本發明涉及生物工程技術領域，具體是一段抑癌基因編碼抗腫瘤肽，其特征為重組人pias387-121位氨基酸，以合成肽的形式發揮其抗腫瘤作用。本發明研究了多種腫瘤，并篩選到了對這種肽敏感的多種腫瘤。

背景技術：

癌癥是全球發病和死亡的主要原因，在未來20年中，估計每年癌癥病例將由2012年的1400萬上升到2200萬。因此，加強治療腫瘤的研究，探索新的治療途徑具有十分重要的意義。目前，全球多肽藥物的市場已經超過200億美元，占醫藥品市場總分額的2％左右，但持10％左右的高速增長率。按照2014年總銷售額排名，40億美元以上的有一個，20億美元以上的有三個，十億美元以上的有七個，由此可見以生物手段研究多肽藥物具有可觀的市場前景。

我們發現腫瘤組織中的表達蛋白缺少某段多肽序列后喪失了抑癌功能，故推測此多肽具有抑癌效應。所以，在此發明中我們利用合成肽技術，合成35個氨基酸(aminoacid)的多肽，將此多肽加藥到腫瘤細胞中并通過腹腔注射注射到裸鼠體內，證明其獨特的抑制多種腫瘤生長的抗腫瘤效應并篩選到了對這種肽敏感的多種腫瘤，包括人胃癌sgc-7901細胞、人肝癌hepg-2細胞、人前列腺癌du145細胞、人黑色素瘤a375細胞、人轉移性乳腺癌mda-mb-231細胞、人宮頸癌hela細胞、人非小細胞肺癌a549細胞、人腦膠質瘤u251細胞、人結腸癌ht-29細胞、人非轉移性mcf-7細胞、人直腸癌sw480細胞。發明為腫瘤治療開發新的靶點提供實驗依據，對于應用于腫瘤的臨床治療具有十分重要的開發應用前景。

技術實現要素：

本發明是基于腫瘤發生特點和治療難點，利用生物合成技術，發明一段抑癌基因編碼抗腫瘤肽，其特征為重組人pias387-121位氨基酸，以合成肽的形式發揮其抗腫瘤作用。重組蛋白序列長為35aa多肽，發明保護重組抑癌多肽序列為：

接著對多肽的抗腫瘤功能進行了研究，細胞學和裸鼠體內實驗表明此多肽具有抑制腫瘤細胞活性和抑制小鼠成瘤模型生長的重要抗癌功能。

本發明以肽的形式來研究抗腫瘤的氨基酸序列對腫瘤的作用，對人胃癌sgc-7901細胞、人肝癌hepg-2細胞、人前列腺癌du145細胞、人黑色素瘤a375細胞、人轉移性乳腺癌mda-mb-231細胞、人宮頸癌hela細胞、人非小細胞肺癌a549細胞具有較顯著的生長抑制效應，對人腦膠質瘤u251細胞、人結腸癌ht-29細胞、人非轉移性mcf-7細胞、人直腸癌sw480細胞也有一定抑制作用，對人腎上皮293細胞、人乳腺上皮mcf-10a細胞無細胞毒性。

第一步：細胞學水平進行多肽抗腫瘤功能的檢測

將重組肽加藥到腫瘤細胞后，48小時后檢測細胞活性，mtt結果顯示此多肽具有顯著抑制腫瘤細胞增殖的作用。

第二步：動物學水平進行多肽抗腫瘤功能的檢測

構建裸鼠皮下腫瘤模型，10天后待腫瘤體積均成0.2cm³，且每只鼠均有4處成瘤時即可給藥，每天腹腔給藥一次，每周測量兩次測量腫瘤大小及裸鼠體重，繪制生長曲線，31天后，處死裸鼠，剝離腫瘤，稱量重量，實驗結果顯示此多肽顯著抑制腫瘤細胞生長。

附圖說明：

圖1a.mtt實驗檢測35aa多肽對人胃癌sgc-7901細胞增殖的抑制率

圖1b.mtt實驗檢測35aa多肽對人肝癌hepg-2細胞增殖的抑制率

圖1c.mtt實驗檢測35aa多肽對人前列腺癌du145細胞增殖的抑制率

圖1d.mtt實驗檢測35aa多肽對人黑色素瘤a375細胞增殖的抑制率

圖1e.mtt實驗檢測35aa多肽對人轉移性乳腺癌mda-mb-231細胞增殖的抑制率

圖1f.mtt實驗檢測35aa多肽對人宮頸癌hela細胞增殖的抑制率

圖1g.mtt實驗檢測35aa多肽對人非小細胞肺癌a549細胞增殖的抑制率

圖2a.mtt實驗檢測35aa多肽對人腦膠質瘤u251細胞增殖的抑制率

圖2b.mtt實驗檢測35aa多肽對人結腸癌ht-29細胞增殖的抑制率

圖2c.mtt實驗檢測35aa多肽對人非轉移性mcf-7細胞增殖的抑制率

圖2d.mtt實驗檢測35aa多肽對人直腸癌sw480細胞增殖的抑制率

圖3a.mtt實驗檢測35aa多肽對人腎上皮293細胞增殖無明顯毒性

圖3b.mtt實驗檢測35aa多肽對人乳腺上皮mcf-10a細胞增殖無明顯毒性

圖4a.sgc-7901細胞裸鼠成瘤模型腫瘤生長大小圖

圖4b.du145細胞裸鼠成瘤模型腫瘤生長大小圖

圖4c.mda-mb-231細胞裸鼠成瘤模型腫瘤生長大小圖

圖5a.hepg-2細胞裸鼠成瘤模型腫瘤生長曲線圖

圖5b.a375細胞裸鼠成瘤模型腫瘤生長曲線圖

圖5c.a549細胞裸鼠成瘤模型腫瘤生長曲線圖

圖6a.hepg-2細胞裸鼠成瘤模型腫瘤生長大小圖

圖6b.a375細胞裸鼠成瘤模型腫瘤生長大小圖

圖6c.a549細胞裸鼠成瘤模型腫瘤生長大小圖

圖7a.hepg-2細胞裸鼠成瘤模型腫瘤重量圖

圖7b.a375細胞裸鼠成瘤模型腫瘤重量圖

圖7c.a549細胞裸鼠成瘤模型腫瘤重量圖

圖8a.hepg-2細胞裸鼠成瘤模型裸鼠體重圖

圖8b.a375細胞裸鼠成瘤模型裸鼠體重圖

圖8c.a549細胞裸鼠成瘤模型裸鼠體重圖

具體實施方式：

實施例一：mtt實驗證明重組肽細胞水平的抗腫瘤效應

本發明以合成肽的形式發揮其抗腫瘤作用，mtt實驗證明此多肽對人胃癌sgc-7901細胞、人肝癌hepg-2細胞、人前列腺癌du145細胞、人黑色素瘤a375細胞、人轉移性乳腺癌mda-mb-231細胞、人宮頸癌hela細胞、人非小細胞肺癌a549細胞、人腦膠質瘤u251細胞、人結腸癌ht-29細胞、人非轉移性mcf-7細胞、人直腸癌sw480細胞具有生長抑制效應。

以一種癌細胞為例，將癌細胞分別以20000個/孔的密度接種于96孔培養板，16小時后將35aa多肽和其它對照組加藥到sgc-7901細胞，48小時后每孔加入10ul5mg/ml的mtt(mtt用pbs配制，過濾除菌，分裝在4℃保存)，4小時后，棄培養基，加入150ul/孔dmso，震蕩10min,在490nm測量吸收值。吸收值大小反映了細胞活性，使用公式(抑制率＝1-加藥組od值/對照組od值×100％)求出各組抑制率，根據實驗數據，以濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標做圖。mtt結果顯示，35aa多肽實驗組顯著抑制了胃癌sgc-7901細胞的增殖，如【圖1a】所示。我們也發現了其對包括肝癌、前列腺癌、黑色素瘤、轉移性乳腺癌、宮頸癌、非小細胞肺癌腫瘤細胞具有較顯著的生長抑制效應，如【圖1b-g】所示。對非轉移性乳腺癌、結腸-直腸癌、腦膠質瘤腫瘤細胞也有一定抑制作用，如【圖2a-d】。而對人胚腎細胞hek293，如【圖3a】，人乳腺上皮細胞mcf-10a，如【圖3b】，重組肽無細胞毒性。

實施例二：裸鼠成瘤模型證明重組肽體內水平的抗腫瘤效應

本發明以合成肽的形式發揮其抗腫瘤作用，裸鼠成瘤模型證明此多肽對人胃癌sgc-7901細胞、人前列腺癌du145細胞、人轉移性乳腺癌mda-mb-231細胞、人肝癌hepg-2細胞、人黑色素瘤a375細胞、人非小細胞肺癌a549細胞有生長抑制效應。

以一種癌荷瘤裸鼠模型為例，將癌細胞在37℃、95％濕度和5％co2孵箱中培養，增殖若干板后，胰酶消化細胞，無血清dmem培養基重懸細胞，搜集1×10⁷細胞，注射于6月齡裸鼠皮下，每只鼠注射4點，分別位于背側肩胛骨處及腹側腹股溝處，每點注射約1×10⁷個細胞，10天后待腫瘤體積均成0.2cm³，且每只鼠均有4處成瘤時即可給藥，經分組將裸鼠分為兩組：生理鹽水對照組和pias3deta肽(10mg/kg)組，每組兩只裸鼠。將2×10⁴ug/ml的藥物配置成1mg/ml濃度后，腹腔注射200ul/只鼠(裸鼠體重約為20g)，持續腹腔給藥30天后處死裸鼠，剝出腫瘤并拍照稱重。實驗結果顯示，在胃癌sgc-7901細胞荷瘤裸鼠中，與生理鹽水對照組相比，pias3deta肽(10mg/kg)組腫瘤明顯較小，如腫瘤生長大小圖【圖4a】,所示，表明此35aa多肽具有顯著地抑制腫瘤模型生長的功效，同時，我們發現此35aa多肽在前列腺癌和乳腺癌中有相同的效應，腫瘤生長曲線圖【圖4b-c】。

此外，以另一種荷瘤裸鼠模型為例，將癌細胞在37℃、95％濕度和5％co2孵箱中培養，增殖若干板后，胰酶消化細胞，無血清dmem培養基重懸細胞，搜集1×10⁷細胞，注射于6月齡裸鼠皮下，每只鼠注射4點，分別位于背側肩胛骨處及腹側腹股溝處，每點注射約1×10⁷個細胞，10天后待腫瘤體積均成0.2cm³，且每只鼠均有4處成瘤時即可給藥，經分組將裸鼠分為六組：對照肽組、低濃度組(3mg/kg)、中濃度組(10mg/kg)、高濃度組(30mg/kg)、順鉑組(1mg/kg)、順鉑+中濃度組，每組四只裸鼠。將50％純度的藥物粉末配置成相應濃度后，腹腔注射200ul/只鼠(裸鼠體重約為20g)，每周測量兩次裸鼠腫瘤體積及裸鼠體重，持續腹腔給藥31天后處死裸鼠，剝出腫瘤并拍照稱重。實驗結果顯示，在肝癌hepg-2細胞荷瘤裸鼠中，與對照肽組相比，中濃度組(10mg/kg)、高濃度組(30mg/kg)腫瘤模型雖不如順鉑，但遠遠好于對照肽，如表1-1、表3及腫瘤生長曲線圖【圖5a】、腫瘤生長大小圖【圖6a】、腫瘤重量圖【圖7a】所示，再次表明此35aa多肽具有顯著地抑制腫瘤模型生長的功效，且最適劑量是10mg/kg，同時，我們發現此35aa多肽在黑色素瘤和肺癌中有相同的效應，如表1-2、表1-3、表3及腫瘤生長曲線圖【圖5b-c】、腫瘤生長大小圖【圖6b-c】、腫瘤重量圖【圖7b-c】。

我們又通過測量裸鼠體重，證明順鉑組及順鉑+中濃度組裸鼠體重明顯下降，而肽類藥物組并無此副作用，進一步證明了此多肽在裸鼠體內無毒性，具有安全性，如表2-1、表2-2、表2-3及【圖8a-c】。

表1-1連續給藥31天hepg-2細胞裸鼠成瘤模型腫瘤體積(單位cm³)

表1-2連續給藥31天a375細胞裸鼠成瘤模型腫瘤體積(單位cm³)

表1-3連續給藥31天a549細胞裸鼠成瘤模型腫瘤體積(單位cm³)

表2-1連續給藥31天hepg-2細胞裸鼠成瘤模型裸鼠體重(單位：g)

表2-2連續給藥31天a375細胞裸鼠成瘤模型裸鼠體重(單位：g)

表2-3連續給藥31天a549細胞裸鼠成瘤模型裸鼠體重(單位：g)

表3連續給藥31天裸鼠成瘤模型腫瘤重量(單位：mg)