本發明屬于生物工程領域，特別涉及一種生物合成的納米尺度吡咯結構紅色素的粒徑調控方法。
技術背景
近年來，隨著環境問題、能源問題的出現，以及一部分合成色素對人體的致癌性和其他毒害作用的日益顯現，人們對色素的綠色環保、安全性以及可持續性的要求越來越高。天然色素以安全性高，具有良好的環境相容性、生物降解性和可持續性而受到廣泛關注，成為研究熱點。其中微生物色素的生產具有不受季節、氣候和地域限制，生產周期短，條件易于控制，產量大，種類豐富等優點，被開發利用的潛力巨大，同時保護了環境和生態平衡，解決了資源短缺的矛盾，具有可持續開發利用的優勢。
吡咯結構色素是生物合成色素中的重要種類，是微生物的次生代謝產物，可由細菌、放線菌和霉菌獲得。其中，具有3吡咯環的紅色色素研究較多，該色素易溶于甲醇、乙醇、丙酮、dmf、乙酸乙酯、氯仿和苯，幾乎不溶于水。該色素主要分布在細胞內，色素的提取需要進行細胞破碎。由于此色素水溶性很低，色素提取要使用有機溶劑。
許多種類的微生物色素都有水溶性低的問題，而且許多色素都存在于菌體內部。如何在不使用有機溶劑的情況下制備具有良好加工性能的色素分散液，是微生物胞內色素在應用時亟待解決的問題。同時，色素分散液的穩定性也至關重要，這決定了其可以存放的時間和使用期限。而色素顆粒的粒徑大小是決定色素分散液穩定性的最主要影響因素。如何實現對分散液中色素顆粒大小的調控，從而增加其分散穩定性，同樣值得研究。
本研究通過對微生物菌株的改造和培養過程的改進，實現了生物合成吡咯結構紅色色素的粒徑調控，獲得了納米粒徑的吡咯結構紅色色素，并實現了由細胞分泌進入發酵液中納米色素在發酵液中的均勻分散，由此獲得由納米色素顆粒形成的穩定分散液。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種通過改變發酵條件實現對納米尺度吡咯結構紅色素的粒徑調控方法。
本發明所述的一種生物合成的納米尺度吡咯結構紅色素的粒徑調控方法，包括：
(1)將粘質沙雷氏菌在平板培養基上劃線，選擇顏色最紅的單菌落挑出，接入發酵培養基中培養至對數生長期，移取5ml菌液至直徑為9cm的培養皿中，功率為15w的紫外線燈管距離30cm照射5～20min，避光保存8-24h后，轉移至發酵培養基中培養至對數生長期。然后再轉接到選擇培養基中培養24h后測λ＝540nm的吸光度值，然后以10％的接種量轉接到新的選擇培養基中培養24h后測λ＝540nm的吸光度值，再轉接至新的選擇培養基中，直至吸光度不再增加。分別取菌液0.1ml涂布10個平板，選擇顏色最紅的單菌落挑出，接入發酵培養基中培養至對數生長期，加入氯化鋰使其濃度為0.1～1.5％，保溫0.5～10min，取菌液5ml轉移至發酵培養基中培養至對數生長期，然后再轉接到選擇培養基中培養24h后測λ＝540nm的吸光度值，然后以10％的接種量轉接到新的選擇培養基中培養24h后測λ＝540nm的吸光度值，再轉接至新的選擇培養基中，直至吸光度不再增加。分別取菌液0.1ml涂布10個平板，選擇顏色最紅的單菌落挑出，作為改造完成的高產工程菌株。
(2)將高產菌株接入種子培養液中培養，溫度30℃，搖床轉速120～200rpm，培養時間6～24h。
(3)將種子培養液接入含有非離子表面活性劑體系a的改良的發酵培養基中進行發酵培養，培養48～144h后將發酵液在10000rpm，10℃下離心10min，去除菌體，得納米尺度吡咯結構紅色素懸浮液。
步驟(2)所述的種子培養液中，1l培養基中含有如下成分：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉3g，氯化鉀2g，ph5.0～7.0。
步驟(3)所述的改良的發酵培養基中，1l培養基中含有如下成分：蛋白胨15g，丙三醇3g，硫酸鎂2g，氯化鈉3g，氯化鉀2g，ph5.0～8.0。
步驟(3)所述的培養條件為：培養溫度25～28℃，搖床轉速150～250rpm，時間48～144h，避光培養。
步驟(3)所述的表面活性劑體系a的組成為0～40g/l的吐溫-80，0～40g/l的蔗糖脂肪酸酯和0～40g/l的脂肪醇聚氧乙烯醚。
經本發明制得的納米尺度吡咯結構紅色素懸浮液，具有良好的穩定性，經高速離心色素不沉降，放置一個月底部幾乎無色素沉降。吡咯結構紅色素的平均粒徑可在150～800nm之間進行控制。且該發明可應用于其他非水溶性微生物色素，通過微生物發酵的方法直接生產納米色素懸浮液。
本發明的優點及有益效果是：
(1)本發明的納米尺度吡咯結構紅色素懸浮液的生物制備方法簡單，直接由微生物發酵制得，無需使用有機溶劑從菌體內部提取色素，更不需要一般分散液的復雜制備過程，對設備的要求低，綠色環保。
(2)本發明對色素粒徑的調控方法簡單，只需改變發酵液成分和發酵條件即可實現對納米色素粒徑的調控。
具體實施方式
針對本發明一種生物合成的納米尺度吡咯結構紅色素的粒徑調控方法，采用下列方式具體實施。但本發明所述的實施方式不限于此。
實施例1
平均粒徑為253.8nm的吡咯結構紅色素懸浮液的制備。
將高產粘質沙雷氏菌菌株接入種子培養液中培養，溫度30℃，搖床轉速160rpm，培養時間15h。然后將種子液按照2.0％接種至改良的發酵培養基(蛋白胨15g/l，甘油3g/l，吐溫-8018g/l，硫酸鎂2g/l，氯化鈉3g/l，氯化鉀2g/l)中進行發酵培養84h，溫度28℃，搖床轉速200rpm。然后將發酵液在10000rpm，10℃下離心10min，去除菌體，得平均粒徑為253.8nm的納米吡咯結構紅色素懸浮液。
實施例2
平均粒徑為402.6nm的吡咯結構紅色素懸浮液的制備。
將高產粘質沙雷氏菌菌株接入種子培養液中培養，溫度30℃，搖床轉速160rpm，培養時問20h。然后將種子液按照2.0％接種至改良的發酵培養基(蛋白胨15g/l，甘油3g/l，吐溫-8010g/l，硫酸鎂2g/l，氯化鈉3g/l，氯化鉀2g/l)中進行發酵培養72h，溫度28℃，搖床轉速200rpm。然后將發酵液在10000rpm，10℃下離心10min，去除菌體，得平均粒徑為402.6nm的納米吡咯結構紅色素懸浮液。