本發明屬于醫藥合成技術領域，涉及一種利福霉素-異煙肼雜合藥物及其制備方法。

背景技術：

利福霉素是1975年由意大利lepetti公司等發現的，他們從法國土壤中分離的地中海鏈絲菌產生得到利福霉素類抗菌素，分為a,b,c,d,e五種類型，其中主要成分為b，后來又在產生菌種的發酵液中發現了利福霉素o,s,sv。利福霉素類抗生素具有廣譜抗菌作用，對結核桿菌、麻風桿菌、鏈球菌、肺炎球菌等革蘭氏陽性細菌，特別是耐藥性金黃利福霉素類抗生素色葡萄球菌的作用都很強。對某些革蘭氏陰性菌也有效，臨床多與其他抗結核病藥物合用治療各型結核病和治療耐藥金黃色葡萄球菌的嚴重感染，還用于治療麻風病。對細菌的作用主要為抑制細菌細胞rna聚合酶，作用于抑制的rna合成，它可進入細胞內起殺菌作用，對大型病毒有抑制作用。

美國的羅斯公司和施貴寶公司和西德的拜耳公司的研究人員分別獨立地發現了異煙肼有極強的抗結核菌的活性。異煙肼具有殺菌力強、選擇性高、副作用少的優點。它的滅菌特性在于：它可以抑制結核菌菌壁分枝菌酸成份的合成，從而使結核桿菌喪失多種能力(耐酸染色，增殖力，疏水性)而死亡，異煙肼還能與結核菌菌體輔酶結合，起到干擾脫氧核糖核酸和核糖核酸合成的作用，從而達到殺滅結核菌的目的。研究還發現異煙肼對代謝活力強的結核菌作用更強。異煙肼單用易產生耐藥性，合理聯合多種抗結核藥物治療結核病，可以提高療效，降低毒性，并可延緩甚至預防結核分支桿菌耐藥性的產生。

雜合藥物的研究方式是將兩種藥物的藥效結構單元拼接在一個分子中，或將兩者的藥效基團通過共價鍵兼容于一個分子中，使形成的藥物或兼具兩者的性質，分子中的兩類化學結構各自與不同的靶標結合，強化藥理作用，減少各自相應的毒副作用，或是兩者取長補短，發揮各自的藥理活性，協同完成治療作用。利福霉素-異煙肼雜合藥物可以同時作用于不同的受體，雜合藥物的活性更強，作用位點多，具有專一性，副作用較少，不易產生耐藥性，其開發前景廣闊。但一般雜合藥物制作方法較困難，后處理較復雜。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術中存在的上述不足，提供一種可用作抗生素的利福霉素-異煙肼雜合藥物。這種雜合物能提高對結核桿菌的活力抑制并減少或克服它的耐藥性，增強療效。

本發明的另外一個目的是提供利福霉素-異煙肼雜合藥物的制備方法。

為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案是：

提供一種利福霉素-異煙肼雜合藥物，它由以下方法制備得到：將利福霉素鈉酸化后與n,n-二羥甲基叔丁胺發生環和反應合成噁嗪利福霉素，然后將噁嗪利福霉素與哌嗪和異煙肼發生縮合反應，得到利福霉素-異煙肼雜合藥物。

本發明還提供上述利福霉素-異煙肼雜合藥物的制備方法，其具體步驟如下：

1)合成噁嗪利福霉素：將利福霉素鈉溶于溶劑中，得到利福霉素鈉溶液，加入濃硫酸對利福霉素鈉進行酸化，待溶液變為深紅色后升溫至35-50℃，緩慢滴加n,n-二羥甲基叔丁胺，滴加完畢后繼續環合反應，反應結束后冷卻至室溫，用冰乙酸水溶液析出沉淀物，將沉淀物過濾、水洗、干燥得到噁嗪利福霉素；

2)合成利福霉素-異煙肼雜合藥物：將步驟1)所得噁嗪利福霉素溶于無水乙醇得到噁嗪利福霉素溶液，然后向所述噁嗪利福霉素溶液中加入哌嗪和異煙肼，升溫至55-60℃進行縮合反應，反應結束后后處理得到福霉素-異煙肼雜合藥物。

按上述方案，步驟1)所述溶劑為n,n-二甲基甲酰胺；所述利福霉素鈉溶液濃度為0.02-0.08g/ml。

按上述方案，步驟1)所述濃硫酸濃度為95-98％，其中硫酸與利福霉素鈉摩爾比為1:2-4。

優選的是，步驟1)所述n,n-二羥甲基叔丁胺與利福霉素鈉質量比為0.2-0.4:1。

按上述方案，步驟2)所述噁嗪利福霉素溶液濃度為0.03-0.08g/ml。

按上述方案，步驟2)所述噁嗪利福霉素與哌嗪和異煙肼的質量比為20-30:2-4:1。

本發明還包括包含上述的利福霉素-異煙肼雜合藥物的藥物組合物。

以及上述利福霉素-異煙肼雜合藥物用于治療結核病的用途。

本發明制備利福霉素-異煙肼雜合抗結核藥物是以利福霉素鈉為原料，合成路線如下：

利福霉素類的母核結構為27個碳的大環內酰胺，環中含一個萘環，結構式如下：

萘環上由一脂肪鏈分別與c-2和c-12位碳相連接，構成“安莎橋”結構。由噁嗪利福霉素s-na鹽與n,n-二羥甲基叔丁胺在溶劑二甲基酰胺(dmf)中發生環合反應生成。作為中間體，噁嗪雜環要具有足夠的穩定性，才能經得起環上的加工，完成環合反應。利福霉素芳香族平面上，c-2和c-3位進行環合為六元環或五元環形成相應的安莎橋環稠合利福霉素衍生物。c-4上的羥基是不必要的，c-3及c-4位上基團的取代，有的能增強對細菌的抑制能力，有的能增強對病毒逆轉錄酶的抑制作用。萘環上的c-3位單取代和c-3/c-4位環合為雜環是利福霉素類化合物主要的修飾方法。c-3/c-4位可環合為五元或六元雜環，五元雜環可為噻唑環、咪唑環等，六元雜環可為吩嗪環、噁嗪環、噻嗪環和吡啶環等，其中咪唑環和噁嗪環衍生物活性較好。c-3,c-4位的同時取代，有望能達到提高對結核桿菌的活力抑制并減少或克服它的耐藥性，同時希望對革蘭氏陰性菌有較大的活性及在體內有極收好的效果。根據此發現，本申請人篩選出了目標化合物異煙肼對側鏈上的r1修飾后得到的雜合藥物。

本發明的有益效果在于：本發明實施例制備的利福霉素-異煙肼雜合藥物體外較穩定，不易分解且無生物活性，進入人體后通過人體相關酶的分解作用還原成原來的兩種活性藥物，在人體內分別發揮各自的藥理作用，可改善藥物的藥學和藥物動力學性質；同時雜合藥物本身具有較強的生物活性，具有與利福平相當的殺菌效果，在人體內不分解，整個分子進行多靶點調節。利福霉素-異煙肼雜合藥物可以同時作用于不同的受體，雜合藥物的活性更強，作用位點多，具有專一性，副作用較少，能提高對結核桿菌的活力抑制并減少或克服它的耐藥性，增強療效，其開發前景廣闊。

具體實施方式

為使本領域技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合實施例對本發明作進一步詳細描述。

實施例1

合成噁嗪利福霉素：在100ml三口瓶中裝入利福霉素鈉1.00g(0.0014mol),加入20mln,n-二甲基甲酰胺將其溶解，放入攪拌用的磁子，常溫下攪拌30分鐘，待充分溶解后，加入0.072g濃硫酸(95％)(0.0007mol)酸化，常溫下攪拌30分鐘，反應液由深藍色變成深紅色，然后升溫至35-50℃，緩緩滴加n,n-二羥甲基叔丁胺0.352g(0.0026mol)，滴畢后，反應液由深紅色變為深藍色，繼續保溫反應2小時(用薄層層析硅膠板跟蹤反應)，反應結束后冷卻至室溫，向反應液中加入滴加了2滴冰乙酸的水溶液200ml，間歇攪拌，有大量藍色沉淀析出，靜置過夜，過濾，適量水洗，干燥后即可得到藍色固體物質1.03g(0.0013mol)，即噁嗪利福霉素；

合成利福霉素-異煙肼雜合藥物：將步驟1)所得噁嗪利福霉素用20ml無水乙醇溶解，得到噁嗪利福霉素溶液，在100ml三口瓶中裝入噁嗪利福霉素溶液和0.13g(0.0015mol)哌嗪與0.039g異煙肼，升溫至55-60℃，反應液由深藍色變為紅棕色，保溫反應3小時，反應結束后(用薄層層析硅膠板跟蹤反應)，在旋轉蒸發儀中于45℃下將溶劑乙醇旋干，得到磚紅色固體物質，即利福霉素-異煙肼雜合藥物。

將本實施例制備的利福霉素-異煙肼雜合藥物在室溫、干燥避光條件下放置一個月，用紅外進行結構檢測，發現其結構沒有發生改變，說明其穩定性良好。

實施例2

測試實施例1所得利福霉素-異煙肼雜合藥物的性能：

活性測試

為了初步測定利福霉素-異煙肼雜合藥物是否具有抑菌活性，隨機選擇了7株臨床分離株標本及1株hr37v標準株，通過mic藥敏試驗來進行初步的測試，若具有抗菌活性則進行進一步的活性測試研究。

藥敏試驗的細菌：隨機抽出8株臨床分離株標本：13041820敏感株(s)，13040832耐藥r(r)，13040902耐藥hr(dr)，13041817耐藥hrs(mdr)，13040946耐藥hrs(mdr)，13042311耐藥hresofx(xdr)，13062939全耐藥hreskmpaspto(ntm)，13070223全耐藥hreskmpaspto(ntm)及hr37v標準株。

培養條件:在無菌96孔板中每孔加7h9培養基100μl，在玻璃磨菌器底部加入2滴10％tween-80生理鹽水及臨床分離的2～3周菌齡的新鮮培養物，研磨至呈乳酪樣，用生理鹽水稀釋成1號麥氏比濁管的濁度(1mg/ml)，用7h9培養基1:20倍稀釋后1～12孔每孔接種100μl菌液，用無菌膜封板，放入濕盒內，置于37℃溫箱中培養5d，第6天加入過濾除菌0.1g/l刃天青顯色液30μl，繼續溫育24h后觀察結果。

儀器設備：電子天平(精度0.1mg)，容量瓶，移液管，玻璃燒杯，電熱恒溫培養箱(dnp-9082bs-ⅲ)，無菌96孔版，20-200排槍及一次性無菌耗材等。

試驗藥劑：95％高效液相色譜純的實施例1制備的利福霉素-異煙肼雜合藥物和購買的含量98％的利福平(鄭州民眾制藥廠，含量>98％)。

對照藥劑：用不含抗結核藥原液的7h9培養基作空白對照。

其他試劑：國藥集團化學試劑有限公司分析純級的dmso，10％tween-80生理鹽水，無菌去離子水。

劑量設置：分別稱取利福霉素-異煙肼雜合藥物和利福平原藥50mg，用dmso溶解后，在50ml的容量瓶用dmso定容，配成1mg/ml濃度的藥液。

試驗方法：

把利福霉素-異煙肼雜合藥物和利福平原藥配好的1mg/ml濃度的藥液，滅菌后，用無菌膜密封起來備用。

顯色法mic測定：

(1)在無菌96孔板(1～12孔)中每孔加7h9培養基100μl，第1孔加適當稀釋的抗結核藥原液100μl，對倍連續稀釋至第12孔。各孔藥物最終濃度:利福平128～0.06μg/ml，利福霉素-異煙肼雜合藥物128～0.06μg/ml。

(2)在玻璃磨菌器底部加入2滴10％tween-80生理鹽水及臨床分離的2～3周菌齡的新鮮培養物，研磨至呈乳酪樣，用生理鹽水稀釋成1號麥氏比濁管的濁度(1mg/ml)，用7h9培養基1:20倍稀釋后1～8孔每孔接種100μl。空白孔為培養基對照。

(3)用無菌膜封板，放入濕盒內，37℃培養5d，第6天加入過濾除菌0.1g/l刃天青顯色液30μl至第12孔，繼續溫育24h，如空白孔(未加藥物)變成粉紅色，則加同量刃天青顯色液至其他各孔，24h后記錄顏色變化。如空白孔仍為藍色，分別在第7、9天觀察。顏色從藍色變為粉色即預示細菌生長。

試驗結果分析：

以不加抗結核藥原液的培養基為對照組，隨著時間推移，觀察培養基的顯色情況，培養基的顯色情況反映了不同種結核桿菌的生長情況，進一步說明了藥物對結核桿菌的抑菌活性。

上述實驗經10天培養后觀察出現如下表1所示的結果：

表1

表格中共選擇了8個菌株作為樣本。從a～k作128～0.06μg/ml12個濃度對倍稀釋，1為利福霉素-異煙肼雜合藥物64μg/ml，2為利福平64μg/ml，r為耐藥，s為敏感，l空白對照為7h9培養基。

由表1中數據顯示，對于本次實驗選取的七種臨床菌株和一種標準菌株，實施例1制備的利福霉素-異煙肼雜合藥物取得了與利福平相當的殺菌效果。并且其具備雜合藥物的優勢，能夠實現多靶點給藥，可以同時作用于不同的受體、或作用于一個受體的不同結合位點、或作用于兩個不同的酶、一個酶和一個受體等?？傊?，雜合藥物活性更強，作用位點多，具有專一性，副作用較少，不易產生耐藥性等特點。