本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種分離的內(nèi)源性抗菌多肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自1939年第一種抗菌肽(antimicrobialpeptides，amps)從土壤芽孢桿菌中被分離以來(lái)，在不同生物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了2490多種抗菌肽，并且新的抗菌肽還在不斷地開發(fā)和鑒定中。抗菌肽是一類由5～100個(gè)氨基酸組成的寡肽，具有廣譜的抗菌活性，作用靶標(biāo)包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲以及腫瘤細(xì)胞等，使它迅速成為潛在的治療藥物。

抗菌肽的殺菌機(jī)制包括通過(guò)破壞細(xì)胞膜的完整性，抑制蛋白、dna和rna的合成，或與胞內(nèi)某些特定的靶標(biāo)相結(jié)合從而殺死細(xì)菌。一般來(lái)說(shuō)，一種抗菌肽僅對(duì)一類微生物有效，但是也有一些例外的抗菌肽針對(duì)不同的微生物具有不同的殺傷機(jī)制，例如抗菌肽indolicidin不僅可以通過(guò)滲透細(xì)胞抑制dna的合成殺傷大腸桿菌，而且可以通過(guò)損傷真菌細(xì)胞膜殺傷真菌，還可以抑制hiv-整合酶抑制hiv活性。還有一些抗菌肽對(duì)不同類型微生物具有相同的殺傷模式，pmap-23能夠在細(xì)胞膜形成孔隙殺死真菌和寄生蟲。抗菌肽不僅可以破壞微生物細(xì)胞膜而且可以抑制功能蛋白的合成產(chǎn)生快速殺傷效應(yīng)的獨(dú)特機(jī)制使其成為理想的抗生素替代品。耐藥菌、生物被膜、滯留菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素具有很強(qiáng)的抗性，并且它們?cè)诟腥局邪l(fā)揮著重要作用。利用抗菌肽破壞細(xì)胞膜的效應(yīng)殺死耐藥菌以及對(duì)生物被膜基質(zhì)蛋白酶的作用清除生物被膜，可以有效控制感染的發(fā)生，因此具有潛在的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

由于治療感染的抗生素有效性的降低，使得越來(lái)越多的感染性疾病如肺炎、結(jié)核病等變得更難治療。2017年2月27日，世界衛(wèi)生組織(who)發(fā)布了迫切需要新型抗生素的細(xì)菌清單，該清單強(qiáng)調(diào)了抗生素耐藥菌的威脅性問(wèn)題以及對(duì)新型抗生素需求的迫切性。與抗生素類和小分子藥物相比，多肽類藥物不僅具有廣譜的抗菌活性，不易產(chǎn)生耐藥性，而且具有活性強(qiáng)、毒性低、免疫原性小等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，受到越來(lái)越多的關(guān)注，lloydczaplewsk等人更是將抗真肽列為抗生素最理想的替代物。母乳中除富含蛋白質(zhì)外，還有豐富的多肽，是含量豐富的天然肽庫(kù)之一。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)母乳中含有超過(guò)300種內(nèi)源性多肽，如母乳β-防御素-2(hbd2)的和人乳鐵蛋白來(lái)源的短hlf(1-11)被證實(shí)具有廣譜的抗菌活性，且無(wú)耐受性和毒副作用，展現(xiàn)出母乳內(nèi)源性多肽作為抗菌藥物的良好潛質(zhì)。因此，從母乳內(nèi)源性多肽的角度進(jìn)一步尋找抗菌肽將會(huì)給臨床抗感染帶來(lái)新的治療手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種分離的內(nèi)源性抗菌多肽，本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供編碼前述多肽的核苷酸，本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供含有前述核苷酸序列的表達(dá)載體；本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供前述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供含有前述多肽的組合物；本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供前述多肽在制備抗小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌藥物上的應(yīng)用。

技術(shù)方案：本發(fā)明所述的一種分離的內(nèi)源性抗菌多肽，其通式為：

x-val-thr-gln-pro-leu-ala-pro-val-his-asn-pro-ile-ser-y

其中，x為nh2-或tyr-pro-；y為-val或-oh。

本發(fā)明所述的內(nèi)源性的抗菌多肽來(lái)源于人類母乳中的β-酪蛋白，其含有氨基酸序列val-thr-gln-pro-leu-ala-pro-val-his-asn-pro-ile-ser，在該序列的氨基酸和/或羧基端添加特殊小分子基團(tuán)后，其具備更優(yōu)秀的抑菌效果。

具體地說(shuō)，所述內(nèi)源性抗菌多肽選自如下序列的任意一種：

seqidno.5：val-thr-gln-pro-leu-ala-pro-val-his-asn-pro-ile-ser-val；

seqidno.6：tyr-pro-val-thr-gln-pro-leu-ala-pro-val-his-asn-pro-ile-ser；

seqidno.7：val-thr-gln-pro-leu-ala-pro-val-his-asn-pro-ile-ser；

seqidno.8：tyr-pro-val-thr-gln-pro-leu-ala-pro-val-his-asn-pro-ile-ser-val。

本發(fā)明的多肽對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易在體內(nèi)降解。所述多肽的獲得可按照氨基酸序列通過(guò)固相合成方法獲得；或者通過(guò)宿主微生物或細(xì)胞內(nèi)克隆并表達(dá)攜帶編碼所述多肽之一的核苷酸序列的dna片段，通過(guò)現(xiàn)有的重組dna技術(shù)制備獲得。所使用的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞均為重組技術(shù)為公眾所知的。表達(dá)載體例如pet載體、pgex載體；宿主細(xì)胞例如大腸桿菌(e.coli)，放線菌(actinomycetes)，芽孢桿菌(bacillus)，鏈霉菌(streptomyces)，本發(fā)明所述的多肽可用常規(guī)的酶切方法將其從宿主細(xì)胞中分離，也可以通過(guò)常規(guī)的液相色譜法進(jìn)行分離和純化，上述的分離純化方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)。

本發(fā)明還提供編碼前述多肽的核苷酸，其為seqidno.5至seqidno.8的核苷酸序列。

所述多肽可以單獨(dú)應(yīng)用，本發(fā)明還提供一種多肽組合物，該組合物同時(shí)含有seqidno.5和seqidno.6的多肽。

所述多肽或所述多肽組合物可制備成藥學(xué)上可接受的載體，包括但不限于膠囊、片劑、錠劑、丸劑、滴丸、栓劑、噴霧、乳膏、貼劑等形式。

本發(fā)明所述多肽對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有顯著抑菌效果，通過(guò)電鏡掃描發(fā)現(xiàn)其主要通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性從而抑制細(xì)菌。可用于制備抗小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、抗大腸桿菌、抗金黃色葡萄球菌的藥物。

附圖說(shuō)明

圖1為試驗(yàn)例1中β-casein213的抑菌效果圖；

圖2為試驗(yàn)例1中β-casein211的抑菌效果圖；

圖3為試驗(yàn)例2中β-casein213熒光顯微鏡下觀察的染色結(jié)果；

圖4為試驗(yàn)例2中β-casein211熒光顯微鏡下觀察的染色結(jié)果；

圖5為試驗(yàn)例3的試驗(yàn)菌在β-casein213處理下的掃描電鏡圖；

圖6為試驗(yàn)例3的試驗(yàn)菌在β-casein211處理下的掃描電鏡圖；

圖7為試驗(yàn)例3的試驗(yàn)菌在β-casein213處理下的透射電鏡圖；

圖8為試驗(yàn)例3的試驗(yàn)菌在β-casein211處理下的透射電鏡圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1

委托上海科肽生物科技有限公司通過(guò)固相法合成如下序列：

seqidno.5vtqplapvhnpisv

seqidno.6ypvtqplapvhnpis

seqidno.7vtqplapvhnpis

seqidno.8ypvtqplapvhnpisv

通過(guò)在線工具獲取前述多肽序列的主要生物學(xué)參數(shù)如下：

seqidno.5

等電點(diǎn)(pi)為6.71，分子質(zhì)量(mw)為1471.72da，具有14個(gè)氨基酸，較低的相對(duì)分子質(zhì)量表明該抗菌多肽不易被蛋白酶水解。不穩(wěn)定系數(shù)為53.96，表明該抗菌多肽較為穩(wěn)定，不易被胃酸所降解破壞。脂溶指數(shù)和親水性分別為125和0.443，表現(xiàn)為疏水性。

seqidno.6

等電點(diǎn)(pi)為6.74，分子質(zhì)量(mw)為1632.88da，具有15個(gè)氨基酸，較低的相對(duì)分子質(zhì)量表明該抗菌多肽不易被蛋白酶水解。不穩(wěn)定系數(shù)為72.10，表明該抗菌多肽較為穩(wěn)定，不易被胃酸所降解破壞。脂溶指數(shù)和親水性分別為97.33和-0.060，表現(xiàn)為弱的親水性。

seqidno.7和seqidno.8是基于前述序列經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單加工獲得的序列，相似性超過(guò)90％，相關(guān)生物學(xué)參數(shù)與seqidno.5和seqidno.6相似。

seqidno.7

等電點(diǎn)(pi)為6.71，分子質(zhì)量(mw)為1372.59da，具有13個(gè)氨基酸，較低的相對(duì)分子質(zhì)量表明該抗菌多肽不易被蛋白酶水解。不穩(wěn)定系數(shù)為57.35，表明該抗菌多肽較為穩(wěn)定，不易被胃酸所降解破壞。脂溶指數(shù)和親水性分別為112.31和0.159，表現(xiàn)為弱的疏水性。

seqidno.8

等電點(diǎn)(pi)為6.74，分子質(zhì)量(mw)為1732.01da，具有16個(gè)氨基酸，較低的相對(duì)分子質(zhì)量表明該抗菌多肽不易被蛋白酶水解。不穩(wěn)定系數(shù)為68.22，表明該抗菌多肽較為穩(wěn)定，不易被胃酸所降解破壞。脂溶指數(shù)和親水性分別為109.38和0.206，表現(xiàn)為弱的疏水性。

上述四個(gè)序列為來(lái)源于人類母乳中β-酪蛋白的天然序列，或經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單修飾的人工序列。以上四個(gè)序列除了通過(guò)化學(xué)固相合成法獲得，還可以通過(guò)對(duì)長(zhǎng)鏈多肽通過(guò)生物酶切技術(shù)獲得，亦可通過(guò)宿主微生物或細(xì)胞內(nèi)克隆并表達(dá)攜帶編碼所述多肽之一的核苷酸序列的dna片段，通過(guò)現(xiàn)有的重組dna技術(shù)制備獲得。

所使用的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞均為重組技術(shù)為公眾所知的。表達(dá)載體例如pet載體、pgex載體；宿主細(xì)胞例如大腸桿菌(e.coli)，放線菌(actinomycetes)，芽孢桿菌(bacillus)，鏈霉菌(streptomyces)，本發(fā)明所述的多肽可用常規(guī)的酶切方法將其從宿主細(xì)胞中分離，也可以通過(guò)常規(guī)的液相色譜法進(jìn)行分離和純化，上述的分離純化方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)。

編碼上述多肽的核苷酸序列對(duì)應(yīng)如下：

seqidno.1，編碼氨基酸β-casein213：gtgactcagccacttgccccagttcataaccccattagtgtc；

seqidno.2，編碼氨基酸β-casein211：taccctgtgactcagccacttgccccagttcataaccccattagt；

seqidno.3，編碼氨基酸β-casein210：gtgactcagccacttgccccagttcataaccccattagt；

seqidno.4，編碼氨基酸β-casein215：taccctgtgactcagccacttgccccagttcataaccccattagtgtc。

實(shí)施例2

實(shí)施例1所述的多肽可以單獨(dú)應(yīng)用，除此之外，這些多肽還可以多肽組合物聯(lián)合使用。多肽組合物中包含序列為seqidno.5至seqidno.8中至少兩個(gè)多肽，優(yōu)選至少包含序列為seqidno.5和seqidno.6兩種多肽序列。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供前述實(shí)施例1所述的一種多肽，或者實(shí)施例2所述的多肽組合物可制備成藥學(xué)上可接受的載體，例如：膠囊、片劑、錠劑、丸劑、滴丸、栓劑、噴霧、乳膏、貼劑等形式。

試驗(yàn)例1抑菌試驗(yàn)

抗菌多肽的合成與稀釋

本試驗(yàn)實(shí)施例1中固相合成獲得的抗菌多肽β-casein213和β-casein211多肽分別為例。取1mg多肽，用無(wú)菌雙蒸水稀釋成1mg/ml-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

菌株及培養(yǎng)

大腸桿菌(e.coli，atcc25922)、金黃色葡萄球菌(s.aureus，atcc25923)和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(y.enterocolitica，actt23715)來(lái)源于美國(guó)菌種保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)。每3ml無(wú)菌lb培養(yǎng)基中(胰蛋白胨10g/l，酵母膏提取物5g/l，nacl10g/l)接種30ul菌種，于37℃恒溫?fù)u動(dòng)培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。通過(guò)手持式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(milliporescepter2.0)檢測(cè)細(xì)菌濃度至1,000-5,000cfu/ml。

抑菌實(shí)驗(yàn)

lb固態(tài)培養(yǎng)基(lb培養(yǎng)基加入瓊脂粉15g/l)，高溫高壓滅菌后冷卻至50℃左右倒入10cm無(wú)菌培養(yǎng)皿中。采用瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法即將兩種處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期試驗(yàn)菌分別均勻接種至lb瓊脂平板后，將帶有β-casein213/β-casein211或無(wú)菌水(對(duì)照組)的無(wú)菌紙片放置于接種試驗(yàn)菌的lb瓊脂平板。抗菌多在瓊脂膠內(nèi)向四周自由擴(kuò)散，其濃度隨擴(kuò)散距離增大而降低，在藥物一定的擴(kuò)散距離內(nèi)，由于抗菌多的抗菌效應(yīng)，試驗(yàn)菌不能生長(zhǎng)，此無(wú)菌生長(zhǎng)的范圍稱為抑菌圈，抑菌圈的大小與抗菌多的抑菌效應(yīng)成正比。

如圖1所示，圖1是針對(duì)β-casein213的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，是上排為對(duì)照組，左圖下排為接種金黃色為葡萄球菌的試驗(yàn)組，右圖下排為接種小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的試驗(yàn)組。加入多肽的紙片周圍出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，而對(duì)照組(加滅菌雙蒸水)則沒有明顯抑制區(qū)域，表明序列β-casein213對(duì)金黃色葡萄球菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均具有明顯的抑制作用。

如圖2所示，圖2是針對(duì)β-casein211的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，是上排為對(duì)照組，左圖下排為接種大腸桿菌的試驗(yàn)組，右圖下排為接種小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的試驗(yàn)組，加入多肽的紙片周圍出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，而對(duì)照組(加滅菌雙蒸水)則沒有明顯抑制區(qū)域，表明序列β-casein211對(duì)大腸桿菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均具有明顯的抑制作用。

試驗(yàn)例2免疫熒光試驗(yàn)

采用live/deadbaclightkitl13152檢測(cè)試劑盒(thermofisher，usa)。將試劑盒內(nèi)的a液和b液混合于5ml無(wú)菌雙蒸水，綠色熒光核酸染料(syto9)終濃度為6um，紅色熒光核酸染料(propidiumiodide，pi)終濃度為30um。細(xì)菌膜完整的顯示綠色，膜破裂的顯示紅色。

準(zhǔn)備25ml菌液，室溫10,000rpm離心10min，去除上清液，保留沉淀。用2ml0.85％nacl溶液重懸沉淀。取1ml重懸液加入含20ml0.85％nacl溶液的50ml離心管中，室溫孵育1h，每15min混合一次。1小時(shí)后室溫10,000rpm離心10min，并用0.85％nacl溶液洗滌2次后用10ml0.85％nacl溶液重懸。每毫升細(xì)菌懸液中加入3ul染色劑混合物徹底混勻，室溫避光孵育15min。取5ul反應(yīng)液滴至載玻片并蓋上18mm蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察。

通過(guò)免疫熒光試驗(yàn)，如圖3所示，與對(duì)照組相比，b-casein213處理組中，紅色熒光增多(菌體細(xì)胞膜破裂，pi進(jìn)入細(xì)胞核與核酸結(jié)合，顯示紅色熒光)，綠色熒光減少(菌體細(xì)胞膜完整，染成綠色)，說(shuō)明該β-casein213對(duì)金黃色葡萄球菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均具有明顯的殺傷作用。

如圖4所示，β-casein211多肽處理組中，紅色熒光增多(菌體細(xì)胞膜破裂，pi進(jìn)入細(xì)胞核與核酸結(jié)合，顯示紅色熒光)，綠色熒光減少(菌體細(xì)胞膜完整，染成綠色)，說(shuō)明β-casein211對(duì)大腸桿菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均具有明顯的殺傷作用。

試驗(yàn)例3電鏡觀察試驗(yàn)

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分別于室溫12,000離心3min后，用0.1m的pbs洗滌一次，并用pbs重懸。通過(guò)手持式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(milliporescepter2.0)將菌液濃度調(diào)整為1×10⁸cfu/ml，并分別與抗菌多肽于37℃孵育1h，使抗菌多肽終濃度為100ug/ml，細(xì)菌與無(wú)菌雙蒸水混合作為對(duì)照。1小時(shí)后，菌液多肽混合物于室溫12,000離心3min，0.1m的pbs洗滌兩次，去除上清液。

2.5％的戊二醛4℃固定4h，30％-50％-70％-90％-100％乙醇梯度脫水，每步驟15min并吹打混勻；將脫水后的菌液滴加之載玻片，通風(fēng)廚干燥后將樣品分別在-20℃、-20℃和-80℃冷凍過(guò)夜；樣品送至南京醫(yī)科大學(xué)進(jìn)行掃描電鏡觀察；2.5％的戊二醛4℃固定4h，樣品送至南京醫(yī)科大學(xué)進(jìn)行透射電鏡觀察。

通過(guò)掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，抗菌多肽處理組中，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均觀察到細(xì)胞膜邊緣粗糙不清晰的紊亂結(jié)構(gòu)(如圖5、圖6試驗(yàn)組所示)，而對(duì)照組中均為完整連續(xù)光滑的膜結(jié)構(gòu)(如圖5、圖6對(duì)照組所示)，說(shuō)明β-casein211和β-casein213通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜從而抑制細(xì)菌；進(jìn)一步借助透射電鏡可以清晰的觀察到抗菌多肽對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的破壞。與對(duì)照組相比，β-casein211和β-casein213處理組中，細(xì)菌細(xì)胞膜幾乎被完全破壞，出現(xiàn)大量氣泡樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架幾乎無(wú)法識(shí)別(如圖7、圖8試驗(yàn)組所示)，進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明的抗菌多肽對(duì)細(xì)菌的殺傷是通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，使其失去活力。

<110>南京市婦幼保健院

<120>一種分離的內(nèi)源性抗菌多肽及其應(yīng)用

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