為seqidno.1的多肽。

實施例3

本實施例提供前述實施例1所述的一種多肽，或者實施例2所述的多肽組合物可制備成藥學上可接受的載體，例如：膠囊、片劑、錠劑、丸劑、滴丸、栓劑、噴霧、乳膏、貼劑等形式。

試驗例1抑菌試驗

抗菌多肽的合成與稀釋

本試驗實施例1中固相合成獲得的抗菌多肽β-casein197多肽分別為例。取1mg多肽，用無菌雙蒸水稀釋成1mg/ml-20℃儲存備用。

菌株及培養

大腸桿菌(e.coli，atcc25922)、金黃色葡萄球菌(s.aureus，atcc25923)和小腸結腸炎耶爾森菌(y.enterocolitica，actt23715)來源于美國菌種保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)。每3ml無菌lb培養基中(胰蛋白胨10g/l，酵母膏提取物5g/l，nacl10g/l)接種30ul菌種，于37℃恒溫搖動培養至生長對數期。通過手持式細胞計數儀(milliporescepter2.0)檢測細菌濃度至1,000-5,000cfu/ml。

抑菌實驗

lb固態培養基(lb培養基加入瓊脂粉15g/l)，高溫高壓滅菌后冷卻至50℃左右倒入10cm無菌培養皿中。采用瓊脂糖孔穴擴散法即將兩種處于生長對數期試驗菌分別均勻接種至lb瓊脂平板后，將帶有β-casein197或無菌水(對照組)的無菌紙片放置于接種試驗菌的lb瓊脂平板。抗菌多在瓊脂膠內向四周自由擴散，其濃度隨擴散距離增大而降低，在藥物一定的擴散距離內，由于抗菌多的抗菌效應，試驗菌不能生長，此無菌生長的范圍稱為抑菌圈，抑菌圈的大小與抗菌多的抑菌效應成正比。

如圖1所示，圖1是針對β-casein197的抑菌實驗結果。其中，上排為對照組，下排為分別接種三種實驗菌的試驗組。從圖1中可以看出，加入多肽的紙片周圍出現了明顯的抑菌圈，而對照組(加滅菌雙蒸水)則沒有明顯抑制區域，表明序列β-casein197對三種實驗菌具有明顯的抑制作用。

試驗例2免疫熒光試驗

采用live/deadbaclightkitl13152檢測試劑盒(thermofisher，usa)。將試劑盒內的a液和b液混合于5ml無菌雙蒸水，綠色熒光核酸染料(syto9)終濃度為6um，紅色熒光核酸染料(propidiumiodide，pi)終濃度為30um。細菌膜完整的顯示綠色，膜破裂的顯示紅色。

準備25ml菌液，室溫10,000rpm離心10min，去除上清液，保留沉淀。用2ml0.85％nacl溶液重懸沉淀。取1ml重懸液加入含20ml0.85％nacl溶液的50ml離心管中，室溫孵育1h，每15min混合一次。1小時后室溫10,000rpm離心10min，并用0.85％nacl溶液洗滌2次后用10ml0.85％nacl溶液重懸。每毫升細菌懸液中加入3ul染色劑混合物徹底混勻，室溫避光孵育15min。取5ul反應液滴至載玻片并蓋上18mm蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察。

通過免疫熒光試驗，如圖2所示，與對照組相比，β-casein197處理組中，紅色熒光增多(菌體細胞膜破裂，pi進入細胞核與核酸結合，顯示紅色熒光)，綠色熒光減少(菌體細胞膜完整，染成綠色)，說明該β-casein197對金黃色葡萄球菌和小腸結腸炎耶爾森菌均具有明顯的殺傷作用。

試驗例3電鏡觀察試驗

處于對數生長期的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和小腸結腸炎耶爾森菌分別于室溫12,000離心3min后，用0.1m的pbs洗滌一次，并用pbs重懸。通過手持式細胞計數儀(milliporescepter2.0)將菌液濃度調整為1×10⁸cfu/ml，并分別與抗菌多肽于37℃孵育1h，使抗菌多肽終濃度為100ug/ml，細菌與無菌雙蒸水混合作為對照。1小時后，菌液多肽混合物于室溫12,000離心3min，0.1m的pbs洗滌兩次，去除上清液。

2.5％的戊二醛4℃固定4h，30％-50％-70％-90％-100％乙醇梯度脫水，每步驟15min并吹打混勻；將脫水后的菌液滴加之載玻片，通風廚干燥后將樣品分別在-20℃、-20℃和-80℃冷凍過夜；樣品送至南京醫科大學進行掃描電鏡觀察；2.5％的戊二醛4℃固定4h，樣品送至南京醫科大學進行透射電鏡觀察。

通過掃描電鏡發現，多肽處理組中，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和小腸結腸炎耶爾森菌均觀察到細胞膜邊緣粗糙不清晰的紊亂結構(如圖3試驗組所示)，而對照組中均為完整連續光滑的膜結構，說明β-casein197通過破壞細菌細胞膜從而抑制細菌；進一步借助透射電鏡可以清晰的觀察到抗菌多肽對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和小腸結腸炎耶爾森菌的破壞。與對照組相比，β-casein197和β-casein213處理組中，細菌細胞膜幾乎被完全破壞，出現大量氣泡樣結構，細胞內容物外泄，肌動蛋白細胞骨架幾乎無法識別(如圖4試驗組所示)，進一步說明了本發明的抗菌多肽對細菌的殺傷是通過破壞細菌細胞膜的完整性，使其失去活力。

<110>南京市婦幼保健院

<120>一種母乳內源性抗菌多肽及其應用

<130>17nj2v0070009

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